番茄OSCA 家族成員的敲除突變體構(gòu)建及抗旱性研究

摘 要：干旱是陸地植物面臨的嚴重非生物脅迫之一，干旱環(huán)境會造成植物水分缺失從而產(chǎn)生高滲脅迫，OSCA1 是植物中第一個被鑒定的滲透感受器，OSCA 基因在不同物種中廣泛存在。植物對干旱脅迫的感受和響應(yīng)對其生長發(fā)育至關(guān)重要，番茄作為經(jīng)濟作物和模式植物在蔬菜研究中具有重要作用，番茄抗旱性研究是保障蔬菜產(chǎn)量的重要途徑，因此，研究番茄SlOSCA 基因家族在番茄應(yīng)對干旱脅迫過程中的生理功能方面具有重要意義。本研究以反向遺傳學為基礎(chǔ)，通過SlOSCA 基因家族在葉片中的表達量分析，選定SlOSCA1.1/1.2/1.6/2.3/3.1 共5 個基因作為番茄抗旱研究的目標基因，利用CRISPR/Cas9 定點基因編輯技術(shù)構(gòu)建番茄slosca 突變體，以探索番茄SlOSCA 蛋白家族成員在番茄響應(yīng)滲透脅迫過程中的作用。研究結(jié)果顯示，番茄slosca3.1/1.1 突變體在細胞水平對滲透脅迫的響應(yīng)減弱，SlOSCA3.1/1.1 參與了番茄保衛(wèi)細胞對滲透脅迫的響應(yīng)過程；番茄slosca1.6/1.2/2.3 突變體整株水平對滲透脅迫的響應(yīng)能力減弱，SlOSCA1.6/1.2/2.3 參與了番茄對PEG 滲透脅迫以及土壤干旱脅迫的響應(yīng)過程，再次證明OSCA 蛋白家族成員之間存在功能冗余。本研究通過構(gòu)建slosca 突變體，研究slosca 突變體的生理表型，揭示SlOSCA 蛋白家族成員協(xié)調(diào)作用于番茄抗旱過程，為后續(xù)解析OSCA 基因家族成員在不同脅迫條件和不同生理過程中的生物學功能提供參考。

關(guān)鍵詞：OSCA 基因家族；干旱脅迫；基因編輯；番茄

中圖分類號：S641.2 文獻標志碼：A

植物作為固著生物，整個生長發(fā)育周期需要應(yīng)對持續(xù)變化的環(huán)境。環(huán)境中常見的非生物脅迫包括干旱、高溫、低溫、澇害以及高鹽和重金屬等。干旱環(huán)境會對植物造成滲透脅迫，影響植物地理分布并限制農(nóng)業(yè)作物生長發(fā)育[1-2]。為了減少干旱脅迫引起的損害，植物進化出了不同的抵抗機制[3]。

植物應(yīng)對滲透脅迫的信號傳導途徑包括脅迫感知、信號傳導和對脅迫做出應(yīng)答3 個階段[4-6]。首先，植物通過細胞膜上特定的受體感受器感知滲透脅迫。植物感知到滲透脅迫后，胞外Ca2+快速通過鈣離子通道進入細胞內(nèi)，引起胞內(nèi)Ca2+濃度的變化[1]。胞漿內(nèi)Ca2+濃度變化引發(fā)植物滲透脅迫信號級聯(lián)反應(yīng)，從而導致植物體內(nèi)活性氧和脫落酸的積累[7]。最后，這些脅迫產(chǎn)生的物質(zhì)有助于調(diào)節(jié)植物適應(yīng)不利環(huán)境。迄今為止，植物遭受滲透脅迫時的信號傳導過程已被深入研究，滲透脅迫響應(yīng)途徑主要包含ABA 依賴和非ABA 依賴[8]，但植物感知滲透脅迫的分子機制尚不清晰。

在擬南芥中，OSCA1 是一種高滲門控鈣離子通道，定位在細胞質(zhì)膜上第一個被發(fā)現(xiàn)的植物滲透感受器，其功能缺失的osca1 突變體表現(xiàn)為高滲條件下對Ca2+的調(diào)節(jié)能力減弱，從而導致植株根系生長減少和葉片蒸騰作用下降[7]。擬南芥中OSCA1 包含15 個OSCA 家族成員，AtOSCA1.2和AtOSCA1.1 具有高同源性，是滲透誘導激活的鈣離子通道蛋白[9]；AtOSCA1.3 和AtOSCA1.7 的作用已在病原體相關(guān)分子模式（PAMP）觸發(fā)的氣孔免疫中確立[10-11]；AtOSCA2.1 和AtOSCA2.2 屬于低滲傳感器[12]。OSCA1 作為第一個報道的滲透感受器，已在多種植物中鑒定出OSCA 基因，如秈稻和短梗稻（11 個基因）、光稃稻（12 個基因）、梨（16 個基因）、綠豆（13 個基因）、玉米（12個基因）、陸地棉（35 個基因）、植物棉（21 個基因）和瑞蒙棉（22 個基因）等[13-18]。研究表明OSCA 基因家族在植物不同物種的發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用，如玉米12 個OSCA 成員中的ZmOSCA4.1 對干旱脅迫有反應(yīng)[16]，但是只有少數(shù)的OSCA 家族成員的功能得到驗證。此外，目前還沒有關(guān)于番茄OSCA 家族成員生理功能的研究。

番茄是一種重要的經(jīng)濟作物，其生長發(fā)育過程易受滲透脅迫影響，導致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，研究番茄如何響應(yīng)滲透脅迫具有重要意義。OSCA 在植物響應(yīng)逆境脅迫的信號通路中發(fā)揮著重要作用，且OSCA 蛋白家族成員之間存在功能冗余。通過番茄多基因敲除手段，可以較大程度降低SlOSCA 功能類似蛋白成員共同發(fā)揮的生理作用。為了探索番茄SlOSCA 家族成員是否響應(yīng)滲透脅迫，本研究通過預測番茄SlOSCA 在葉片中的表達量，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)設(shè)計番茄SlOSCA3.1/1.1/1.6/1.2/2.3 多基因敲除，并通過對突變體進行細胞水平和整株水平的滲透脅迫處理，驗證番茄葉片表達的SlOSCA3.1/1.1 和SlOSCA1.6/1.2/2.3 基因是否參與番茄對滲透脅迫的響應(yīng)過程。本研究為后續(xù)深入研究番茄SlOSCA家族的生物學功能奠定基礎(chǔ)，為通過基因工程和分子育種提高番茄抗旱性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本研究所用野生型番茄AilsaCraig（AC）由湖南農(nóng)業(yè)大學熊程老師課題組提供，本實驗室繁殖育種。番茄植株在光照16 h/黑暗8 h，白天26 ℃/夜間18 ℃，相對濕度50%～60%的人工控溫生長室中生長。

1.1.2 菌株、載體及試劑耗材

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、KOD 高保真酶等購自諾唯贊生物科技股份有限公司；PGR 菌液、pTX041 載體質(zhì)粒和Gate8 質(zhì)粒由湖南農(nóng)業(yè)大學熊程老師實驗室提供；BsaⅠ和T4 DNA ligase 等購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；山梨醇、MES、CaCl2、KCl、C4H11NO3、PEG 6000、Trizma、蔗糖和瓊脂等購自默克生命科學股份有限公司；MS 鹽、84 消毒液、IBA、玉米素、卡那霉素、特美汀、肌醇、鹽酸硫胺素、2，4-D、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等購自國產(chǎn)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 番茄OSCA基因家族的生物信息學分析

在植物膜蛋白數(shù)據(jù)庫（ https：//aramemnon.botanik.uni-koeln.de/index.ep）的擬南芥OSCA 基因家族成員與不同物種的OSCA 基因家族聚類結(jié)果中分析獲得番茄OSCA 家族基因。下載番茄OSCA 蛋白序列和擬南芥OSCA 蛋白序列，使用MEGA 軟件進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用AI 軟件進行顏色標注。通過https：//bar.utoronto.ca/eplant_tomato/網(wǎng)站預測番茄OSCA 家族基因在不同組織部位的表達量，分析SlOSCA 在Heinz 和M82 兩個番茄品種葉片中的表達量以及葉片表達量與不同組織總量的比值，選擇葉片表達量高及其與總量比值高的基因作為進一步的研究對象。

1.2.2 SlOSCA基因CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9 構(gòu)建雙基因敲除（SlOSCA3.1/1.1）和3 基因敲除（SlOSCA1.6/1.2/2.3）突變體。在http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/網(wǎng)站上以中靶率大于50%，脫靶率小于50%為篩選條件在外顯子區(qū)域選擇SlOSCA 基因的靶位點，每個目標基因選擇2 個靶位點。參照XIE 等[19]多基因編輯的方法， 合成雙基因敲除和三基因敲除sgRNA-tRNA 表達盒。通過Golden-Gate 組裝法將sgRNA-tRNA 表達盒組裝到CRISPR/Cas9 二元載體pTX041 上[20]。將敲除載體轉(zhuǎn)入GV3101 農(nóng)桿菌后轉(zhuǎn)化AC 番茄愈傷組織，待轉(zhuǎn)基因番茄出芽后用卡那霉素進行生根篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.3 SlOSCA 基因敲除陽性植株的鑒定

從轉(zhuǎn)基因植株中剪取新鮮葉片，提取基因組DNA。根據(jù)靶序列位置設(shè)計特異性引物，以葉片DNA 為模板進行PCR 擴增，Sanger 測序鑒定靶點位置基因是否被編輯，靶點被編輯的植株為陽性植株T1。T2 和T3 代植株使用上述方法鑒定靶點突變類型，并使用特異性引物Cas9-F 和Cas9-R 進行PCR 擴增，對照組以野生型DNA 為模板，將其PCR 產(chǎn)物進行核酸電泳，篩選出不含Cas9 基因的純合突變體植株。

1.2.4 保衛(wèi)細胞滲透脅迫處理及生理表型分析

待番茄幼苗長有4～6 片真葉時，取幼苗自下而上的第2～4 片葉片，撕取該葉片表皮置于含有氣孔打開溶液（100 μmol/L CaCl2， 5 mmol/L KCl， 10 mmol/LMES-Tris， pH 6.15）的微孔室中，于250 μmol/（m2·s）強光照下孵育2.5 h，待葉表皮上的氣孔完全打開，使用蔡司倒置熒光顯微鏡拍攝表皮光學圖像。在微孔室中加入250 mmol/L 山梨醇溶液處理葉片表皮3 min，使用蔡司倒置熒光顯微鏡拍攝處理后的表皮光學圖像。使用Image J 軟件測量表皮光學圖像中氣孔的寬度。

1.2.5 PEG 滲透脅迫處理及生理表型分析

待番茄幼苗在底部有孔的塑料盆中長至4 片真葉時，將地下部分浸入40%（W/V）PEG-6000 的溶液中，處理1 h。拍攝植物PEG 處理前和處理1 h 的照片用于進一步的圖像分析，使用Image J 軟件測量植株的葉面積和植株莖稈向下傾斜的角度。

1.2.6 干旱脅迫處理及生理表型分析

待番茄幼苗長有4～6 片真葉時，將番茄幼苗分為實驗組和對照組進行干旱脅迫實驗。干旱脅迫處理前實驗組和對照組澆水至土壤含水量的50%～55%，用土壤水分儀測量土壤含水量。進行干旱脅迫處理時，對照組每天上午9：00 澆水至土壤含水量的50%～55%，實驗組不澆水。干旱脅迫處理發(fā)生12 d 后，取實驗組和對照組植株自下而上面積相似的葉片，稱量并記錄鮮重（FW），再將葉片置于5 mmol/LCaCl2 溶液中，轉(zhuǎn)入黑暗下孵育8 h，稱量膨脹葉片的重量（TW），最后置于70 ℃烘箱干燥48 h稱量干重（DW）。根據(jù)公式RWC=（FW–DW）/（TW–DW）×100%進行葉片相對含水量的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 OSCA 家族系統(tǒng)進化樹分析

利用植物膜蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//aramemnon.botanik.uni-koeln.de/index.ep）篩選番茄OSCA 離子通道膜蛋白家族，Cluster 結(jié)果顯示番茄的同源OSCA 蛋白家族包含12 個成員（圖1），將SlOSCA基因分別命名為SlOSCA1.1-1.6、SlOSCA2.1-2.4、SlOSCA3.1 和SlOSCA4.1。番茄和擬南芥OSCA基因家族進化樹分析結(jié)果如圖2 所示，OSCA 基因家族成員可分為4 個亞族，番茄OSCA 基因家族在4 個亞族均有分布。

2.2 SlOSCA 基因表達分析

通過植物生物學BAR 數(shù)據(jù)庫（https：//bar.utoronto.ca/eplant_tomato/）預測番茄SlOSCA 基因家族在番茄不同組織部位的表達量，葉片是植物整個生長周期中應(yīng)對干旱脅迫的重要組織部位?；虮磉_量高、低與其發(fā)揮功能之間不是線性關(guān)系，但是基因時空表達水平是其發(fā)揮生理作用功能的前提。關(guān)于番茄SlOSCA 基因家族參與番茄響應(yīng)干旱脅迫過程的研究，在選定目標研究基因時，優(yōu)先選擇表達量較高的SlOSCA 基因家族成員是常規(guī)方法，而隨機選擇基因或選擇表達量較低的基因都是不恰當?shù)摹?/p>

SlOSCA 基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示，SlOSCA1.1、SlOSCA1.6、SlOSCA2.3 和SlOSCA3.1 在番茄品種Heinz 和M82 葉片中的表達量均較高（圖3）。另外，把SlOSCA 基因在葉片中的表達量與該基因在不同組織中總表達量的比值定義為葉片相對表達量，SlOSCA1.1 和SlOSCA1.2 在番茄Heinz 品種和番茄M82 品種葉片中的相對表達量均較高（圖4）。因此，選擇SlOSCA1.1、SlOSCA1.2、SlOSCA1.6、SlOSCA2.3 和SlOSCA3.1 作為目標基因以探索番茄SlOSCA 家族成員在番茄抗旱反應(yīng)中的作用機理。

2.3 SlOSCA 基因敲除載體構(gòu)建

根據(jù)番茄SlOSCA 基因家族表達量分析結(jié)果，選定SlOSCA1.1、SlOSCA1.2、SlOSCA1.6、SlOSCA2.3 和SlOSCA3.1 作為目標研究基因，研究SlOSCA 蛋白家族參與番茄抗旱響應(yīng)過程。反向遺傳學的研究過程是通過基因工程手段創(chuàng)造突變體，以突變體表現(xiàn)出來的生理表型來解析基因的功能，CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)常用于反向遺傳學研究中。AtOSCA1.1 作為高滲感受器在植物早期響應(yīng)滲透脅迫的鈣信號傳導過程中占主要作用，但是植物在干旱脅迫下的生長調(diào)控過程是復雜的，為了避免OSCA 蛋白家族的功能冗余問題，在利用5 個番茄SlOSCA 目標研究基因構(gòu)建單基因敲除突變體（5 個）、雙基因敲除突變體（10種組合）、三基因敲除突變體（10 種組合）、四基因敲除突變體（5 種組合）以及五基因敲除突變體的眾多選擇中，優(yōu)先設(shè)計構(gòu)建多基因敲除突變體以作為番茄SlOSCA 蛋白家族抗旱生理功能研究的開端。通過番茄SlOSCA 多基因敲除手段，可以較大程度降低SlOSCA 功能類似蛋白成員共同發(fā)揮的生理作用，有利于敲除突變體表現(xiàn)出較好的生理表型。

擬南芥AtOSCA1.1[7]和AtOSCA3.1[21]是已知的直接參與植物應(yīng)對干旱脅迫的響應(yīng)因子，因此設(shè)計番茄SlOSCA1.1/3.1 雙基因敲除，把余下的3個目標基因設(shè)計SlOSCA1.2/1.6/2.3 多基因敲除，以開啟SlOSCA 家族成員參與番茄抗旱生理過程的研究。通過網(wǎng)站（ http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）設(shè)計基因編輯靶點，根據(jù)SlOSCA3.1、SlOSCA1.1、SlOSCA1.6、SlOSCA1.2 和SlOSCA2.3基因序列信息，在每個目標基因的外顯子區(qū)域設(shè)計2 個Target 基因編輯靶點以提高基因編輯效率，成功構(gòu)建SlOSCA3.1/1.1 雙基因敲除表達載體和SlOSCA1.6/1.2/2.3 多基因敲除表達載體（圖5）。

2.4 番茄SLOSCA 基因敲除突變體鑒定

將SlOSCA3.1/1.1 雙基因敲除表達載體和SlOSCA1.6/1.2/2.3 多基因敲除表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，把包含表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到番茄愈傷組織中，待轉(zhuǎn)基因番茄出芽后，用Kana 抗生素進行陽性苗篩選，共獲得30 株SlOSCA3.1/1.1 番茄轉(zhuǎn)基因植株和56 株SlOSCA1.6/1.2/2.3 番茄轉(zhuǎn)基因植株。利用CTAB 法提取番茄轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA，PCR 擴增包含基因編輯靶點在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因番茄基因序列，將PCR 產(chǎn)物進行測序，以檢測靶點基因序列是否被成功編輯。

把包含基因編輯靶點在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因番茄基因序列與對應(yīng)的野生型番茄SlOSCA 基因序列進行比對分析，成功獲得16 株slosca3.1/1.1 突變植株和24 株slosca1.6/1.2/2.3 突變植株，所獲得突變植株均為雜合子，SlOSCA3.1/1.1 雙基因敲除載體和SlOSCA1.6/1.2/2.3 多基因敲除載體的基因編輯效率分別是53%和42%。部分突變植株的基因編輯情況如圖6 所示，slosca3.1/1.1 番茄突變植株（圖6A）和slosca1.6/1.2/2.3 番茄突變植株（圖6B）中存在堿基突變、缺失和插入，且存在大片段堿基缺失和插入情況。

通過繁殖番茄雜合子突變植株，在發(fā)生分離的后代中驗證獲得slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 純合子突變植株。為了避免后續(xù)繁殖過程中，番茄純合子突變植株中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)發(fā)生額外的基因編輯事件，利用Cas9-F/Cas9-R 引物PCR 擴增檢測slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 純合子突變株系中是否包含Cas9 基因，篩選出不包含Cas9基因的純合子突變植株（圖6C）， 以開展番茄slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 突變植株的生理表型研究。

2.5 番茄slosca3.1/1.1 突變體在滲透脅迫下的生理特性研究

植物作為固著生物，整個生長周期需要應(yīng)對持續(xù)的環(huán)境變化，其中高滲脅迫會導致植物氣孔閉合以及光合作用降低，從而影響生長發(fā)育。使用250 mmol/L 山梨醇（sorbitol）溶液對番茄葉片表皮進行高滲脅迫處理，在高滲脅迫處理后野生型（WT）和slosca3.1/1.1 突變體的氣孔均出現(xiàn)閉合情況（圖7A）。正常條件下，slosca3.1/1.1 突變體氣孔與野生型氣孔的開度不存在差異；高滲脅迫處理條件下，slosca3.1/1.1 突變體氣孔比野生型氣孔的開度大，存在顯著差異（圖7B）。結(jié)果表明，番茄slosca3.1/1.1 突變體對滲透脅迫的響應(yīng)減弱，SlOSCA3.1/1.1 參與了番茄對滲透脅迫的響應(yīng)過程。

2.6 番茄slosca1.6/1.2/2.3 突變體在滲透、干旱脅迫下的生理特性研究

使用40%（W/V）PEG-6000 溶液對番茄植株的地下部分進行滲透脅迫處理，在PEG 處理1 h后野生型（WT）和slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株均出現(xiàn)葉片失水、莖稈傾斜等萎蔫情況，番茄slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株的萎蔫程度較野生型更加明顯（圖8A）。正常條件下，slosca1.6/ 1.2/2.3突變體與野生型的葉面積不存在差異；在PEG 滲透脅迫處理條件下，slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株失水速率快致使其葉面積明顯小于野生型（圖8B）。在滲透脅迫下，植物缺少水分導致細胞膨壓降低，植物株型呈萎縮狀。用番茄植株主莖干偏離重力方向的傾斜角度作為植物萎蔫的指標，將植物萎蔫程度數(shù)據(jù)化， 正常條件下，slosca1.6/1.2/2.3 突變體與野生型主莖干的傾斜角度不存在差異；在PEG 滲透脅迫處理條件下，slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株主莖干的傾斜角度明顯大于野生型（圖8C），表明slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株萎蔫程度更嚴重。

對番茄整株水平進行干旱脅迫處理，在干旱處理12 d 后野生型（WT）和slosca1.6/1.2/2.3 突變體植株均出現(xiàn)萎蔫情況（圖9A）。正常條件下，slosca1.6/1.2/2.3 突變體與野生型的葉片含水量不存在差異；在干旱脅迫處理下，slosca1.6/1.2/2.3突變體與野生型的葉片含水量均降低， 其中slosca1.6/1.2/2.3 突變體的葉片含水量顯著低于野生型，說明slosca1.6/1.2/2.3 突變體的水分控制能力更差（圖9B）。

綜上表明，番茄slosca1.6/1.2/2.3 突變體對滲透脅迫的響應(yīng)能力減弱，SlOSCA1.6/1.2/2.3 參與了番茄對滲透脅迫的響應(yīng)過程。

3 討論

番茄是廣泛栽培的蔬菜作物和模式作物，在研究蔬菜品質(zhì)和生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本研究以反向遺傳學為基礎(chǔ)，通過基因編輯技術(shù)，成功獲得番茄slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 多基因敲除突變體。對番茄突變體進行細胞水平或整株水平的滲透脅迫處理，發(fā)現(xiàn)SlOSCA3.1/1.1 和SlOSCA1.6/1.2/2.3 參與番茄對滲透脅迫的響應(yīng)過程，表明OSCA 蛋白家族成員在番茄抗旱過程中發(fā)揮著重要作用。

OSCA1 是植物中第一個被鑒定的滲透感受器，擬南芥AtOSCA 家族成員可分為4 個亞族，植物膜蛋白數(shù)據(jù)庫信息顯示番茄SlOSCA 家族包含12 個成員，系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示SlOSCA 家族同樣可分為4 個亞族，表明OSCA 家族在遺傳上具有保守性。已有研究表明， AtOSCA1.1 和AtOSCA1.2 參與高滲脅迫信號傳導[7， 9] ，AtOSCA1.3 是干旱脅迫的早期響應(yīng)因子[10]，說明OSCA 家族成員之間存在功能冗余。為了較大程度降低SlOSCA 功能類似蛋白成員共同發(fā)揮的生理作用， 本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 多基因敲除突變體，獲得了多種突變類型的突變體，不僅有簡單的堿基缺失、插入和替換的突變體，而且有大片段缺失和插入的突變體。在敲除突變體獲得的過程中，發(fā)現(xiàn)多靶點敲除載體可以提高目的基因被編輯的效率，雖然SlOSCA3.1/1.1 敲除載體的靶點2 編輯效率較低以及SlOSCA1.6/1.2/2.3 敲除載體的靶點5 完全脫靶，但在其他靶點的加持下成功獲得了目的研究基因的敲除突變體，且目標基因2 個靶點相距近的獲得了大片段缺失的突變體。

OSCA 基因家族在多個物種中均有研究，但只有少數(shù)植物的OSCA 基因在功能上得到驗證。LIU 等[1] 在大豆基因組中鑒定出20 個大豆GmOSCA 家族成員，異源表達GmOSCA 家族成員進行生物學功能研究，發(fā)現(xiàn)GmOSCA1.1、GmOSCA1.2 、GmOSCA1.3 、GmOSCA1.4 、GmOSCA1.5 可能為大豆中的鈣滲透傳感器，過表達GmOSCA1.1-1.5、GmOSCA3.1 和GmOSCA3.2增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性。玉米ZmOSCA 家族基因跨膜結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化分析表明，12 個成員分為4 個亞族且都包含DUF221 結(jié)構(gòu)域，對12個家族成員進行PEG、ABA 和NaCl 處理，大部分基因響應(yīng)滲透脅迫， 在擬南芥中過表達ZmOSCA2.4 基因，擬南芥抗旱性顯著提高且與抗旱相關(guān)基因的表達水平顯著上升[22]。OsOSCA1.1介導水稻根系中的高滲脅迫和鹽脅迫誘導的細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度增加，響應(yīng)高滲脅迫和鹽脅迫[21]。上述研究表明，OSCA 作為滲透敏感鈣離子通道蛋白，在植物應(yīng)對滲透脅迫過程中發(fā)揮的功能是保守的。

番茄作為重要的經(jīng)濟蔬菜作物，品質(zhì)和產(chǎn)量易受到干旱脅迫影響。葉片是植物應(yīng)對干旱脅迫最重要的組織部位，干旱脅迫發(fā)生時植物通過調(diào)整葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)來減少水分散失，從而降低機械損傷，并提高水分利用率和增強耐旱能力[23-24]。在本研究中，通過對slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3突變體進行滲透脅迫處理發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，slosca3.1/1.1 植株氣孔關(guān)閉程度減弱，slosca1.6/1.2/2.3 植株表現(xiàn)出葉面積減小，萎蔫程度更加嚴重，葉片相對含水量更低；slosca3.1/1.1和slosca1.6/1.2/2.3 突變體對滲透脅迫的響應(yīng)能力減弱，表明番茄SlOSCA3.1/1.1 和SlOSCA1.6/1.2/2.3 基因在番茄干旱脅迫應(yīng)答中起著重要作用。為了更全面地闡明番茄葉片表達的SlOSCA 基因在番茄滲透脅迫中的生物學功能，本課題組后續(xù)將會從雜合子敲除突變體發(fā)生分離的后代中篩選slosca1.1 、slosca1.2 、slosca1.6 、slosca2.3 和slosca3.1 單基因敲除突變體以及slosca1.6/1.2、slosca1.6/2.3 和slosca1.2/2.3 雙基因敲除突變體，并對其進行保衛(wèi)細胞滲透脅迫處理、PEG 滲透脅迫處理以及干旱脅迫處理，用slosca3.1/1.1 和slosca1.6/1.2/2.3 突變體對滲透敏感的表型作為參照，研究SlOSCA1.1/1.2/1.6/2.3/3.1 在番茄抗旱過程中發(fā)揮作用功能的強弱。

本研究通過構(gòu)建番茄slosca 突變體，研究SlOSCA蛋白在番茄響應(yīng)滲透脅迫過程中的功能，證明SlOSCA 蛋白家族成員在番茄抗旱中發(fā)揮重要作用，有助于推進OSCA 基因家族成員在其他蔬菜作物和農(nóng)作物抗逆生理過程中的功能研究。

參考文獻

[1] LIU C G， WANG H， ZHANG Y， CHENG H J， HU Z L， PEIZ M， LI Q. Systematic characterization of the OSCA familynembers in soybean and validation of their functions in osmoticstress[J]. International Journal of Molecular Sciences，2022， 23（18）： 10570.

[2] ZHU J K. Abiotic stress signaling and responses in plants[J].Cell， 2016， 167（2）： 313-324.

[3] ZHANG H M， ZHU J H， GONG Z Z， ZHU J K. Abioticstress responses in plants[J]. Nature Reviews Genetics， 2022，23（2）： 104-119.

[4] HUANG G T， MA S L， BAI L P， ZHANG L， MA H， JIA P，LIU J， ZHONG M， GUO Z F. Signal transduction duringcold， salt， and drought stresses in plants[J]. Molecular BiologyReports， 2012， 39（2）： 969-987.

[5] ZELM V E， ZHANG Y X， TESTERINK C. Salt tolerancemechanisms of plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2020， 71（1）： 403-433.

[6] ZHU J K. Salt and drought stress signal transduction inplants[J]. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53（1）：247-273.

[7] YUAN F， YANG H M， XUE Y， KONG D D， YE R， LI C J，ZHANG J Y， THEPRUNGSIRIKUL L， SHRIFT T，KRICHILSKY B， JOHNSON D M， SWIFT G B， HE Y K，SIEDOW J N， PEI Z M. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing inArabidopsis[J]. Nature， 2014， 514（7522）： 367-371.

[8] YOSHIDA T， MOGAMI J， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K.ABA-dependent and ABA-independent signaling in responseto osmotic stress in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2014， 21： 133-139.

[9] HOU C C， TIAN W， KLEIST T， HE K， GARCIA V， BAI FL， HAO Y L， LUAN S， LI L G. DUF221 proteins are a familyof osmosensitive calcium-permeable cation channelsconserved across eukaryotes[J]. Cell Research， 2014， 24（5）：632-635.

[10] THOR K， JIANG S S， MICHARD E， GEORGE J，SCHERZER S， HUANG S G， DINDAS J， DERBYSHIRE P，LEITAO N， DEFALCO T A， K?STER P， HUNTER K，KIMURA S， GRONNIER J， STRANSFELD L， KADOTA Y，BüCHERL C A， CHARPENTIER M， WRZACZEK M，MACLEAN D， OLDROYD G E D， MENKE F L H，ROELFSEMA M R G， HEDRICH R， FEIJó J， ZIPFEL C.The calcium-permeable channel OSCA1.3 regulates plantstomatal immunity[J]. Nature， 2020， 585（7826）： 569-573.

[11] YOSHIOKA K， MOEDER W. Calcium channel in plantshelps shut the door on intruders[J]. Nature， 2020， 585（7826）：507-508.

[12] PEI S Y， TAO Q， LI W K， QI G N， WANG B R， WANG Y，DAI S W， SHEN Q J， WANG X， WU X M， XU S J，THEPRUNGSIRIKUL L， ZHANG J Y， LIANG L， LIU Y T，CHEN K A， SHEN Y， CRAWFORD B M， CHENG M J，ZHANG Q， WANG Y Q， LIU H L， YANG B G，KRICHILSKY B， PEI J S C， SONG K R， JOHNSON D M，JIANG Z H， WU F H， SWIFT G B， YANG H H， LIU Z H，ZOU X X， VO-DINH T， LIU F， PEI Z M， YUAN F. Osmosensor-mediated control of Ca2+ spiking in pollen germination[J]. Nature， 2024， 629（8014）： 1118-1125.

[13] LI Y S， YUAN F， WEN Z H， LI Y H， WANG F， ZHU T，ZHUO W Q， JIN X， WANG Y D， ZHAO H P， PEI Z M，HAN S C. Genome-wide survey and expression analysis ofthe OSCA gene family in rice[J]. BMC Plant Biology， 2015，15（1）： 261.

[14] GU X Y， WANG P， LIU Z， WANG L， HUANG Z， ZHANGS L， WU J Y. Genome-wide identification and expressionanalysis of the OSCA gene family in Pyrus bretschneideri[J].Canadian Journal of Plant Science， 2018， 98（4）： 918-929.

[15] YIN L L， ZHANG M L， WU R G， CHEN X L， LIU F， XINGB L. Genome-wide analysis of OSCA gene family membersin Vigna radiata and their involvement in the osmotic response[J]. BMC Plant Biology， 2021， 21（1）： 408.

[16] DING S C， FENG X， DU H W， WANG H W. Genome-wideanalysis of maize OSCA family members and their involvementin drought stress[J]. Peerj， 2019， 7： e6765.

[17] YANG X， XU Y C， YANG F F， MAGWANGA R O， CAI XY， WANG X X， WANG Y H， HOU Y Q， WANG K B， LIUF， ZHOU Z L. Genome-wide identification of OSCA genefamily and their potential function in the regulation of dehydrationand salt stress in Gossypium hirsutum[J]. Journal ofCotton Research， 2019， 2（2）： 87-104.

[18] ZENG H Q， ZHAO B Q， WU H C， ZHU Y Y， CHEN H T.Comprehensive in silico characterization and expression profilingof nine gene families associated with calcium transportin soybean[J]. Agronomy， 2020， 10（10）： 1359.

[19] XIE K B， MINKENBERG B， YANG Y N. BoostingCRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenoustRNA-processing system[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2015， 112（11）： 3570-3575.

[20] DENG L， WANG H， SUN C L， LI Q， JIANG H L， DU M M，LI C B， LI C Y. Efficient generation of pink-fruited tomatoesusing CRISPR/Cas9 system[J]. Journal of Genetics and Genomics，2018， 45（1）： 51-54.

[21] HAN Y， WANG Y X， ZHAI Y J， WEN Z H， LIU J， XI C，ZHAO H P， WANG Y D， HAN S C. OsOSCA1.1 mediateshyperosmolality and salt stress sensing in Oryza sativa[J].Biology， 2022， 11（5）： 678.

[22] CAO L R， ZHANG P Y， LU X M， WANG G R， WANG Z H，ZHANG Q J， ZHANG X， WEI X， MEI F J， WEI L， WANGT C. Systematic analysis of the Maize OSCA genes revealingZmOSCA family members involved in osmotic stress andZmOSCA2.4 confers enhanced drought tolerance in transgenicArabidopsis[J]. International Journal of MolecularSciences， 2020， 21（1）： 351.

[23] 董曉民， 劉偉， 李桂祥， 楊波， 張安寧. 干旱脅迫下兩個扁桃品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2018（12）： 54-57.

DONG X M， LIU W， LI G X， YANG B， ZHANG A N.Drought resistance analysis of two almond spieces[J].Heilongjiang Agricultural Sciences， 2018（12）： 54-57. （inChinese）

[24] LI S， HAMANI A K M， ZHANG Y Y， LIANG Y P， GAO Y，DUAN A W. Coordination of leaf hydraulic， anatomical， andeconomical traits in tomato seedlings acclimation tolong-term drought[J]. BMC Plant Biology， 2021， 21（1）： 536.

基金項目 國家“十四五”重點研發(fā)計劃項目（No. 2023YFF1001200）。