早花相關(guān)基因HbFT1 和HbFT2 轉(zhuǎn)化橡膠樹的研究

摘 要：植物的開花誘導(dǎo)受內(nèi)源和環(huán)境信號(hào)關(guān)鍵調(diào)控因子的嚴(yán)格控制，一般分為6 條主要途徑，其中Flowering Locus T（FT）作為PEBP 家族的重要成員在不同途徑中起著關(guān)鍵作用。橡膠樹中有2 個(gè)FT 基因，異位過表達(dá)擬南芥和煙草均可促進(jìn)早花，通過對一年中不同月份的葉片定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)基因的表達(dá)并不相同，其中HbFT2 可能是候選基因。本研究通過體細(xì)胞胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法將35S：：HbFT1 和35S：：HbFT2 轉(zhuǎn)到橡膠樹中，分別獲得2 個(gè)和3 個(gè)陽性胚，并通過GUS 染色鑒定為陽性。當(dāng)代再生植株或經(jīng)次生體胚發(fā)生擴(kuò)繁后再生的植株通過芽接的方式擴(kuò)繁，獲得HbFT1和HbFT2 的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株，分別有4 株和7 株，但是田間定植7 a 仍未見開花。將定植后的轉(zhuǎn)基因植株取葉片進(jìn)行PCR 檢測和GUS 染色確定其均為陽性植株。對HbFT1、HbFT2 和抑制開花基因HbTFL1/CEN 的qRT-PCR 表達(dá)分析表明，35S：：HbFT1 過表達(dá)陽性植株中HbFT1 的表達(dá)均顯著高于野生型對照，HbFT2 基因的表達(dá)相對較低；而35S：：HbFT2 過表達(dá)陽性植株中HbFT2 的表達(dá)僅有2 株顯著高于對照，其他5 株均與對照無差異，HbFT1 基因的表達(dá)也相對較低；35S：：HbFT1 過表達(dá)陽性植株中HbFT1 的表達(dá)雖然均比對照顯著提高，但有一陽性胚芽接獲得的后代間差異顯著，而且35S：：HbFT2 過表達(dá)陽性植株2 個(gè)陽性胚芽接獲得的后代間的差異也顯著，推測和胚狀體轉(zhuǎn)化的嵌合性有關(guān)。而對抑制開花基因的表達(dá)分析顯示，部分抑制開花基因均顯著高于FT 基因的表達(dá)，推測未實(shí)現(xiàn)早花表型的原因可能是因?yàn)橐种崎_花基因的高表達(dá)所致，且在橡膠樹中也同樣存在FT/TFL 的平衡調(diào)控。

關(guān)鍵詞：早花；巴西橡膠樹；HbFT1；HbFT2；qRT-PCR；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

天然橡膠是重要的工業(yè)原料，主要產(chǎn)自巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）[1]，其經(jīng)濟(jì)生命周期為30～35 a[2]。與許多木本樹種一樣，橡膠樹在開始開花之前有一個(gè)5～6 a 的幼年期（未成熟期），需要28 a 以上的時(shí)間來繁殖和選擇一個(gè)新的無性系用于天然橡膠的商業(yè)生產(chǎn)[1， 3]，未成熟期是影響短時(shí)間內(nèi)培育新橡膠樹的一個(gè)嚴(yán)重的制約因素，橡膠樹開花調(diào)控途徑的研究對提高育種效率至關(guān)重要。

植物的生長和發(fā)育，特別是開花的誘導(dǎo)，受內(nèi)源和環(huán)境信號(hào)關(guān)鍵調(diào)控因子的嚴(yán)格控制，一般分為光周期途徑、溫度途徑、春化途徑、年齡途徑、赤霉素途徑和自主途徑等6 條主要途徑[4-5]。這些途徑并不是孤立存在的，而是通過各種信號(hào)途徑最終調(diào)控整合FLOWERING LOCUS T（FT）、LEAFY（LFY）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSIONOF CONSTANS 1（SOC1）等基因?qū)崿F(xiàn)成花轉(zhuǎn)變的調(diào)控[6-7]。FT 基因是PEBP 家族成員之一，作為成花素，在光周期調(diào)控途徑中，長日照條件下，受CONSTANS（CO）正調(diào)控的FT 蛋白從葉片運(yùn)輸?shù)角o端分生組織，與FLOWERING LOCUSD（FD）形成FT-FD 復(fù)合物，從而促進(jìn)植物開花[8]。TFL1 是和FT 序列相似、功能相反的植物開花調(diào)控基因[9]，通過抑制莖端分生組織形成花原基，延遲植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，在植物體內(nèi)，通過FT 和TFL1 兩個(gè)開花相關(guān)蛋白的平衡調(diào)控而誘導(dǎo)開花[10]。

FT 基因在大多數(shù)植物體內(nèi)具有保守的功能，F(xiàn)T 超表達(dá)能促進(jìn)水稻、煙草、野甘菊和龍膽草等短日照植物、擬南芥等長日照植物和番茄等中性植物提早開花，而且能使柑橘、毛果楊、蘋果、獼猴桃、藍(lán)莓和小桐子等多年生植物提早開花[11-12]。但是FT 同源物同樣存在抑制開花的情況[13-18]，如向日葵、甜菜、煙草、龍眼、大豆和甘蔗。

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹中2 個(gè)FT的同源基因HbFT1 和HbFT2 轉(zhuǎn)化擬南芥后均有早花的表型，轉(zhuǎn)化煙草和同為大戟科的小桐子也有早花的表型（結(jié)果未發(fā)表），對橡膠樹一年中不同月份的表達(dá)分析初步確定HbFT2 可能是橡膠樹FT 的候選基因[19]。因此，本研究將這2 個(gè)基因的超表達(dá)載體均進(jìn)行橡膠樹的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了陽性胚，對陽性胚進(jìn)行編號(hào)，如正常胚則直接出苗，畸形胚則通過次生體胚發(fā)生進(jìn)行再次體胚發(fā)生，將再次體胚發(fā)生獲得的正常胚進(jìn)行植株再生，并通過芽接的方式對陽性植株擴(kuò)繁轉(zhuǎn)基因陽性植株，通過對其進(jìn)行表型觀察、轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證及目的基因表達(dá)分析，對橡膠樹開花調(diào)控基因FT 的功能進(jìn)一步分析，并為橡膠樹轉(zhuǎn)基因研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的轉(zhuǎn)基因外植體材料為熱研87-6-62 的體細(xì)胞胚，2014 年通過轉(zhuǎn)化體細(xì)胞胚的方法[20]侵染體細(xì)胞胚，分別獲得HbFT1 陽性胚狀體2 個(gè)，HbFT2 陽性胚狀體3 個(gè)，并通過GUS 染色鑒定為陽性，當(dāng)代再生植株或經(jīng)次生體胚發(fā)生擴(kuò)繁后再生的植株通過芽接的方式擴(kuò)繁獲得HbFT1 和HbFT2 的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株分別有4 株和7株，于2017 年9 月定植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州五隊(duì)隔離網(wǎng)室，具體的陽性植株情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 陽性植株P(guān)CR 鑒定

選擇HbFT1 和HbFT2 轉(zhuǎn)基因陽性植株淡綠期的葉片，DNA 提取方法詳見天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒（DP320），采用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測DNA 樣品的濃度和完整性。根據(jù)HbFT1 和HbFT2 的CDS 區(qū)設(shè)計(jì)基因的特異引物（表2），設(shè)計(jì)GUS 和Npt 基因引物（表2），采用PCR 鑒定陽性植株，PCR 擴(kuò)增的酶使用TOLOBIO 的2×Magic Green Taq SuperMix（21502），PCR 反應(yīng)體系為：2 μL DNA 模板，引物各0.3 μL（10 μmol/L），7.5 μL 2×Magic GreenTaq SuperMix，4.9 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，引物58 ℃復(fù)性10 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。每次PCR 反應(yīng)過程中，分別以ddH2O 做空白對照（CK），未經(jīng)轉(zhuǎn)化的橡膠樹葉片基因組DNA 為陰性對照（CK?），含有目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒為陽性對照（CK+）。

1.2.2 陽性植株GUS 染色分析

利用Biosharp的GUS 染色劑試劑盒（BL622A）進(jìn)行GUS 染色。將配置好的X-gluc 溶液和緩沖液按照比例混合配成GUS 染色工作液，取每個(gè)單株的適量葉片置于1.5 mL 的離心管中，加入配制好的GUS 染色工作液，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜，棄染色液，并加入濃度為75%的酒精洗脫葉片的顏色，直至變成白色或者淺黃色，拍照觀察。

1.2.3 qRT-PCR 分析

對上述轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，分析促進(jìn)開花和抑制開花基因在不同陽性植株的表達(dá)模式。根據(jù)橡膠樹早花基因HbFT1、HbFT2 和抑制開花基因HbTFL1、HbTFL2、HbTFL3、HbCEN1、HbCEN2 的基因組序列，設(shè)計(jì)特異RT-qPCR 引物（表3）。利用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（DP441）提取樣品總RNA。采用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測RNA 樣品的濃度和完整性。利用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ TransScript? One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板，以HbYLS8 為內(nèi)參基因，利用2×Q3 SYBR qPCRMaster Mix（Universal）（22204，TOLOBIO）進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序按照說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2?ΔΔCt 法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)HbFT1 和HbFT2 陽性植株的PCR 鑒定

利用3 對PCR 特異引物對上述的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1 所示，在空白對照（CK）、陰性對照（CK?）中均未擴(kuò)增出相應(yīng)片段大小的產(chǎn)物，而在陽性對照（CK+）和全部陽性單株中均能擴(kuò)增出符合目標(biāo)基因的片段大小，帶型清晰。結(jié)果表明，所有的HbFT1 和HbFT2 陽性植株檢測結(jié)果均為陽性。

2.2 轉(zhuǎn)HbFT1 和HbFT2 陽性植株的GUS 染色分析

葉片GUS 染色過夜并脫色后的結(jié)果如圖2 所示，GUS 染色在葉片的邊緣處居多，并且全部葉片邊緣處都有深藍(lán)色，而非轉(zhuǎn)基因植株的葉片無染色。結(jié)果表明，GUS 基因在這些葉片中均有表達(dá)，這與PCR 檢測的結(jié)果一致，證明這些轉(zhuǎn)化植株確實(shí)為陽性植株。

2.3 HbFT1 和HbFT2 在超表達(dá)陽性植株中的qRT-PCR 分析

為進(jìn)一步解析超表達(dá)橡膠樹中HbFT1 和HbFT2 的基因表達(dá)情況，對橡膠樹HbFT1 和HbFT2的超表達(dá)植株進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果如圖3 所示，HbFT1 基因在超表達(dá)植株（Ft2014604-2 、Ft2014604-3、Ft2014557-2、Ft2014557-3）的表達(dá)量均顯著高于野生型對照熱研8 7 - 6 - 6 2 ， 且Ft2014557-2 和Ft2014557-3 不同芽接樹間的表達(dá)量也差異顯著； 而HbFT2 基因在超表達(dá)植株2014D187-2、2014D276-2 中的表達(dá)量顯著高于野生型對照熱研87-6-62，其他超表達(dá)植株與野生型的表達(dá)相當(dāng)或者不及野生型的表達(dá)，不同芽接樹間的表達(dá)差異較大，尤其是在2014D276 胚和2014D187胚之間的差異達(dá)到顯著水平。目前轉(zhuǎn)基因陽性植株均已定植7 a，但獲得的所有提早開花基因超表達(dá)植株均未提前開花。

2.4 抑制開花基因在超表達(dá)陽性植株中的qRTPCR分析

橡膠樹中也存在抑制開花基因HbTFL1、HbTFL2、HbTFL3、HbCEN1 和HbCEN2[21]，為更好地解析提早開花超表達(dá)植株未得到早花表型的原因，本研究同時(shí)在這些植株中進(jìn)行抑制開花基因的表達(dá)分析。選擇HbFT1 和HbFT2 超表達(dá)植株進(jìn)行抑制開花基因的表達(dá)分析，結(jié)果如圖4 所示，在HbFT1 超表達(dá)植株中，抑制開花的基因的表達(dá)絕大多數(shù)高于促進(jìn)開花基因的表達(dá)，其中在Ft2014557-2 中，抑制開花基因HbCEN2 和HbTFL1 的表達(dá)較高，均高于野生型及HbFT1 的表達(dá)。而芽接擴(kuò)繁的另一株Ft2014557-3 中，HbTFL1 和HbTFL2 的表達(dá)較高，也均高于野生型和HbFT1 的表達(dá)，但兩株間表達(dá)有所差異。在Ft2014604-2 和Ft2014604-3 中，抑制開花基因HbCEN2、HbTFL1、HbTFL2 的表達(dá)均高于野生型及HbFT1 的表達(dá)。在HbFT2 超表達(dá)植株中，抑制開花的基因的表達(dá)同樣顯著高于促進(jìn)開花的基因表達(dá)（圖5），表達(dá)不盡相同。在2014D214-1中，抑制開花的基因HbCEN2、HbTFL1 和HbTFL2顯著高于野生型和HbFT2 的表達(dá)；而在芽接擴(kuò)繁的另一株2014D214-3 中， HbCEN2 和HbTFL1的表達(dá)顯著高于野生型和HbFT2 的表達(dá)，但HbTFL2 的表達(dá)與野生型無差異。在2014D276-2中，除HbCEN1 的表達(dá)沒有野生型高之外，其他抑制開花的基因的表達(dá)均顯著高于野生型和HbFT2 基因的表達(dá)；而在芽接擴(kuò)繁的另一株2014D276-3 中，只有HbTFL1、HbTFL2 和HbTFL3顯著高于野生型和HbFT2 基因的表達(dá)。在2014D187-1 中，HbTFL1 和HbTFL2 的表達(dá)顯著高于野生型和HbFT2 基因的表達(dá)；而在芽接擴(kuò)繁的另外兩株2014D187-2 和2014D187-3 中，只有HbTFL1 的基因表達(dá)顯著高于野生型和HbFT2 基因的表達(dá)。

3 討論

3.1 橡膠樹體胚遺傳轉(zhuǎn)化的嵌合型導(dǎo)致芽接樹之間的表達(dá)量差異較大

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)能有效減少嵌合體植物產(chǎn)生的再生體系，因?yàn)檎T導(dǎo)產(chǎn)生胚胎的是單個(gè)細(xì)胞[22]。在橡膠樹的次生體胚發(fā)生中體細(xì)胞胚形成的石蠟切片觀察研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹次生體胚屬于直接體胚發(fā)生途徑，具有以體胚子葉表皮層中的胚性原始細(xì)胞的單細(xì)胞起源及子葉內(nèi)部的多細(xì)胞起源2 種起源方式[23-24]，而且顯微鏡下瞬時(shí)GUS 表達(dá)分析證實(shí)，表皮細(xì)胞和表皮下細(xì)胞均存在農(nóng)桿菌的侵染[20]。理論上講，單細(xì)胞起源方式的體細(xì)胞胚胎發(fā)生應(yīng)該可以得到遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，并且還可以有效地避免嵌合體的出現(xiàn)，但是橡膠樹次生體胚的產(chǎn)生是單細(xì)胞起源和多細(xì)胞起源2 種方式均存在。本研究獲得的不同芽接樹之間基因的表達(dá)量差異較大，而不同芽接樹均來自于同一個(gè)陽性體細(xì)胞胚。HbFT2 的表達(dá)結(jié)果顯示，7 株轉(zhuǎn)基因材料中僅有2 株HbFT2 的表達(dá)高于野生型，其他5 株均與野生型持平，而與這2 株分別來自同一個(gè)陽性胚的另外的芽接苗與其表達(dá)差異大。HbFT1 的表達(dá)結(jié)果也類似，雖然2個(gè)株系的2 個(gè)植株的表達(dá)均高于野生型，但是其中1個(gè)陽性胚芽接產(chǎn)生的2 個(gè)單株間的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著的差異。因此推測造成株系間表達(dá)差異大的原因是和陽性體細(xì)胞胚為嵌合體有關(guān)，UDAYABHANU 等[24]也提出嵌合現(xiàn)象需要在進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中得到證實(shí)。關(guān)于轉(zhuǎn)基因嵌合體現(xiàn)象，一般有以下幾種解釋機(jī)制，如轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合產(chǎn)生的芽，轉(zhuǎn)基因的短暫表達(dá)或轉(zhuǎn)基因的丟失。嵌合體經(jīng)常存在于初代轉(zhuǎn)基因植物中，對于楊樹等多年生木本喬木，獲得純合子也相對比較困難，也需要經(jīng)過二次再生獲得較高頻率的純合子[25]。而在最新的橡膠樹基因編輯的研究中也發(fā)現(xiàn)，超過90%的第0 代轉(zhuǎn)化胚胎是嵌合的，因此，從T0 陽性胚胎中再生轉(zhuǎn)基因植株不合適。在T1 代純合子胚的比例顯著提高到接近50%[26]。針對以橡膠樹體細(xì)胞胚為外植體獲得初代陽性胚存在嵌合體的問題，筆者認(rèn)為可以通過3 個(gè)方面加以改進(jìn)：一是繼續(xù)將初代陽性胚次生體胚發(fā)生增殖到第二代或者第三代，再進(jìn)行出胚及出苗；二是在轉(zhuǎn)基因篩選過程中，選擇可視化或者熒光顯微鏡可以很好地觀察陽性胚的報(bào)告基因，如RUBY、DsRed或RFP 等進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，將有指示標(biāo)記的胚塊或者胚進(jìn)行后續(xù)繼代實(shí)驗(yàn)；三是進(jìn)一步研究橡膠樹體細(xì)胞胚次生體胚發(fā)生過程中的細(xì)胞起源模式，從源頭上避免嵌合體的產(chǎn)生。這些措施可以在將來的轉(zhuǎn)基因過程中減少嵌合體的產(chǎn)生。

3.2 拮抗基因的平衡調(diào)控決定表型性狀

拮抗基因是一對序列相似但功能相反的調(diào)控基因，最早承認(rèn)SFT/SP 影響植株形態(tài)和產(chǎn)量是從番茄SP 基因?qū)τ诒硇偷挠绊慬27-28]。如PARK 等[29]利用人工EMS 誘變sp 番茄，獲得弱功能的SP 和SFT 突變基因，然后使雜合的SP 和SFT 基因達(dá)到一定的平衡狀態(tài)，提高花序密度的同時(shí)，提高了營養(yǎng)生長能力，植株變得更加茂盛，最終提高了番茄單株的產(chǎn)量；棉花的GhSFT 和GhSP 基因產(chǎn)物的有目的的操作為增強(qiáng)有限花序的形狀和在區(qū)域特異性環(huán)境下改變棉花的農(nóng)耕帶來希望[30]。在大豆中，功能性拮抗基因GmFT4 和GmFT2a/5a的平衡決定了大豆的開花時(shí)間[17]，F(xiàn)T 和TFL1 通過競爭共同的下游FD 與14-3-3 等蛋白形成的復(fù)合體實(shí)現(xiàn)植物開花控制[31-34]。FT/TFL1 平衡關(guān)系或劑量效應(yīng)與植株形態(tài)建成具有顯著相關(guān)性，即FT/TFL1 表達(dá)比值決定了開花時(shí)間的長短與形態(tài)建成[12， 35]。一般橡膠樹在定植3～4 a 即可開花，而本研究中轉(zhuǎn)化早花基因在定植7 a 也未得到早花表型，推測可能是由于橡膠樹抑制開花基因的高表達(dá)所致。qRT-PCR 分析結(jié)果顯示HbTFL1 在所有超表達(dá)促進(jìn)開花基因的植株中均顯著高于野生型與對應(yīng)的超表達(dá)基因，推測該基因可能與抑制開花相關(guān)，因超表達(dá)促進(jìn)開花的基因后，打破了FT/TFL1 的平衡關(guān)系，抑制開花的基因表達(dá)也上調(diào)，而且超過促進(jìn)開花基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致超表達(dá)促進(jìn)開花基因的橡膠樹并未提前開花。本研究認(rèn)為，在橡膠樹這種基因組復(fù)雜的物種中，多拷貝基因經(jīng)常存在，橡膠樹轉(zhuǎn)基因研究需要獲得較大群體觀察表型才具有可靠性，另外通過對拮抗基因的RNAi 來改變劑量效應(yīng)，以期獲得需要的表型。

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基金項(xiàng)目 海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 322RC783）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（No. 1630022024025，No.1630022022001）。