胸腺素β10基因在甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展中的作用機(jī)制

【摘要】 目的 研究胸腺素β10基因（TMSB10）促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌（PTC）進(jìn)展的機(jī)制。方法 使用基因表達(dá)譜交互分析平臺(tái)（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析PTC中的高表達(dá)基因及其在不同的T、N分期中的表達(dá)情況。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)TMSB10在人類甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞系Nthy-ori 3-1細(xì)胞與人PTC細(xì)胞系細(xì)胞（BCPAP、TPC-1、KTC-1、BHT101）中的基因表達(dá)差異，蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組TMSB10蛋白的表達(dá)差異。用293T細(xì)胞構(gòu)建短發(fā)夾（sh）序列sh-TMSB10-NC、sh-TMSB10-1、sh-TMSB10-2病毒載體，并轉(zhuǎn)染至TPC-1和BCPAP細(xì)胞敲低TMSB10基因表達(dá)水平，并通過qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，Transwell法測(cè)定細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示TMSB10在PTC中的高表達(dá)，且在不同的T、N分期中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P lt; 0.05）。與Nthy-ori 3-1細(xì)胞相比，TMSB10在PTC細(xì)胞系中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P lt; 0.05）。與sh-TMSB10-nc組相比，sh-TMSB10-1、sh-TMSB10-2組細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯下降（P lt; 0.05）。結(jié)論 TMSB10在PTC中高表達(dá)，提高了PTC的增殖與侵襲能力，促進(jìn)PTC的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 胸腺素β10基因；甲狀腺乳頭狀癌；侵襲；增殖；作用機(jī)制

Mechanism of thymosin β10 gene in the progression of papillary thyroid carcinoma

MENG Jianxin， JIN Yikuan， LI Yating， ZHOU Xumin， LIAO Fangyu， YAO Fan ， LI Qiang

（Department of Thyroid Surgery， Zhujiang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510260， China）

Corresponding author： LI Qiang， E-mail： 1647182267@qq.com； YAO Fan， E-mail： yaof_1995@163.com

【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of thymosin β10 gene （TMSB10） promoting the progression of papillary thyroid carcinoma （PTC）. Methods The Gene Expression Profiling Interactive Analysis （GEPIA） database was used to analyze highly expressed genes in PTC and their expression levels across different T and N stages. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was employed to detect the differential expression of TMSB10 in the human thyroid follicular epithelial cell line Nthy-ori 3-1 and PTC cell lines （BCPAP， TPC-1， KTC-1， BHT101）. Western blot was used to measure the expression differences of TMSB10 protein in each group." Short hairpin （sh） RNA sequences （sh-TMSB10-NC， sh-TMSB10-1， sh-TMSB10-2 vectors） were constructed in 293T cells and transfected into TPC-1 and BCPAP cells to knock down TMSB10 expression， which was validated by qRT-PCR. Cell proliferation was assessed using the Cell Counting Kit-8 （CCK-8） assay， and cell invasion ability was measured using the Transwell assay. Results GEPIA database analysis revealed that TMSB10 was highly expressed in PTC， with statistically significant differences across different T and N stages （all P lt; 0.05）. Compared to Nthy-ori 3-1 cells， TMSB10 was highly expressed in PTC cell lines， with statistically significant differences （all P lt; 0.05）. The proliferation and invasion abilities of the sh-TMSB10-1 and sh-TMSB10-2 groups were significantly reduced compared to the sh-TMSB10-nc group （P lt; 0.05）. Conclusions TMSB10 is highly expressed in PTC， which enhances the proliferation and invasion abilities of PTC cells， promoting its progression.

【Key words】 Thymosin β10 gene； Papillary thyroid carcinoma； Invasion； Proliferation； Mechanism

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，隨著彩色多普勒超聲（彩超）、CT、分子病理等診斷技術(shù)的發(fā)展，甲狀腺癌的檢出率逐漸上升，尤其在女性人群中不斷攀升［1-2］。據(jù)全國(guó)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，甲狀腺癌發(fā)病率在城市地區(qū)女性惡性腫瘤中位居第4位，并以每年20%的速度持續(xù)增長(zhǎng)［3］。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是臨床最為常見的病理類型，約占全部甲狀腺癌的85%～

90%［3-4］，其特點(diǎn)是容易在早期出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］。PTC的治療以手術(shù)為主，尤其是對(duì)于早期病例［6-7］。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)性病例，靶向治療和免疫治療已展示出良好的應(yīng)用前景［8-9］。深入了解PTC 的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，積極尋找并鑒定PTC的新型標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)于鑒別高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者和指導(dǎo)PTC的治療決策具有重要的臨床意義。胸腺素β10（thymosin β10，Tβ10）由Tβ10基因（TMSB10）編碼，位于人染色體2q37，定位于細(xì)胞質(zhì)中，Tβ10由43個(gè)氨基酸組成，有75%的序列與胸腺素同源［10］，在脾臟、肝臟、胸腺等組織廣泛存在，最重要的細(xì)胞功能是參與細(xì)胞骨架的組織，結(jié)合并隔離肌動(dòng)蛋白單體從而抑制肌動(dòng)蛋白聚合，影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［11］。同時(shí)，它也參與了細(xì)胞增殖凋亡、血管生成等過程［12-14］。研究顯示，TMSB1受 miR-184負(fù)調(diào)控，從而影響PTC的細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［15］。Zhang等［16］發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中TMSB10高表達(dá)與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。此外，TMSB10在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用［17-25］。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，Tβ10通過多種途徑參與腫瘤的進(jìn)展。目前TMSB10 在甲狀腺癌中的相關(guān)研究知之甚少，其在PTC 中發(fā)揮的作用仍待探索。本研究應(yīng)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)，分析在甲狀腺癌中隨著T分期及N分期進(jìn)展下TMSB10的表達(dá)變化，并結(jié)合體外細(xì)胞試驗(yàn)探索TMSB10對(duì)PTC細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為甲狀腺癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

使用基因表達(dá)譜交互分析平臺(tái)（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA中多種腫瘤進(jìn)行分析，觀察PTC中的高表達(dá)基因及其在不同的T、N分期中的表達(dá)情況。THCA數(shù)據(jù)集中納入的患者病理類型均為PTC，使用KM Plotter工具對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，

1.2 材 料

人甲狀腺正常細(xì)胞Nthy-ori 3-1與人PTC細(xì)胞系（BCPAP、TPC-1、KTC-1、BHT101）均由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）均購(gòu)自廣州永津生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；BD Biocoat Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；二喹啉甲酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司；兔抗TMSB10抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 方 法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

Nthy-ori 3-1、人PTC細(xì)胞系、人胚腎細(xì)胞293T用含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育。用293T細(xì)胞構(gòu)建短發(fā)夾（shot hairpin， sh）序列sh-TMSB10-NC、sh-TMSB10-1、sh-TMSB10-2病毒載體，并轉(zhuǎn)染至TPC-1和BCPAP細(xì)胞。

1.3.2 TMSB10 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）法：分別從Nthy-ori3-1和PTC細(xì)胞系細(xì)胞中分離總RNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA模板轉(zhuǎn)錄為模板DNA，使用SYBR Green熒光染料進(jìn)行檢測(cè)，并以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置：初始預(yù)變性95 ℃ 5 min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸2 min，最后在72 ℃進(jìn)行10 min的終延伸。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行mRNA相對(duì)定量分析。

1.3.3 TMSB10 蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

采用RIPA裂解緩沖液分別處理Nthy-ori 3-1和人PTC細(xì)胞系細(xì)胞，應(yīng)用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量分析。隨后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)總蛋白進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。為降低非特異性結(jié)合，使用5%脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉處理，將PVDF膜與一抗在4 ℃條件下孵育12 h，其中一抗包括兔源TMSB10抗體（1∶1 000稀釋）和GAPDH抗體（1∶10 000稀釋）；隨后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋）在37 ℃條件下反應(yīng)1 h。利用化學(xué)發(fā)光法顯像，應(yīng)用ImageJ對(duì)蛋白免疫印跡法條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

分別培養(yǎng)TPC-1、BCPAP中的sh-TMSB10-NC組、sh-TMSB10-1組、sh-TMSB10-2組細(xì)胞。細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀下計(jì)數(shù)各組細(xì)胞（1×103個(gè)）并平鋪于96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，加入CCK-8試劑2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，以評(píng)估細(xì)胞增殖能力。測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（第0～5天）的吸光度值，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)開始前12 h更換無(wú)血清培養(yǎng)基。使用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀將各組細(xì)胞密度調(diào)整為5×104/孔，接種于預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室（用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境）。實(shí)驗(yàn)體系中，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，下室則加入含有20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，使用4%多聚甲醛固定30 min，隨后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。最后，在倒置光學(xué)顯微鏡（200倍視野）下觀察并采集圖像。使用ImageJ對(duì)Transwell實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 10錄入數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。雙側(cè)P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TMSB10在PTC中高表達(dá)，并與不良預(yù)后、臨床病理特征相關(guān)

對(duì)TCGA中多種腫瘤數(shù)據(jù)的分析顯示，TMSB10 在大部分常見的腫瘤包括甲狀腺癌中均處于明顯高表達(dá)狀態(tài)（圖1A、B），并與臨床病理特征相關(guān)（圖1C、D）。THCA數(shù)據(jù)集中收納的患者病理類型均為PTC，使用KM Plotter工具對(duì)TCGA中THCA數(shù)據(jù)集分析，結(jié)果顯示高表達(dá)TMSB10的PTC患者總生存時(shí)間下降（P lt; 0.001），無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間也下降（P = 0.018），見圖1E、F。

2.2 TMSB10在PTC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)

與Nthy-ori3-1相比，TMSB10的mRNA和蛋白水平在PTC細(xì)胞系中上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P lt; 0.05），見圖2。

2.3 TMSB10促進(jìn)PTC細(xì)胞系增殖與侵襲

慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)敲低TPC-1、BCPAP這2種PTC細(xì)胞系中的TMSB10基因，并通過qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，見圖3A。在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，使用shRNA抑制TMSB10基因表達(dá)后，與sh-TMSB10-NC組相比，sh-TMSB10組的細(xì)胞增殖速率明顯減緩（均P lt; 0.05），見表2。在細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中，sh-TMSB10組的細(xì)胞穿透膜的數(shù)量減少（均P lt; 0.05），見圖3B、C。

3 討 論

PTC是甲狀腺癌中最常見的亞型，占所有甲狀腺癌病例的80%以上 ［2， 4］ 。目前PTC治療以手術(shù)切除為主，手術(shù)切除聯(lián)合放射性碘治療能夠提高患者的生存率。然而，對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)性PTC患者，傳統(tǒng)治療手段的效果有限，且患者常面臨腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等問題。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，靶向治療和免疫治療逐漸成為晚期PTC治療的新方向［26］。然而，靶向治療在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤細(xì)胞通過基因突變或信號(hào)通路改變產(chǎn)生耐藥性、適用人群有限以及治療成本較高等問題。因此，深入研究PTC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。

Tβ10是一種小分子肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在多種人類癌癥中表達(dá)上調(diào)，并通過調(diào)控細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等過程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TMSB10在多種人類癌癥中上調(diào)，且通過不同的機(jī)制參與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并預(yù)測(cè)不良生存［9， 20-21， 27］。本研究顯示，TMSB10在PTC細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，且通過基因敲低技術(shù)抑制TMSB10表達(dá)后，PTC細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制。這一結(jié)果提示，TMSB10可能在PTC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有研究表明，TMSB10過表達(dá)在人類癌變中是普遍現(xiàn)象，其中包括PTC［16］。TMSB10在PTC組織中的表達(dá)水平高于相鄰的癌旁正常組織，這種升高的TMSB10表達(dá)與N分期呈正相關(guān)［16］，然而，TMSB10在PTC中的生物學(xué)作用和臨床意義在很大程度上仍然未知。

癌癥的發(fā)生、發(fā)展涉及多種信號(hào)通路的異常激活或抑制，這些信號(hào)通路構(gòu)成了調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡的核心網(wǎng)絡(luò)。在癌癥中，大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）/快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的異常激活是常見的分子事件，這些通路的異常不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，還與其侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)［28］。一些針對(duì)目的基因的藥物，包括靶向藥物可通過阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)通路，如表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT/mTOR等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活［29-30］。目前甲狀腺癌的靶向治療藥物主要有酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）、抗VEGF藥物以及環(huán)氧酶-2受體抑制劑，較為局限［24］。然而，由于腫瘤異質(zhì)性和信號(hào)通路的代償性激活，靶向治療常面臨耐藥性問題。因此，深入研究TMSB10在PTC中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示PTC發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)，還可為開發(fā)新的靶向治療策略提供理論依據(jù)。本研究表明，TMSB10在PTC中高表達(dá)，提高了PTC的增殖與侵襲能力，促進(jìn)PTC的進(jìn)展。TMSB10有望作為預(yù)測(cè)預(yù)后的腫瘤生物標(biāo)志物和開發(fā)新型治療策略的潛在靶點(diǎn)。

癌細(xì)胞的惡性增殖在PTC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［22］。早期PTC患者進(jìn)展為晚期主要是因?yàn)榘┘?xì)胞向周圍組織侵犯、向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。盡管本研究揭示了TMSB10在PTC中的重要作用，但仍存在一些局限性。首先，本研究缺乏臨床病理樣本的驗(yàn)證，如qRT-PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)染色。其次，雖然體外試驗(yàn)表明TMSB10促進(jìn)PTC的增殖以及侵襲，但缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)TMSB10敲低后PTC的表型功能受到抑制，但缺少對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路、下游靶基因的探索研究，這是本研究的不足，也將是筆者團(tuán)隊(duì)未來(lái)的研究重點(diǎn)內(nèi)容。

綜上所述，TMSB10在PTC中的高表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用提示其可能作為PTC治療的潛在靶點(diǎn)。然而，TMSB10在PTC中的具體作用機(jī)制及其臨床意義仍需進(jìn)一步研究。通過深入探索TMSB10調(diào)控的信號(hào)通路及其與腫瘤微環(huán)境的相互作用，研究者有望為晚期或復(fù)發(fā)性PTC患者提供新的治療策略，并克服現(xiàn)有靶向治療的局限性。未來(lái)的研究應(yīng)結(jié)合臨床樣本驗(yàn)證、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和分子機(jī)制探索，全面揭示TMSB10在PTC中的生物學(xué)功能，為PTC的精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：林燕薇）