全氟辛酸和五價砷聯(lián)合暴露對普通小球藻生理生化的影響

摘要：水環(huán)境中砷（As）和全氟辛酸（PFOA）的毒性及其高檢出率和逐年增高的濃度已引起人們的高度重視。探究全氟辛酸和砷聯(lián)合暴露對水生生物的毒性作用，為全氟化合物和重金屬在水生生態(tài)系統(tǒng)的聯(lián)合風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)。以普通小球藻為受試生物，研究不同濃度PFOA+As5+（0、0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU）對普通小球藻的生長、葉綠素（Chl）含量、初級代謝產(chǎn)物、抗氧化酶活性和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，在96 h脅迫時，各處理組對普通小球藻的生長均有抑制作用，其中1.5 TU處理組抑制率最高，為63.6%，96 h-IC50為1.104 TU（PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L），聯(lián)合作用模式為部分相加作用，生態(tài)風(fēng)險增加；藻細(xì)胞T-Chl、Chl-a、Chl-a/b、總蛋白（TP）、胞內(nèi)多糖含量均隨暴露濃度的增加呈顯著下降趨勢，Chl-b無明顯變化。而胞外多糖和中性脂質(zhì)呈顯著上升；細(xì)胞膜通透性、活性氧自由基（ROS）和丙二醛（MDA）含量顯著上升，線粒體膜電位（MMP）顯著下降；聯(lián)合脅迫下，藻細(xì)胞總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和三磷酸腺苷酶（ATPase）活性顯著下降，而總巰基（-SH）和還原型谷胱甘肽（GSH）活性顯著上升；TEM和SEM結(jié)果表明，聯(lián)合脅迫會破壞藻細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)；藻細(xì)胞對PFOA和As5+的吸收降解并不顯著，但在實(shí)際環(huán)境濃度長期暴露下，藻細(xì)胞對其吸收降解和生物富集還有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：砷；全氟辛酸；普通小球藻；聯(lián)合毒性；抗氧化酶；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S932.4" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2025）02-0223-12

全氟化合物（perfluoroalkyl substances，PFASs）是一類與碳原子相連的氫原子被氟原子完全取代或部分取代的脂肪烴類化合物，具有高電負(fù)性、強(qiáng)碳氟鍵和化學(xué)穩(wěn)定性等特殊性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于制造醫(yī)療設(shè)備、半導(dǎo)體涂層和滅火泡沫等（Zhang et al，2021）。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）作為使用最為廣泛的PFASs之一，為PFASs污染中主要部分，且具有極強(qiáng)的環(huán)境持久性和生物放大性（Li et al，2020a）。PFOA在2009年被列為《斯德哥爾摩公約》的持久性有機(jī)污染物，在2020年被中國列入《優(yōu)先控制化學(xué)品名錄》（中華人民共和國生態(tài)環(huán)境部，2020）。目前，PFOA在包括水環(huán)境中的不同環(huán)境介質(zhì)均被檢測出（Liu et al，2018），表現(xiàn)出明顯的遠(yuǎn)距離遷移和全球性。美國法倫海軍航空站附近的水域中檢測到高達(dá)6.57 mg/L的PFOA（Schultz，2004）。我國錢塘江（杭州段）和千島湖（新安江水庫）PFOA濃度范圍分別為0.59～538 ng/L和0.52～3.61 ng/L（張明等，2015；2020）。長江上游重慶段和下游黃浦江表層水中PFOA濃度分別為61.93和139.6 ng/L（Sun et al，2017；杜國勇等，2019），甚至海洋和偏遠(yuǎn)地區(qū)也有監(jiān)測數(shù)據(jù)（Li et al，2018）。

水生態(tài)系統(tǒng)中重金屬污染是一個全球性的威脅（Zhou et al，2020）。砷（Arsenic，As）在水環(huán)境中主要以As5+和As3+形式存在，其中As5+的穩(wěn)定性和環(huán)境含量均高于As3+，具有難降解和致畸致癌等特性（Byeon et al，2021），主要來源為電鍍、采礦和精煉等過程排放的工業(yè)廢水。工業(yè)化地區(qū)的河流和排放廢水中As濃度可高達(dá)5 mg/L（Wang et al，2013），緊鄰砷礦的水庫中As含量高達(dá)1.001 mg/L（張蒙等，2022），準(zhǔn)噶爾盆地監(jiān)測到地下水As濃度高達(dá)887.0 μg/L（雷米等，2024）。隨著河流流淌，污染物最終匯入海洋，特別是河口和沿海水域。例如，長江口表層水和沉積物中As平均濃度為1.948 μg/L和14.815 mg/kg，As有明顯的富集趨勢（張建坤等，2020）。水環(huán)境中As和PFOA的高檢出率和遞增的濃度水平已引起人們的重視。

浮游植物（微藻）是水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，也是食物鏈中富集環(huán)境污染物的起點(diǎn)，具有體積小，世代時間短和對環(huán)境敏感等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境安全評價和環(huán)境毒性檢測（Lin et al，2020）。研究表明，As和PFOA對水生生物的發(fā)育、代謝、免疫、神經(jīng)和生殖等均表現(xiàn)出較明顯的毒性效應(yīng)（馮政等，2010；Xu et al，2013；Wang et al，2021a），但是大多側(cè)重于單因素毒性研究。然而，在自然條件下，水生生物可能同時暴露在多種污染物下，如重金屬和持久性有機(jī)污染物（孟娣等，2018）。最近的研究也越來越關(guān)注不同污染物對水生生物的聯(lián)合作用，如微塑料和鉛對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）（Wang et al，2021b）、抗生素馬度米星銨和銅對鯽（Carassius auratus）（高修歌等，2021）、銀和二氧化鈦納米顆粒對大型蚤（Daphnia magna）（Galhano et al，2020）。目前關(guān)于PFASs和重金屬對水生生物的聯(lián)合毒性影響信息較少，尤其是對藻類影響的研究。因此，本試驗(yàn)以普通小球藻（Chlorella vulgaris）為受試生物，研究PFOA和As5+聯(lián)合暴露對其生長、光合作用、初級代謝產(chǎn)物、生理生化功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，闡明二者對普通小球藻的交互影響，進(jìn)一步探討PFASs和重金屬對水生生物的聯(lián)合毒性機(jī)理，揭示水環(huán)境中PFASs和重金屬相關(guān)的暴露風(fēng)險，進(jìn)而有助于實(shí)現(xiàn)水域生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展和利用。

1" "材料與方法

1.1" "試驗(yàn)材料

普通小球藻（Chlorella vulgaris，F(xiàn)ACHB-8）購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫（FACHB-Collection）。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）購自上海麥克林生化科技有限公司，純度gt;96%。As5+標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L）購自北京墨壇質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2" "藻種培養(yǎng)

在溫度25 ℃，光照12 h/暗12 h，光照2 000～8 000 lx的人工光照培養(yǎng)箱（GZX-250BSH-Ⅲ，中國上海新廟醫(yī)療器械制造公司）進(jìn)行培養(yǎng)，直到藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期后再進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG11。藻類在靜態(tài)培養(yǎng)箱中生長，培養(yǎng)物每天固定時間人工搖動3～4次，以防止藻細(xì)胞附著在培養(yǎng)容器上。在顯微鏡下檢查其正常形態(tài)，以對數(shù)生長期的藻類為試驗(yàn)對象。

1.3" "試驗(yàn)濃度設(shè)置

試驗(yàn)方法參照淡水生物水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)技術(shù)指南（HJ 831—2022），微藻是靜態(tài)暴露方式。單一急性試驗(yàn)結(jié)果表明PFOA和As5+對普通小球藻的96 h-IC50分別為279.5和1.93 mg/L（李立杰等，2022），以0.5×IC50（PFOA）+0.5×IC50（As5+）=1 TU（毒性單位），聯(lián)合暴露試驗(yàn)濃度（表1）設(shè)置為0（CK）、0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU，每個處理組3個平行，接種初始藻密度1×106個/mL，培養(yǎng)藻液體積為100 mL，急性試驗(yàn)暴露周期為96 h。急性毒性試驗(yàn)重點(diǎn)在于觀察藻細(xì)胞對污染物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，并為后續(xù)慢性毒性試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)基礎(chǔ)，所以本試驗(yàn)設(shè)置濃度與環(huán)境濃度相比較高。試驗(yàn)結(jié)束時測定生理生化指標(biāo)。其他試驗(yàn)條件同1.2。

1.4" "聯(lián)合毒性評價

本試驗(yàn)分別用毒性單位法（TU）、相加指數(shù)法（AI）和混合毒性指數(shù)法（MTI）對聯(lián)合毒性進(jìn)行評價。具體公式如下（Wang et al，2019）：

UT，i=Ci /CI，50i ①

UT=[Σ]UT，i ②

UT，0=UT/max（UT，i） ③

式中：UT為混合污染物中各組分毒性單位之和；UT，i為混合污染物中i組分的毒性單位，UT，0為混合污染物中各組分毒性單位之和與max（UT，i）混合污染物中i組分毒性單位最大值的比值；Ci為混合污染物i的半致死濃度，CI，50i為污染物i單獨(dú)作用時的半致死濃度，單位均為mg/L。（1）毒性單位法（TU）：若UTgt;UT，0，呈拮抗作用；若UTlt;1，呈協(xié)同作用；若UT=UT，0，為獨(dú)立作用；若UT，0gt;UTgt;1，呈部分相加作用。（2）相加指數(shù)法（AI）：當(dāng)UT≤1.0時，IA=（1/UT）－1；當(dāng)UT≥1.0時，IA =1－UT，若IAgt;0，呈大于相加作用，若IAlt;0，呈小于相加作用，若IA=0，呈等于相加作用。（3）混合毒性指數(shù)法（MTI）：IMT=1－lgUT/lg（UT，0），若IMTlt;0，呈拮抗作用，若IMT=0，獨(dú)立作用；若0lt;IMTlt;1，部分相加作用；若IMT=1，濃度相加作用；若IMTgt;1，協(xié)同作用。

1.5" "藻密度的測定

通過血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在波長680 nm下測定藻液吸光度，建立不同藻細(xì)胞濃度和光密度之間的線性關(guān)系，如下：

Y=137.88X-5.3629（R2=0.9999） ④

每24 h在680 nm處檢測藻液吸光度值。通過藻密度繪制生長曲線并計(jì)算抑制率I（%）（Liu et al，2022）。

[Ι=ACK?AXΑCK×100]% ⑤

式中：ACK指對照組的藻密度，AX指試驗(yàn)組的藻密度，單位均為個/mL。

1.6" "生理生化指標(biāo)的測定

1.6.1" "光合色素" "各濃度組取5 mL藻液，使用熱乙醇法提取，在649 nm和665 nm測定吸光度值，并依據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算（Li et al，2020a）：

C（Chl-a）=13.95×A665-6.88×A649 ⑥

C（Chl-b）=24.96×A649-7.32×A665 ⑦

C（T-Chl）=18.08×A649+6.63×A665 ⑧

式中：C（Chl-a）、C（Chl-b）和C（T-Chl）分別為Chl-a、Chl-b和總?cè)~綠素的濃度，單位均為mg/L；A665、A649分別為藻液在665 nm和649 nm的吸光度。

1.6.2" "初級代謝產(chǎn)物" "多糖含量用蒽酮-硫酸方法定量?？偟鞍缀浚═P，A045-4-2）用南京建成生物工程研究所相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行測定。微藻的脂質(zhì)含量是用尼羅紅（0.1 mg/mL，DMSO）熒光法檢測，結(jié)果顯示為每106個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（Luo et al，2021）。

1.6.3" "氧化損傷指標(biāo)" "ROS試劑盒（A001-2，南京建成生物工程研究所）中描述的二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針測定ROS的產(chǎn)生。羅丹明123（Rh123）熒光染料檢測線粒體膜電位（MMP），細(xì)胞膜通透性水平用二乙酸熒光素（fluorescein diacetate）染色法測定（Liu et al，2018），結(jié)果顯示為每106個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.6.4" "抗氧酶活性" "取50 mL藻液，藻泥真空低溫干燥，使用組織細(xì)胞破碎儀破碎，破碎后加入1 mL PBS混勻，低溫離心上清液為粗酶液?？偪寡趸芰Γ═-AOC，A015-2-1）、總超氧化物歧化酶（T-SOD，A001-3-2）、三磷酸腺苷酶（ATPase，A070-1-2）、還原型谷胱甘肽（GSH，A006-2-1）、總巰基（-SH，A063-4-1）和丙二醛（MDA，A003-2-2）含量用南京建成生物工程研究所相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.7" "細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析

96 h時，各處理組收集5 mL藻細(xì)胞，在掃描電鏡和透射電鏡觀察、拍照和分析。藻細(xì)胞固定后清洗，在真空低溫干燥機(jī)中脫水6 h，再噴金45 s，使用掃描電鏡（SEM，TESCAN VEGA 3）觀察拍照。藻細(xì)胞固定清洗，依次乙醇梯度脫水，最后滲透、包埋、切片和染色，使用透射電子顯微鏡（TEM，日立，HT7800）下進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析（Liu et al，2022）。

1.8" "暴露液濃度的測定

試驗(yàn)開始和結(jié)束時，分別測定PFOA和As的濃度。As濃度使用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（PeKinElmer，NexION 1000/2000 Series）測定。PFOA濃度使用高分辨飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀（AB，TripleTOF 5600+）測定，試驗(yàn)方法參考《水質(zhì) 17種全氟化合物的測定 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》（DB 32/T 4004—2021）。

1.9" "綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)（IBR）

計(jì)算每種生物標(biāo)志物在各站位的平均值（Xi）以及所有站點(diǎn)該種生物標(biāo)志物的總平均值（m）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），然后將該標(biāo)志物Xi值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：

Yi=（Xi-m）/s" " " " " " " " " " " ⑨

式中：Yi為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值。如果標(biāo)志物與污染物呈正相關(guān)，則令Z=Yi，反之則Z=-Yi。各站位每種標(biāo)志物的得分為：

Ai=Z+[min]" " " " " " " " " " " " ⑩

式中：[min]是Z中最小值的絕對值。將每種生物標(biāo)志物的Ai以星狀圖中輻射線的長度表示，那么該站位的綜合生物標(biāo)志物相應(yīng)指數(shù)IBR值則通過計(jì)算星狀圖上圖形的面積（相鄰生物標(biāo)志物的輻射線所圍出的三角形的面積之和）獲得，計(jì)算方法如下：

[IBR=1nBi ]" " " " " " " " " " ?

[Bi=SiSisinα2]" " " " " " " " " " ?

[α=2πn]" " " " " " " " " " " " " ?

式中：Bi為第i條和第（i+1）條輻射線所圍成的三角形面積；Si和Si+1為星狀圖中順時針方向連續(xù)2個得分；α為相鄰兩條輻射線之間的夾角；n為生物標(biāo)志物的種數(shù)（Chen et al，2022）。

1.10" "數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "普通小球藻藻密度

藻密度隨暴露時間的延長和濃度的增加均顯著下降，在96 h時，0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU處理組抑制率分別為3.5%、5.0%、49.8%、56.3%和63.6%。通過非線性曲線—最小二乘法對普通小球藻96 h時生長抑制率進(jìn)行擬合，得到擬合效應(yīng)曲線（圖1），PFOA和As5+聯(lián)合脅迫對普通小球藻的96 h-IC50為1.104 TU，PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L。并采用毒性單位法（TU）、添加指數(shù)法（AI）和混合毒性指數(shù)法（MTI）評價PFOA和As5+聯(lián)合暴露的作用模式，均顯示出部分相加毒性效應(yīng)（表2）。

2.2" "普通小球藻葉綠素（Chl）含量

由圖2可知，PFOA和As5+聯(lián)合脅迫導(dǎo)致葉綠素含量顯著下降。與對照組相比，1.2和1.5 TU處理組T-Chl含量顯著下降，分別降低31.5%和42.3%。1、1.2和1.5 TU處理組Chl-a含量分別降低25.6%、44.1%和63.8%，Chl-a/b呈相同趨勢，而各處理組Chl-b含量無顯著性差異。

2.3" "普通小球藻初級代謝產(chǎn)物

總蛋白和胞內(nèi)多糖含量隨聯(lián)合脅迫濃度的增加而逐漸下降（圖3a，3b）。1、1.2和1.5 TU處理組與對照組相比總蛋白含量顯著降低，分別下降32.0%、17.7%和50.9%，同時胞內(nèi)多糖也分別下降19.2%、26.0%和21.8%。而胞外多糖含量呈顯著上升，1、1.2和1.5 TU處理組與對照組相比分別增加到1.6、1.6和1.8倍。中性脂質(zhì)含量隨暴露濃度的增加呈上升趨勢（圖3c），1.2和1.5 TU處理組中性脂質(zhì)含量顯著高于對照組，而各處理組極性脂質(zhì)與對照組相比均不顯著。

2.4" "普通小球藻的氧化損傷

ROS和MDA含量隨暴露濃度的增加而逐漸增加，1、1.2和1.5 TU處理組ROS含量為對照組的3.6、2.7和8.2倍，1.5 TU處理組MDA含量為對照組的1.7倍（圖4a）。細(xì)胞膜通透性熒光強(qiáng)度隨暴露濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，0.1～1.2 TU處理組與對照組相比沒有顯著性差異，而1.5 TU處理組與對照組相比顯著降低（圖4b）。藻細(xì)胞MMP水平隨暴露濃度的增加呈顯著下降的趨勢，0.1～1.5 TU處理組與對照組相比分別降低16.8%～43.3%（圖4b）。

2.5" "普通小球藻抗氧化系統(tǒng)

隨著暴露濃度的增加，藻細(xì)胞T-AOC、T-SOD、CAT和ATPase含量與對照組相比均呈現(xiàn)出顯著抑制作用（圖5），1、1.2和1.5 TU處理組T-AOC含量分別下降36.7%、13.4%和82.5%，CAT含量呈相同趨勢，分別下降30.8%、50.4%和67.0%。0.1～1.5 TU處理組T-SOD和ATP含量分別下降5.6%～56.5%和27.0%～51.7%。而藻細(xì)胞-SH和GSH含量隨暴露濃度的增加而顯著增加，1.5 TU處理組-SH和GSH含量分別是對照組的2.1倍。

2.6" "綜合生物標(biāo)記物響應(yīng)指數(shù)（IBR）

對各處理組普通小球藻的抗氧化能力（T-SOD、CAT、GSH、T-AOC、ATP、-SH和MDA）、T-Chl含量和總蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，隨暴露濃度的增加，IBR指數(shù)逐漸升高，1.5 TU處理組的IBR最高為18.2（圖6）。表明隨脅迫濃度的增加，普通小球藻所受的影響越大，生態(tài)風(fēng)險增加。

2.7" "生理生化指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)

如表3所示，ROS分別與MDA和GSH呈顯著正相關(guān)，分別與T-Chl、TP、T-AOC、T-SOD、ATP和CAT呈顯著負(fù)相關(guān)。T-Chl、TP、T-AOC、T-SOD、ATP和CAT相互呈顯著正相關(guān)。

2.8" "普通小球藻對PFOA和As的吸收和降解

由表4所示，96 h暴露后，暴露濃度與初始濃度無顯著性差異，藻細(xì)胞對PFOA和As的濃度均沒有顯著性影響。

2.9" "PFOA和As5+聯(lián)合脅迫對藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷

掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）對藻類細(xì)胞的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，如圖7所示。對照組細(xì)胞外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整（圖7a，7c），觀察到明顯的蛋白質(zhì)核被緊密的橢圓形淀粉鞘包圍，從蛋白質(zhì)核到葉綠體類囊體清晰可見。葉綠體和類囊體片層清晰、連續(xù)、折疊整齊，幾乎平行排列。而1.5 TU處理組藻細(xì)胞外部形態(tài)部分溶解破裂變形，細(xì)胞間隔模糊。內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白核和淀粉鞘消失，葉綠體和類囊體片層結(jié)構(gòu)減少，排列疏松。淀粉粒和脂滴增多（圖7b，7d）。

3" "討論

3.1" "聯(lián)合脅迫對藻細(xì)胞生長的影響

在本研究中，不同濃度PFOA和As5+聯(lián)合脅迫下，普通小球藻的生長均表現(xiàn)出抑制作用，聯(lián)合脅迫對普通小球藻的96 h-IC50為1.104 TU，PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L，作用模式為部分相加作用。IBR顯示二者聯(lián)合的生態(tài)風(fēng)險增加。Li等（2021）研究表明，與單一脅迫相比，有色金屬浮選試劑丁基黃原鹽酸和鎳復(fù)合污染對蛋白核小球藻生長抑制更為顯著。Lu等（2015）研究表明銅和金霉素聯(lián)合暴露對蛋白核小球藻有部分相加作用。本試驗(yàn)結(jié)果與前人結(jié)果一致，二元混合物毒性增強(qiáng)。根據(jù)毒性機(jī)理，As5+在結(jié)構(gòu)上與磷酸鹽類似，可取代生化反應(yīng)中的磷酸，使氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，干擾細(xì)胞的能量代謝，抑制參與細(xì)胞代謝的主要巰基酶的活性（Byeon et al，2021）。PFOA會與細(xì)胞表面的疏水位點(diǎn)結(jié)合，對細(xì)胞膜功能造成損傷，從而刺激細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，引起其他生物大分子的脂質(zhì)過氧化損傷（Xu et al，2022）。盡管這2種污染物的作用靶點(diǎn)不同，但PFOA可能通過有機(jī)配體與砷離子發(fā)生絡(luò)合或螯合作用，從而形成毒性更強(qiáng)的化合物。

葉綠素（Chl）是藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中Chl-a和Chl-b作為Chl合成的主要產(chǎn)物，其含量可以衡量藻細(xì)胞的生長狀況和受脅迫程度。Chl-a/b值越高，越有利于CO2轉(zhuǎn)化為光合產(chǎn)物（Liu et al，2018）。在本研究中，隨著聯(lián)合脅迫濃度的增加，Chl-a/b、T-Chl和Chl-a含量顯著下降。這可能是聯(lián)合脅迫最先抑制葉綠素a的合成，捕光能力減弱，導(dǎo)致藻細(xì)胞體內(nèi)T-Chl的含量不斷減少，光合作用機(jī)能遭到嚴(yán)重破壞（Wu et al，2019），減弱的光合作用可能會影響藻細(xì)胞的能量儲備（Luo et al，2021）。在本研究中，藻細(xì)胞的胞內(nèi)多糖和總蛋白含量顯著下降，最高下降21.8%和50.9%，而胞外多糖和中性脂質(zhì)顯著上升。相關(guān)分析表明T-Chl與總蛋白呈顯著正相關(guān)。表明光合作用的減弱導(dǎo)致碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝合成途徑受到抑制，反而增加細(xì)胞脂質(zhì)的合成途徑，這與王珊等（2014）研究結(jié)果相一致。而藻細(xì)胞胞外多糖顯著增加，可能是聯(lián)合脅迫導(dǎo)致藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受損，胞內(nèi)多糖分泌到細(xì)胞外，促進(jìn)細(xì)胞形成防御性的群體，提高其在脅迫環(huán)境下的抗性（Liu et al，2022）。

糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)3大營養(yǎng)物質(zhì)最終通過線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈轉(zhuǎn)運(yùn)電子生成ATP。因此，正常的線粒體膜電位（MMP）是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化和產(chǎn)生ATP的先決條件，膜電位的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能（Liu et al，2018）。在本研究中，聯(lián)合脅迫下，各處理組MMP水平均顯著下降，與ATP含量呈一致性。表明在聯(lián)合脅迫下，藻細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后MMP的變化導(dǎo)致線粒體供能機(jī)制障礙，呼吸鏈與氧化鏈酸化且失去偶聯(lián)，下調(diào)ATP產(chǎn)生水平，最后使線粒體外膜破碎，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（魏國芹等，2020）。相關(guān)分析表明，ROS水平分別與ATP、T-Chl和TP含量呈顯著負(fù)相關(guān)。由此可見，藻細(xì)胞的生長受到抑制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。

3.2" "聯(lián)合脅迫對藻細(xì)胞抗氧化體系的影響

ROS水平超過防御機(jī)制范圍，細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，引起脂質(zhì)過氧化、酶失活和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷等。在藻類中，ROS主要是在葉綠體和質(zhì)膜的電子傳遞活動中產(chǎn)生（Wang et al，2021c）。在本研究中，1、1.2和1.5 TU處理組ROS含量顯著增加。表明聯(lián)合脅迫造成的光合作用損傷，從而引起電子積累，并與分子氧反應(yīng)生成ROS。之前的研究表明As5+和PFOA單一脅迫下藻細(xì)胞ROS含量顯著增加。表明藻細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能是PFOA、As5+和PFOA+As5+的毒性機(jī)制之一。

作為對ROS水平升高的響應(yīng)，藻細(xì)胞體內(nèi)T-AOC、T-SOD、CAT、GSH和-SH（活性巰基）等活性酶相互協(xié)同，形成抗氧化防御體系，以此減少或攔截ROS的產(chǎn)生（Wang et al，2019）。在As5+脅迫下，普通小球藻的T-SOD和T-AOC均顯著增加（李立杰等，2022）；而在PFOA脅迫下，呈先上升后下降的趨勢（Xu et al，2013）。在本研究中，PFOA和As5+聯(lián)合脅迫導(dǎo)致藻細(xì)胞T-AOC、T-SOD和CAT含量顯著降低。ROS水平分別與T-AOC、T-SOD和CAT呈顯著負(fù)相關(guān)。表明PFOA和As5+聯(lián)合暴露與單一暴露相比毒性增強(qiáng)，藻細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS損害機(jī)體，抑制抗氧化酶的活性。而GSH和-SH活性顯著增強(qiáng)，ROS水平與GSH呈顯著正相關(guān)。推測藻細(xì)胞GSH活性升高是為了消除多余的ROS并維持其平衡。而-SH含量的增加，可以促進(jìn)GSH的活性，從而提供更多的底物，并能穩(wěn)定含巰基的酶和防止其他輔因子受氧化損傷，以緩解污染物脅迫。這在其他研究中也報(bào)道了類似的結(jié)果（Liu et al，2021）。

盡管GSH和-SH對污染物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，但仍然不足以完全清除過量的ROS，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，用來衡量細(xì)胞的氧化損傷程度（Wang et al，2017）。在本研究中，MDA含量隨暴露濃度的增加而顯著增加，其中1.5 TU處理組最為顯著，是對照組的1.7倍。MDA含量與ROS水平呈顯著正相關(guān)。綜上結(jié)果表明，PFOA和As5+混合物通過引起藻細(xì)胞氧化應(yīng)激和膜脂質(zhì)過氧作用來影響其生長。細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度越強(qiáng)表示細(xì)胞代謝活性越強(qiáng)，細(xì)胞膜受損越?。T政等，2010）。在本研究中，1.5 TU處理組細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度與對照組相比顯著降低，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，證明脂質(zhì)過氧化損傷加劇，并進(jìn)一步損害細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

3.3" "聯(lián)合脅迫對藻細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

葉綠體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化直接反映光合作用能力，其中類囊體是光合反應(yīng)的場所（Be?ková et al，2017）。TEM結(jié)果表明，1.5 TU處理組藻細(xì)胞類囊體和葉綠體結(jié)構(gòu)明顯減少，蛋白核和淀粉鞘已經(jīng)消失。這主要是類囊體膜中富含不飽和脂肪酸，容易受到過量ROS的攻擊，脂質(zhì)過氧化程度不斷加深，嚴(yán)重影響藻細(xì)胞自身的正常生長以及代謝活動（Zhang et al，2020），這與Chl的結(jié)果呈一致性。SEM結(jié)果表明，1.5 TU處理組藻細(xì)胞部分溶解破裂，表明聯(lián)合脅迫引起細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變，從而影響到細(xì)胞形態(tài)的變化，進(jìn)一步證明聯(lián)合脅迫對細(xì)胞膜的損傷。在前人的研究中也觀察到了類似的現(xiàn)象，例如殺菌劑氟咯菌腈會引起微藻細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜通透性的變化（Liu et al，2022）。聯(lián)合脅迫后，藻細(xì)胞脂滴和淀粉粒數(shù)量增多，脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的主要儲存場所這與上述試驗(yàn)結(jié)果中性脂質(zhì)的增加呈一致性，表明PFOA和As5+聯(lián)合脅迫在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞儲備物質(zhì)的合成和積累，以供細(xì)胞適應(yīng)更加惡劣的環(huán)境條件（Liu et al，2019）。

3.4" "藻細(xì)胞對污染物的吸收

聯(lián)合暴露后As濃度與初始濃度無顯著性差異?？赡苁牵海?）As5+通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，因此，暴露液中磷酸鹽的有無以及磷酸鹽與As5+的比例關(guān)系均會影響藻細(xì)胞對As5+的吸收（于清男等，2020）；（2）暴露后As可能包含多種價態(tài)和化學(xué)形態(tài)，藻細(xì)胞吸收As5+后，經(jīng)過一系列代謝活動向其他組織轉(zhuǎn)運(yùn)與再分配，轉(zhuǎn)化為As3+、二甲基砷（DMA）和一甲基砷（MMA）等，并通過一些途徑外排至暴露液（陳雙雙等，2022）。銅綠微囊藻長期暴露于As5+和As3+后，As形態(tài)分析表明As5+是暴露液的優(yōu)勢形態(tài)，占總As的78%～93%，且As5+在暴露期間保持相對穩(wěn)定（Wang et al，2013）。在本研究中，PFOA暴露后濃度與初始濃度無顯著性差異。可能與PFOA是一種疏水陰離子化合物有關(guān)，其疏水性對吸附有吸引力，但陰離子官能團(tuán)與帶負(fù)電荷的藻細(xì)胞之間的靜電作用不利于吸附。因此，藻細(xì)胞對PFOA的吸附是疏水作用和靜電作用的競爭，結(jié)果最終以排斥作用為主（Hu et al，2020）。在聯(lián)合脅迫下，可能是：（1）PFOA和As5+相互競爭結(jié)合微藻表面上的配基部位（Bayo，2012）；（2）PFOA憑借較強(qiáng)的疏水疏油等特性，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而影響藻細(xì)胞對其他污染物的攝取（Qu et al，2016）；（3）PFOA由于其表面活性和弱電負(fù)性，可以優(yōu)先與胞外聚合物相互作用，通過促進(jìn)藻細(xì)胞聚集和增加胞外聚合物的產(chǎn)生，減少As5+進(jìn)入藻細(xì)胞（Chen et al，2020）。

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（責(zé)任編輯" "熊美華" "崔莎莎）

Effects of Combined Exposure of Perfluorooctanoic Acid and As（V） on the Growth， Physiology and Biochemistry of Chlorella Vulgaris

LI Lijie1，2， YU Jiani1，2， MA Yonghua1，2， LIAO Mulan1，2， GE Heng1，2， TAN Fengxia1，2， CHAI Yi1，3

（1. Engineering Research Center for Wetland Ecology and Agricultural Utilization， Ministry of Education， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China;

2. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China;

3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China）

Abstract：In this study， Chlorella vulgaris was selected as the test organism， and we explored the toxic effects of combined exposure to perfluorooctanoic acid （PFOA） and arsenic （As） on C. vulgaris， focusing on growth， chlorophyll （Chl） content， primary metabolites， antioxidant enzyme activities and morphology. Five concentrations of PFOA+As（V） [0.1， 0.5， 1， 1.2 and 1.5 Toxic Unit （TU）] and a control group were set for the acute toxicity test， with each treatment in triplicate， an initial C. vulgaris density of 1×106 cells/mL and an exposure period of 96h. At the end of the test， the physiochemical parameters of C. vulgaris for each treatment were determined. All PFOA+As（V） treatments inhibited C. vulgaris growth， with the highest decrease （63.6%） at the highest dose （1.5 TU）， and the 96h half-maximum inhibitory concentration （IC50） was 1.104 TU， with PFOA and As（V） concentrations of 154.28 mg/L and 1.06 mg/L. The combined action mode was a partial additivity， which increased the ecological risk. With increased exposure concentration， the contents of total Chl， Chl-a， Chl-a/b， total protein （TP） and intracellular polysaccharide all decreased significantly， while the content of Chl-b did not significantly change. The extracellular polysaccharide and neutral lipid increased significantly. Photosynthesis was inhibited， resulting in a significant increase of cell membrane permeability， reactive oxide species （ROS） and malondialdehyde （MDA）， and a significant decrease in mitochondrial membrane potential （MMP）. Under the combined toxic stress， the antioxidant system of algal cells was disordered， and the activities of total antioxidant capacity （T-AOC）， total superoxide dismutase （T-SOD）， catalase （CAT） and adenosine triphosphate （ATP） significantly decreased， while the activities of sulfhydryl （-SH） and glutathione （GSH） significantly increased. Transmission electron microscope （TEM） and scanning electron microscope （SEM） results show that combined stress destroyed both the internal structure and external morphology of algal cells. The uptake and degradation of PFOA and As（V） by algal cells were not significant， but the uptake， degradation and bioenrichment of PFOA and As（V） by algal cells under long-term exposure to actual environmental concentrations need further study. This study provides a theoretical framework for the combined risk assessment of PFASs and heavy metals in aquatic ecosystems.

Key words： arsenic; perfluorooctanoic acid; Chlorella vulgaris; combined toxicity; antioxidant enzyme; ultrastructure

基金項(xiàng)目：長江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金（KFT202006）。

作者簡介：李立杰，2000年生，男，碩士研究生，研究方向水生態(tài)毒理學(xué)。E-mail：648581458@qq.com

通信作者：柴毅，女，博士。E-mail：chaiyi123456@126.com