基于全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的中國圓田螺微衛(wèi)星特征分析與標記篩選

摘要：通過高通量測序開發(fā)中國圓田螺多態(tài)性SSR標記，為田螺的種質(zhì)利用及良種選育提供技術(shù)支撐。基于PacBio’s SMRT測序獲得中國圓田螺全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，查找基因組微衛(wèi)星（SSR）位點并分析其特征，共識別到8 058個SSR位點，1～6個核苷酸重復(fù)SSR均存在，其中二核苷酸重復(fù)SSR數(shù)量最多（4 647，57.67%），其次為三核苷酸重復(fù)SSR（1 274，15.81%）。在二核苷酸重復(fù)基元中以AC/GT的重復(fù)數(shù)最多，占總SSR位點數(shù)的34.82%。隨機選擇合成192對引物篩選獲得22對多態(tài)性SSR引物，并使用這些標記對廣西圓田螺群體進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，有22個SSR標記擴增產(chǎn)物穩(wěn)定，22個SSR標記共檢測到102個等位基因，平均等位基因數(shù)（Na）為4.636，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）均值分別為0.286和0.589，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.247～0.844。在22個SSR位點中，高度多態(tài)性位點（PICgt;0.50）有13個，中度多態(tài)性位點（0.25lt;PIC≤0.50）有8個，說明中國圓田螺群體遺傳多樣性較豐富。利用PacBio’s SMRT測序技術(shù)開發(fā)中國圓田螺SSR標記不僅效率高，而且適用于中國圓田螺的資源評估。

關(guān)鍵詞：中國圓田螺；轉(zhuǎn)錄組；微衛(wèi)星；多態(tài)性標記

中圖分類號：S932.4" " " " 文獻標志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2025）02-0235-08

中國圓田螺（Cipangopaludina chinensis），隸屬于腹足綱（Gastropoda）、田螺科（Viviparidae）、圓田螺屬（Cipangopaludina），是我國養(yǎng)殖最廣的經(jīng)濟淡水螺類（周康奇等，2021）。因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，并具有一定的藥用價值，被消費者和養(yǎng)殖戶所喜愛，年消耗近百萬噸（陳李婷等，2019）。同時，田螺還是青魚、水蛭、中華絨毛蟹等重要經(jīng)濟水產(chǎn)動物的天然餌料，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益（Xiong et al，2017；Zhou et al，2022b）。近年來，我國田螺養(yǎng)殖均是未經(jīng)過科學選育和評估的原生種群，長期采用“養(yǎng)繁一體”的養(yǎng)殖模式，導(dǎo)致近親繁殖嚴重，種質(zhì)退化明顯，產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題逐漸突出。因此，加強田螺養(yǎng)殖過程中對群體多樣性的科學評估，對于田螺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展尤為重要。但目前國內(nèi)外學者對中國圓田螺的研究主要集中在形態(tài)特征（葉苗等，2017；李哲等，2022）、營養(yǎng)成分（周康奇等，2021；羅輝等，2022）、生物活性（Xiong et al，2020；Zhao et al，2022；周康奇等，2023）和養(yǎng)殖技術(shù)（吳林，2020；楊軍等，2022）等方面，而對其微衛(wèi)星標記的開發(fā)和遺傳多樣性的研究仍較為薄弱，因此，有必要對中國圓田螺開展群體遺傳學研究，以便為今后對該物種資源的挖掘利用和良種評估奠定基礎(chǔ)。

微衛(wèi)星（microsatellite）又稱為簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR），是指以1～6個核苷酸經(jīng)多次重復(fù)單位組成的簡單多次串聯(lián)重復(fù)序列（陳鴻祿，2022）。其具有分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)性高、檢測方便等特點（周康奇等，2020；常浩文等，2023），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于方斑東風螺（Babylonia lutosa）（梁園等，2022）、梨形環(huán)棱螺（Bellamya purificata）（金武等，2022；Yuan et al，2024）和釘螺（Oncomelania hupensis）（丁煥，2018）等腹足類種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究工作。然而，目前有關(guān)中國圓田螺SSR位點的開發(fā)與特征分析的相關(guān)報道仍較少。因此，本研究利用第三代PacBio’s SMRT測序技術(shù)獲取中國圓田螺全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，開發(fā)中國圓田螺多態(tài)性SSR分子標記，并分析其特征和標記篩選，以期為田螺的種質(zhì)資源保護利用、人工養(yǎng)殖和良種選育提供科學數(shù)據(jù)。

1" "材料與方法

1.1" "RNA提取

實驗材料為1個中國圓田螺個體（體重20.30 g，殼高46.05 mm，殼寬33.27 mm），采自廣西柳州里高鎮(zhèn)谷之韻稻螺養(yǎng)殖示范基地，采集腹足、腸、肝胰臟、鰓、性腺、食道、血液、唇8個組織樣品，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。通過Trizol法提取以上組織的總RNA，用Agilent 2100生物分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Nanodrop顯微分光光度計（Thermo Fisher）測定RNA的純度和濃度。

1.2" "文庫構(gòu)建及RNA測序

利用PacBio’s SMRT測序技術(shù)進行中國圓田螺轉(zhuǎn)錄組測序。首先，用Oligo（dT）磁珠法富集mRNA，再將mRNA通過Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR反應(yīng)生成雙鏈cDNA，構(gòu)建SMRTbell文庫。其次，通過PacBio Sequel II測序平臺對構(gòu)建的文庫進行測序，獲得約57 G的原始轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，利用Minimap2將相似的FLNC reads進行層級聚類，獲取一致性序列后用Quiver算法進行校正，并用軟件cd-hit-v4.6.7去冗余。最后，共獲得26 312條Unigene序列，總長度為67 680 460 bp，平均長度為2 572 bp，N50的長度為2 904 bp，GC含量為42.59%（Zhou et al，2022a）。

1.3" "SSR位點搜索及引物設(shè)計

利用MISA軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/ misa.html）對26 312條Unigene進行SSR位點搜索，搜索程序為單堿基重復(fù)次數(shù)≥10，二堿基重復(fù)次數(shù)≥6，三、 四、五、六堿基重復(fù)次數(shù)≥5，復(fù)合微衛(wèi)星位點之間最大間隔堿基數(shù)為100 bp。用Primer 5（Version 2.4.0） 軟件對SSR位點前后的序列進行引物設(shè)計，使用M13通用接頭序列（TGTAAAACGACGGCCAGT）在上游引物5’方向進行修飾，并合成帶不同熒光基團的M13接頭序列。

1.4" "SSR位點驗證及多態(tài)性篩選

利用10個不同地理中國圓田螺群體對SSR位點進行驗證和多態(tài)性篩選，其中10個群體分別來自廣西境內(nèi)珠江流域的那坡、融安、融水、大寺、興安、都安、梧州、全州、賀州和雙定，每個群體30個個體。從這10個中國圓田螺群體300個個體中，分別取20 mg新鮮腹足肌肉，采用磁珠法基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取基因組DNA，經(jīng)紫外分析儀（BIO-RAD，Gel DocTM XR+）和1%凝膠瓊脂電泳檢測合格后，-20 ℃冰箱保存。PCR反應(yīng)體系總體積為15 μL，包含2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，Mix primer 2.0 μL，DNA模板1 μL和ddH2O 4.5 μL。擴增程序為96 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，62～52 ℃ Touch down梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3.0 μL熒光PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后，再經(jīng)DNA測序儀ABI 3 730 xl進行熒光電泳檢測，并使用軟件GeneMarker V2.2.0對原始數(shù)據(jù)進行條帶分型。

1.5" "數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker軟件分析57對引物擴增結(jié)果，并使用GenAIex軟件對擴增出3個等位基因以上的位點進行平均等位基因數(shù)（Na），平均觀測雜合度（Ho），平均期望雜合度（He）計算。運用Cervus軟件計算各個位點的多態(tài)信息含量指數(shù)值（PIC）。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "中國圓田螺SSR位點數(shù)量及分布

通過MISA軟件對中國圓田螺轉(zhuǎn)錄組的所有Unigene進行檢索，共在5 294條Unigene中找到8 058個SSR位點，其發(fā)生頻率（含有SSR的Unigene數(shù)量占總Unigene數(shù)量的比例）為20.12%，其中復(fù)合型SSR位點有1 606個，占總SSR位點的19.93%。SSR位點的出現(xiàn)頻率（SSR位點數(shù)量占總Unigene數(shù)量的比例）為30.62%，其中3 658條Unigene序列僅包含單個SSR位點，占比69.10%，此外，有1 636條Unigene序列包含1個以上SSR位點，占比30.90%（表1）。

2.2" "中國圓田螺SSR重復(fù)類型及特征

中國圓田螺轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型較為豐富，1～6個核苷酸重復(fù)SSR均存在，但對不同核苷酸重復(fù)類型，所含SSR位點數(shù)量存在一定差異（表2）。其中，二核苷酸重復(fù)序列數(shù)量最多（4 647，57.67%），其次是三核苷酸（1 274，15.81%）、四核苷酸（1 239，15.37%）和單核苷酸重復(fù)序列（816，10.13%），五核苷酸和六核苷酸重復(fù)序列所占比例很小，分別只有0.48%和0.53%（表2）。

在中國圓田螺SSR序列的重復(fù)單元中，單核苷酸重復(fù)單元以（A/T）n為主，其SSR位點數(shù)為673，占總SSR位點數(shù)的8.35%，在單核苷酸重復(fù)單元中占比82.48%；二核苷酸重復(fù)單元以（AC/GT）n為主，其SSR位點數(shù)為2 806，占總SSR位點數(shù)的34.82%，在二核苷酸重復(fù)單元中占比60.38%；三核苷酸重復(fù)單元以（ATC/ATG）n為主，其SSR位點數(shù)為357，占總SSR位點數(shù)的4.43%，在三核苷酸重復(fù)單元中占比28.02%；四核苷酸重復(fù)序列有3種重復(fù)單元，以（AGAT/ATCT）n為主，其SSR位點數(shù)為313，占總SSR位點數(shù)的3.88%，在四核苷酸重復(fù)單元中占比25.26%（圖1）。

在中國圓田螺轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點中，4～7次重復(fù)的微衛(wèi)星位點數(shù)量最多。此外，除了單核苷酸重復(fù)單元以16～19次重復(fù)為主外，二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)單元均以4～7次重復(fù)為主，且4～7次重復(fù)在二核苷酸重復(fù)單元上分布的微衛(wèi)星位點數(shù)量最多（圖2）。

2.3" "中國圓田螺SSR位點篩選及群體遺傳多樣性分析

隨機挑選出均勻分布的192對引物，以10個不同地理中國圓田螺群體混合DNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)熒光毛細管電泳檢測其擴增結(jié)果（圖3），初步篩選57對可能存在多態(tài)性的引物，利用廣西10個中國圓田螺群體對這57對引物進行多態(tài)性驗證，最終篩選到22對SSR引物具有多態(tài)性和穩(wěn)定性。

利用這22對多態(tài)性SSR引物檢測廣西中國圓田螺群體的遺傳多樣性，共獲得102個等位基因，等位基因數(shù)為3～10個，平均等位基因數(shù)為4.636；觀測雜合度為0～0.600，平均值為0.286；期望雜合度為0.265～0.860，平均值為0.589；各位點PIC為0.247～0.844，平均值為0.547，其中有13個位點的總體PIC大于0.50，屬于高度多態(tài)位點，8個位點的PIC為0.25～0.50，屬于中度多態(tài)性，只有CMS028位點的PIC小于0.25，屬于低度多態(tài)性（表3）。

3" "討論

3.1" "中國圓田螺轉(zhuǎn)錄組SSR分布

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘SSR多態(tài)性位點已較為常見，與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)具有方便快捷、成本低和效率高等優(yōu)點，是一種有效的分子標記開發(fā)方法。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)基于中國圓田螺全長轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)開發(fā)SSR位點的相關(guān)研究。因此，本研究基于PacBio Sequel II測序平臺，獲得26 312條Unigene序列，在5 294條Unigene中找到8 058個SSR位點，其發(fā)生頻率為20.12%，高于泥東風螺（B. lutosa）（6.86%）（熊鋼等，2020）和黃口荔枝螺（Thais luteostoma）（6.45%）（李威等，2015），遠低于扁玉螺（Glossaulax didyma）（45.34%）（盧瑋筱等，2018），這說明了不同物種間其轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的發(fā)生頻率不同。SSR位點的發(fā)生頻率存在差異，不僅與物種間的差異有關(guān)，還與組織、測序平臺、SSR位點的挖掘工具和搜索條件、以及數(shù)據(jù)庫的豐富程度等有關(guān)（Varshney et al，2005；Wei et al，2011；馬軍等，2020）。例如，張秀英等（2012）在櫛孔扇貝BES-SSR的開發(fā)中運用不同的檢索條件，最終得到的SSR數(shù)量不同，導(dǎo)致同一物種的SSR發(fā)生頻率不同。

3.2" "中國圓田螺SSR以二核苷酸重復(fù)類型為主

從SSR重復(fù)類型上看，中國圓田螺以二核苷酸重復(fù)為主，占比57.67%，這與已報道的扇貝“渤海紅”（Argopecten irradians “Bohaihong”）和墨西哥灣扇貝（A." irradians concentricus）（譚杰等，2018）研究結(jié)果相似；與文蛤（Meretrix meretrix）（以單核苷酸重復(fù)為主，33.89%）（田鎮(zhèn)等，2021）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）（以三核苷酸重復(fù)為主，45.87%）（倪守勝等，2018）等相比存在差異。這一差異可能與物種間的特異性、位點突變頻率及選擇性進化機制等有關(guān)（于愛清等，2019）。從SSR重復(fù)基元上看，中國圓田螺以（AC/GT）n為主，占總SSR位點數(shù)的34.82%，這與朱穎等（2023）對中華圓田螺、銅銹環(huán)棱螺（Bellamya aeruginosa）、多棱角螺（Angulyagra polyzonata）和湄公螺（Mekongia rivularia）4種代表性貝類的研究結(jié)果相符，均以二核苷酸重復(fù)基元（AC/GT）n為主。從SSR重復(fù)次數(shù)上看，中國圓田螺4～7次重復(fù)的SSR位點數(shù)量最多，且主要分布在二核苷酸重復(fù)序列上，與細角螺（Hemifusus ternatanus）（李清薈等，2013）重復(fù)次數(shù)集中在7～30次略有不同。Thao等（2013）發(fā)現(xiàn)SSR的重復(fù)次數(shù)在12次以上，則表明具有多態(tài)性SSR位點的比例就越高。中國圓田螺的SSR重復(fù)次數(shù)集中在4～7次，略低于其他物種SSR重復(fù)次數(shù)，說明SSR重復(fù)次數(shù)可能受到物種差異、編碼區(qū)和非編碼區(qū)的選擇壓力所影響。此外，本研究篩選到的22個SSR位點，有18個為二核苷酸重復(fù)類型，其余4個為三核苷酸重復(fù)類型，不僅證實了Dreisigacker等（2004）發(fā)現(xiàn)的低級重復(fù)單元多態(tài)性高于高級重復(fù)單元多態(tài)性這一推論，而且說明了從二核苷酸重復(fù)類型中篩選到具有多態(tài)性SSR位點的概率更高。

3.3" "廣西中國圓田螺群體遺傳多樣性

多態(tài)信息含量PIC是評價遺傳多樣性的一個關(guān)鍵指標，本研究中各位點PIC為0.247～0.844，平均值為0.547。根據(jù)Botstein等（1980）的劃分依據(jù)：PICgt;0.50為高度多態(tài)性，0.25lt;PIC≤0.50為中度多態(tài)性，PIC≤0.25為低度多態(tài)性，表明本研究開發(fā)的微衛(wèi)星標記具有高度多態(tài)性，能夠提供豐富的遺傳信息，且在中國圓田螺種群遺傳學研究中具有較高的實用性。雜合度是評估種群遺傳多樣性高低的重要指標之一，其中，觀測雜合度反映的是雜合子所占的比例，而期望雜合度反映的是隨機挑選2個等位基因出現(xiàn)雜合子的概率，因不易受樣本量的影響，所以能更好地反映種群遺傳多樣性水平（Appleyard amp; Ward，2006；Qin et al，2013）。本研究對基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的微衛(wèi)星引物進行篩選，并在廣西中國圓田螺群體中進行了遺傳多樣性分析，其平均等位基因數(shù)為4.636，平均觀測雜合度為0.286，平均期望雜合度為0.589，可看出觀測雜合度顯著低于期望雜合度，推測廣西中國圓田螺群體可能存在近親繁殖或雜合子缺失等問題。原因有以下2方面：（1）在田螺養(yǎng)殖群體中，長期采用“養(yǎng)繁一體”養(yǎng)殖模式，近親繁殖的情況極為普遍，使得養(yǎng)殖群體的雜合度遠低于野生群體（方軍等，2020）；（2）在進行PCR擴增時，未擴增的雜合子被當作純合子，導(dǎo)致雜合子數(shù)量減少，而純合子的數(shù)量增加（Kang et al，2013）；此外，非隨機交配、瓶頸效應(yīng)和隨機遺傳漂變等也導(dǎo)致群體中的雜合子缺失（莊振俊等，2022）。綜上所述，本研究基于中國圓田螺全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘的多態(tài)性微衛(wèi)星位點，在中國圓田螺的群體遺傳多樣性分析中取得較好的效果，具有一定的參考價值，證實了利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR位點的可行性。

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（責任編輯" "鄭金秀" "崔莎莎）

Feature Analysis and Marker Development of Microsatellites for Cipangopaludina Chinensis Based on Full-length Transcriptome Data

WEI Xiaokai1，2， ZHOU Kangqi2， ZOU Xinxi1，2， LIN Yong2， YE Hua1， LUO Hui1， QIN Junqi2，CHEN Zhong2， HUANG Yin2， DU Xuesong2， ZHANG Caiqun2， PAN Xianhui2

（1. Southwest University， Chongqing" "402460， P.R. China;

2. Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，Guangxi Aquatic Breeding Base， Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning" "530021， P.R. China）

Abstract：In this study， we developed polymorphic SSR markers for Cipangopaludina chinensis using high throughput sequencing and then screened the genomic microsatellite loci and analyzed their features. The aim of the study was to provide technical support for field snail germplasm utilization and breeding. The study was based on the full-length transcriptome data for C. chinensis， which was obtained through PacBio's SMRT sequencing. A total of 8 058 SSR loci were identified and 1-6 nucleotide SSR repetition types were observed. Of these， dinucleotide repeat SSRs were the most common with 4 647 SSR loci （57.67%）， followed by trinucleotide repeat SSRs with 1 274 SSR loci （15.81%）. The AC/GT motif was the primary repeat unit among dinucleotide motifs， accounting for 34.82% of the total SSR loci. Then， 192 pairs of primers were synthesized randomly to screen the polymorphic SSR primers using 10 different geographical populations of C. chinensis. A total of 22 pairs of polymorphic SSR primers were obtained， and the polymorphic SSR markers were used to analyze the genetic diversity of C. chinensis populations in different geographic regions of Guangxi Province. The amplification products of the 22 SSR markers were steady and 102 alleles were detected across all markers， with an average number of alleles （Na） of 4.636. The average observed heterozygosity （Ho） and expected heterozygosity （He） of the alleles were 0.286 and 0.589， respectively. The polymorphic information content （PIC） ranged from 0.247 to 0.844， with the average value of 0.547. Among the 22 SSR loci， 13 were determined as highly polymorphic loci （PIC gt; 0.50）， and 8 were moderately polymorphic loci （0.25 lt; PIC ≤ 0.50）， indicating high genetic diversity within the C. chinensis population. In conclusion， PacBio SMRT sequencing technology was an efficient means of developing SSR markers for C. chinensis， and the markers proved suitable for evaluating the C. chinensis resource.

Key words： Cipangopaludina chinensis；transcriptome；microsatellite；polymorphic marker

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFD2400700）；廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項資金項目（AA17204080-5）；廣西特色淡水魚產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（nycytxgxcxtd-2021-08）；廣西自然科學基金項目（2020GXNSFBA297067）；廣西科技基地與人才項目（AD21220010）。

作者簡介：韋小凱，1999年生，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。E-mail：2194742964@qq.com

共同第一作者：周康奇，1990年生，女，助理研究員，主要從事水產(chǎn)遺傳育種與資源增殖研究。E-mail：2472797247@qq.com

通信作者：潘賢輝。E-mail：panxhfisher@126.com