單細(xì)胞多組學(xué)揭示川崎病免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

[摘要]"川崎病（Kawasaki"disease，KD）是一種主要累及全身中小血管的急性發(fā)熱性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，嚴(yán)重影響臨床早期病情評(píng)估。免疫反應(yīng)參與該疾病的發(fā)生發(fā)展過程，免疫調(diào)節(jié)成為KD治療中最重要的環(huán)節(jié)之一。研究表明，免疫系統(tǒng)的過度激活在KD的發(fā)生發(fā)展過程中不可或缺。近年來，新興的單細(xì)胞多組學(xué)具備同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白質(zhì)組及代謝組等信息的能力。這項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步為深入探究免疫細(xì)胞的異質(zhì)性提供有力工具，有助于識(shí)別細(xì)胞的不同亞群，構(gòu)建詳盡的功能圖譜，促進(jìn)新型免疫生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，為疾病診斷和治療帶來新的可能。本文就單細(xì)胞多組學(xué)揭示KD免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述，為KD的早期診治提供更可靠、高效的依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]"川崎?。粏渭?xì)胞多組學(xué)；免疫；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類號(hào)]"R725""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.05.028

川崎?。↘awasaki"disease，KD）又稱黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，是主要影響5歲以下嬰幼兒的發(fā)熱性疾病。KD的主要特征為全身高炎癥狀態(tài)、免疫性血管炎及潛在冠狀動(dòng)脈損傷（coronary"artery"lesion，CAL），KD已成為兒童獲得性心臟病的最常見原因[1]。在KD急性期，若患兒未及時(shí)接受靜脈注射免疫球蛋白（intravenous"immunoglobulin，IVIg）治療，約20%的患兒可能出現(xiàn)CAL。盡管使用大劑量IVIg治療，CAL發(fā)生率仍高達(dá)5%，這與KD病因及免疫發(fā)病機(jī)制尚不明確、無法更早采取有效措施有關(guān)[2]。目前公認(rèn)KD是一種由感染導(dǎo)致易感兒童發(fā)生異常免疫反應(yīng)的綜合征，免疫復(fù)合物的產(chǎn)生激發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞增多。免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而造成器官損傷[3]。迄今為止，已有多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究揭示，KD免疫發(fā)病機(jī)制和冠狀動(dòng)脈免疫損傷機(jī)制涉及傳統(tǒng)免疫分子和新型單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)定。

流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)技術(shù)多基于已有信息和細(xì)胞標(biāo)志物。研究表明KD由機(jī)體免疫活化和細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)所致[4]。在KD患兒體內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)水平隨著炎癥細(xì)胞因子的大量釋放而顯著增加，進(jìn)而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并在后期造成CAL[5]。目前KD發(fā)病機(jī)制尚無定論。利用新型單細(xì)胞多組學(xué)從細(xì)胞自身基因和蛋白層面分析KD發(fā)病時(shí)免疫細(xì)胞的工作狀態(tài)，可從根本上揭示KD的免疫發(fā)病機(jī)制。

1""單細(xì)胞多組學(xué)概述

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷由初步探索到成熟應(yīng)用的發(fā)展歷程。單細(xì)胞測(cè)序可快速篩查與定量分析特定樣本，對(duì)免疫細(xì)胞表型和可塑性及細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行不同通量和覆蓋程度的深入研究，進(jìn)而從單細(xì)胞水平揭示免疫系統(tǒng)狀態(tài)[6]。單細(xì)胞多組學(xué)是一項(xiàng)可在同一細(xì)胞中同時(shí)測(cè)量多種組學(xué)數(shù)據(jù)的前沿技術(shù)。單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)包括用于DNA序列分析的單細(xì)胞DNA測(cè)序、用于基因表達(dá)分析的單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell"RNA"sequencing，scRNA-seq）、用于對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析并尋找其與病理生理學(xué)變化相關(guān)性的代謝組學(xué)、用于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組織的單細(xì)胞高通量染色體構(gòu)象測(cè)序、用于組蛋白修飾分析的單細(xì)胞核酸酶靶向切割和釋放、用于受體譜系多樣性和克隆譜分析的單細(xì)胞T細(xì)胞或B細(xì)胞受體測(cè)序等[7]。單細(xì)胞多組學(xué)通過同時(shí)整合轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組及其他組學(xué)等各種單模態(tài)組學(xué)，更真實(shí)地展現(xiàn)細(xì)胞的狀態(tài)和活性[8]。

作為最成熟的單細(xì)胞測(cè)序方法，通過將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與其他組學(xué)相結(jié)合研究基因表達(dá)與表型異質(zhì)性的相關(guān)性。在全基因組scRNA-seq的基礎(chǔ)上，多組學(xué)可通過細(xì)胞多路復(fù)用、細(xì)胞標(biāo)記和其他方法進(jìn)行多模態(tài)復(fù)用并增加通量[8]。隨著單細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步，研究多細(xì)胞生物如何從一個(gè)全能的單細(xì)胞發(fā)育而來，需要依賴單細(xì)胞與空間多組學(xué)方法，以實(shí)現(xiàn)在組織內(nèi)部對(duì)基因表達(dá)等信息的空間定位[9]。這些綜合技術(shù)包括基因組與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄組與表觀基因組的融合、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的聯(lián)合及其他多組學(xué)模型的集成。單細(xì)胞多組學(xué)給免疫學(xué)帶來更全面的本質(zhì)性變革，包括但不限于監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞在特定疾病環(huán)境下的相互作用、推測(cè)抗原與免疫受體間動(dòng)力學(xué)關(guān)系的復(fù)雜性、確定用于預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物等。

2""單細(xì)胞多組學(xué)在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

自身免疫性疾病是一類由于免疫系統(tǒng)失去對(duì)自身抗原的耐受性而引發(fā)組織損傷和炎癥反應(yīng)并最終導(dǎo)致靶器官損傷的慢性疾病[10]。病原微生物通過分子模擬、旁觀者激活和表位擴(kuò)展等不同機(jī)制參與自身免疫性疾病的發(fā)生和進(jìn)展過程[11]。自身免疫性疾病發(fā)病復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)難以闡明其機(jī)制，單細(xì)胞測(cè)序可更深層解釋免疫細(xì)胞在特定疾病下的相互作用，為其治療指明方向。

Ashton等[12]應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及1型糖尿病等疾病中轉(zhuǎn)錄水平的變化，指出樹突狀細(xì)胞與疾病的活動(dòng)程度相關(guān)，表明免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜可提高檢測(cè)疾病異質(zhì)性的能力，并指導(dǎo)復(fù)雜自身免疫性疾病治療方法的選擇。Culemann等[13]應(yīng)用scRNA-seq和光片三維熒光成像技術(shù)對(duì)健康和炎癥關(guān)節(jié)中不同亞型巨噬細(xì)胞的組成、來源及分化路徑進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)源自組織內(nèi)的CX3CR1+巨噬細(xì)胞亞群可在滑膜內(nèi)層構(gòu)建免疫屏障，有效保護(hù)關(guān)節(jié)并控制炎癥。Ahmed等[14]為研究細(xì)胞分辨率下雙重表達(dá)者的雙重表型，利用scRNA-seq技術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示雙重表達(dá)者在1型糖尿病患者體內(nèi)克隆擴(kuò)增，T細(xì)胞和B細(xì)胞的區(qū)隔化不是絕對(duì)的，這可能是導(dǎo)致自身免疫性疾病的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。綜上，單細(xì)胞多組學(xué)可推進(jìn)相關(guān)疾病免疫發(fā)病機(jī)制的深入研究及免疫制劑的精準(zhǔn)應(yīng)用。

3""單細(xì)胞多組學(xué)揭示KD免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

scRNA-seq作為最成熟且應(yīng)用范圍最廣的技術(shù)之一，不僅能夠加深人們對(duì)免疫系統(tǒng)多樣性及復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)，還可促進(jìn)新免疫細(xì)胞亞型的發(fā)現(xiàn)及免疫細(xì)胞發(fā)育路徑的重建。對(duì)KD而言，利用scRNA-seq及多組學(xué)技術(shù)可深入剖析KD急性期免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化、進(jìn)而揭示IVIg的治療機(jī)制，為其診斷及治療提供線索[15]。

3.1""動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多選用小鼠作為KD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。從組織學(xué)角度看，干酪乳桿菌細(xì)胞壁提取物（Lactobacillus"casei"cell"wall"extract，LCWE）引發(fā)的小鼠心血管損傷與KD患兒相關(guān)CAL相似。Marek-"Iannucci等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將LCWE注射到小鼠體內(nèi)，建立全身動(dòng)脈炎模型；通過分析LCWE小鼠模型腹主動(dòng)脈scRNA-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)的改變；通過有條件地敲除骨髓細(xì)胞中的肌醇需求酶1（inositol-requiring"enzyme"1，IRE1）或抑制IRE1核糖核酸酶活性，從基因水平上減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，顯著減少LCWE誘導(dǎo)心血管病變的形成，降低胱天蛋白酶-1活性，減少白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β的分泌。該研究證實(shí)KD血管炎小鼠模型中心血管病變的發(fā)病機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加相關(guān)，強(qiáng)調(diào)IRE1和核糖核酸酶活性作為潛在治療靶點(diǎn)的重要性。Porritt等[17]成功整合scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)，確定在KD發(fā)展過程中，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列和含熱蛋白結(jié)構(gòu)域受體3-IL-1β/IL-18軸是決定性的驅(qū)動(dòng)因子，這些新結(jié)構(gòu)可能與內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)，血管平滑肌細(xì)胞中IL-1受體的特異性缺失可顯著降低血管病變的嚴(yán)重程度。

3.2""臨床研究

研究者利用單細(xì)胞多組學(xué)揭示KD患兒關(guān)鍵細(xì)胞亞群的變化、基因表達(dá)特征，有助于進(jìn)一步闡明KD的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而找到更安全、更有效的靶向藥物。Geng等[18]通過scRNA-seq分析2例急性KD患兒與2名健康兒童單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典單核細(xì)胞、中間單核細(xì)胞和非經(jīng)典單核細(xì)胞亞群之間存在線性分化關(guān)系，并承載不同的生物學(xué)功能。Chen等[19]首次證明，伴有CAL的KD患兒存在細(xì)胞因子風(fēng)暴，并成功闡明其特征；KD合并CAL患兒存在主要由單核細(xì)胞和巨核細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子超家族成員和IL-1受體抗體的全身性上調(diào)引起的炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴。多數(shù)早期研究采用低通量技術(shù)進(jìn)行免疫分型，通常局限于對(duì)少數(shù)選定的細(xì)胞類型及其標(biāo)記物的分析，難以揭示免疫系統(tǒng)的異質(zhì)性。Xu等[20]首次將scRNA-seq和T細(xì)胞受體測(cè)序相結(jié)合，探索KD患兒接受IVIg治療前后單/雙受體T細(xì)胞的變化及潛在影響；發(fā)現(xiàn)患兒接受IVIg治療后雙受體T細(xì)胞比例顯著升高，這些細(xì)胞顯示出顯著的克隆擴(kuò)增趨勢(shì)及V基因使用的偏向性；IVIg治療前后雙受體T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)分析表明，這類T細(xì)胞，尤其是雙受體CD8"T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在KD病理及IVIg治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4""小結(jié)與展望

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，人們對(duì)疾病的研究逐漸由整體向單細(xì)胞水平深入，也使得多種測(cè)序技術(shù)的整合變得日益可行。鑒于兒童群體的特殊性，用于疾病研究的樣本組織較難獲得，單細(xì)胞多組學(xué)可很好地解決這一難題。根據(jù)組織樣本中細(xì)胞表達(dá)圖譜和特征性基因，尋找致病過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞靶點(diǎn)與疾病發(fā)展有關(guān)的新亞群，有助于剖析KD的免疫發(fā)病機(jī)制，為KD早期診治提供更可靠、高效的技術(shù)支持。目前，單細(xì)胞多組學(xué)應(yīng)用于KD還存在一定的局限性。除通量和成本等因素外，單細(xì)胞懸液制備是首要挑戰(zhàn)，分選組織樣品中的某些細(xì)胞群仍存在難度，且分離的樣本中存在部分死亡細(xì)胞，造成數(shù)據(jù)失真或缺失。近年來，擴(kuò)增過程中的偏差、測(cè)序時(shí)的噪聲及單細(xì)胞分離等難題隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展而逐步得到解決，這使得科學(xué)研究能更緊密地與臨床工作相結(jié)合，有助于發(fā)現(xiàn)更有效的診斷方法和治療手段，進(jìn)一步改善患者的預(yù)后。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–10–12）

（修回日期：2024–12–12）