FASTKDs在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的潛在意義

[摘要]"目的"分析非小細(xì)胞肺癌（non-small"cell"lung"cancer，NSCLC）中Fas活化激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-activated"kinase"domain-containing"proteins，F(xiàn)ASTKDs）的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性價(jià)值。方法"通過(guò)分析癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)中影響FASTKDs的體細(xì)胞突變情況。分析不同肺癌病理亞型中FASTKDs的mRNA表達(dá)水平。運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析評(píng)估FASTKDs在非小細(xì)胞肺癌樣本中特異性表達(dá)的預(yù)測(cè)意義。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time"quantitative"polymerase"chain"reaction，RT-qPCR）和Western"blot法分析FASTKDs在人NSCLC細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果"與正常肺組織相比，肺腺癌（lung"adenocarcinoma，LUAD）組織中的所有FASTKDs均為高表達(dá)（Plt;0.05），而肺鱗癌組織中只有FASTKD1、FASTKD3、FASTKD4和FASTKD5表達(dá)升高（Plt;0.05）。在所有NSCLC及LUAD病理亞型患者中，只有FASTKD1和FASTKD3"mRNA表達(dá)水平升高與患者較高的總體生存期（overall"survival，OS）相關(guān)（Plt;0.05），但在NSCLC患者中FASTKD2和FASTKD4"mRNA表達(dá)水平升高與患者OS的降低相關(guān)（Plt;0.05）。與正常人支氣管上皮細(xì)胞相比，人NSCLC細(xì)胞中FASTKD1-5的mRNA和蛋白表達(dá)量增加（Plt;0.05）。結(jié)論"不同的FASTKDs表達(dá)情況與NSCLC患者的預(yù)后相關(guān)，是NSCLC的潛在腫瘤標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]"Fas活化激酶結(jié)構(gòu)域蛋白；非小細(xì)胞肺癌；總體生存期

[中圖分類號(hào)]"R734.2""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.05.006

Potential"significance"of"FASTKDs"in"prognosis"of"non-small"cell"lung"cancer

GU"Chao，"YANG"Qi

Department"of"Respiratory"Medicine，"the"First"Hospital"of"Jiaxing，"Jiaxing"314000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"analyze"the"correlation"between"the"expression"of"fas-activated"kinase"domain-containing"proteins"（FASTKDs）"and"the"prognosis"of"non-small"cell"lung"cancer"（NSCLC）"and"its"predictive"value."Methods"By"analyzing"the"somatic"mutation"in"Catalog"of"Somatic"Mutations"in"Cancer"database，"the"effect"of"FASTKDs"was"analyzed."The"mRNA"expression"level"of"FASTKDs"in"different"pathological"subtypes"of"lung"cancer"was"analyzed"retrospectively."Kaplan-Meier"survival"analysis"was"used"to"evaluate"the"predictive"significance"of"FASTKDs"specific"expression"in"NSCLC"samples.Real-time"quantitative"polymerase"chain"reaction"（RT-qPCR）"and"Western"blot"were"used"to"verify"the"mRNA"and"protein"expression"of"FASTKDs"in"human"NSCLC"cells"in"vitro."Results"FASTKDs"in"lung"adenocarcinoma"（LUAD）"were"highly"expressed（Plt;0.05），"while"only"FASTKD1，"FASTKD3，"FASTKD4"and"FASTKD5"in"lung"squamous"cell"carcinoma"were"highly"expressed"（Plt;0.05）."In"all"patients"with"NSCLC"and"LUAD"pathological"subtypes，"only"the"increased"expression"levels"of"FASTKD1"and"FASTKD3"mRNA"were"significantly"correlated"with"the"higher"overall"survival"（OS）"（Plt;0.05），"but"the"increased"expression"levels"of"FASTKD2"and"FASTKD4"mRNA"in"NSCLC"patients"were"correlated"with"the"decreased"OS"（Plt;0.05）."Compared"with"normal"human"bronchial"epithelial"cells，"the"mRNA"and"protein"expression"of"FASTKD1-5"in"human"NSCLC"cells"increased"significantly"（Plt;0.05）."Conclusion"Different"expression"of"FASTKDs"is"related"to"the"prognosis"of"NSCLC"patients"and"is"a"potential"tumor"marker"of"NSCLC.

[Key"words]"Fas-activated"kinase"domain-containing"proteins;"Non-small"cell"lung"cancer;"Overall"survival

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，小細(xì)胞肺癌（small"cell"lung"cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small"cell"lung"cancer，NSCLC）分別占肺癌類型的15%和85%[1-2]。肺癌的治療已有顯著進(jìn)步，但患者5年總生存率仍很低。Fas活化激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（fas-activated"kinase"domain-containing"proteins，F(xiàn)ASTKDs）家族成員對(duì)轉(zhuǎn)錄后線粒體中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)非常重要。Fas活化激酶及其同源FASTKD1～5是結(jié)構(gòu)相似的RNA結(jié)合蛋白，在控制線粒體RNA方面具有不同的功能，包括信使RNA的加工、成熟、核糖體裝配和翻譯[3]。FASTKDs在胰腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中有較多研究，但在肺癌中研究甚少[4]。研究表明FASTKD4在肺癌組織中的表達(dá)顯著增加，通過(guò)干擾DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物3、小窩蛋白-1和核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2的調(diào)控而在肺癌的發(fā)生中發(fā)揮作用[5]。然而，F(xiàn)ASTKDs不同表達(dá)水平在NSCLC患者預(yù)后預(yù)測(cè)方面未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討FASTKDs在NSCLC中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性預(yù)測(cè)價(jià)值，為肺癌預(yù)后腫瘤標(biāo)志物研究提供參考。

1""資料與方法

1.1""基因獲取與分析

從癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Catalogue"of"Somatic"Mutations"in"Cancer，COSMIC）官方網(wǎng)站（https：//"cancer.sanger.ac.uk/cosmic/）下載FASTKDs在基因突變和融合、基因組重排及拷貝數(shù)變化等的公共數(shù)據(jù)信息及臨床病理數(shù)據(jù)[6]。共有3168例肺癌樣本納入研究，其中NSCLC樣本1925例，肺腺癌（lung"adenocarcinoma，LUAD）樣本719例，肺鱗癌（lung"squamous"cell"carcinoma，LUSC）樣本524例。通過(guò)Oncomine（https：//www.oncomine.org/）分析FASTKDs"mRNA在肺癌不同病理亞型和正常組織中的差異性表達(dá)[7]。采用Kaplan-Meier分析評(píng)估FASTKD1～5在NSCLC標(biāo)本中表達(dá)水平與患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用Graphpad"Prism"9.0軟件繪制生存曲線。

1.2""細(xì)胞培養(yǎng)

正常人支氣管上皮細(xì)胞系（BEAS-2B細(xì)胞）和人NSCLC細(xì)胞系（H1299細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。在37℃、5%"CO2條件下，采用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3""實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)與Western"blot法檢測(cè)

采用Trizol法提取BEAS-2B細(xì)胞和H1299細(xì)胞的總RNA，根據(jù)GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)利用總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time"quantitative"polymerase"chain"reaction，RT-qPCR）檢測(cè)FASTKD1～5"mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。通過(guò)2?ΔΔCt分析RT-qPCR數(shù)據(jù)獲得相對(duì)基因表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。FASTKD1～5基因引物序列見(jiàn)表1。

提取BEAS-2B細(xì)胞和H1299細(xì)胞的總蛋白，將相同量的20"μg蛋白在100℃下加熱10min變性，在8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺中電泳分離。將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene"fluoride，PVDF）膜上后置于TBS-T中，在搖床上室溫孵育封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。將1：1000稀釋的抗FASTKD1～5一抗在4℃下與PVDF膜孵育過(guò)夜。后將PVDF膜與1：2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶二抗室溫孵育1"h。最后采用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并攝像，圖像灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將各目的蛋白的吸光度值與β-actin內(nèi)參條帶吸光度值的比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad"Prism"9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，NSCLC中FASTKD1～5基因差異性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系采用log-rank檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""不同F(xiàn)ASTKDs"mRNA在肺癌病理亞型中的表達(dá)差異比較

肺癌組織標(biāo)本中沒(méi)有檢測(cè)到易位、缺失、插入，COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)中FASTKDs基因的序列或拷貝數(shù)沒(méi)有明顯的改變，表明突變穩(wěn)定。與正常肺組織比較，LUAD組織中的所有FASTKDs均為高表達(dá)（Plt;0.05），而LUSC組織中只有FASTKD1、FASTKD3、FASTKD4和FASTKD5表達(dá)升高（Plt;0.05）。

2.2""FASTKDs的差異表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系分析

在所有NSCLC及LUAD病理亞型患者中，只有FASTKD1"mRNA和FASTKD3"mRNA表達(dá)水平升高與患者較高的總體生存期（overall"survival，OS）顯著相關(guān)。同時(shí)，在NSCLC患者中FASTKD2"mRNA和FASTKD4"mRNA表達(dá)水平的升高與患者OS的降低相關(guān)。在LUAD病理亞型患者中，F(xiàn)ASTKD4"mRNA表達(dá)升高與OS降低顯著相關(guān)，見(jiàn)圖1。

2.3""FASTKDs"mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)

與BEAS-2B細(xì)胞比較，H1299細(xì)胞中FASTKD1～5的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量顯著增加（Plt;0.05），見(jiàn)圖2、圖3。

3""討論

肺癌因其高發(fā)病率和高死亡率給患者和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)[8]。Ghezzi等[9]研究表明線粒體中FASTKDs家族成員FASTKD2，突變是介導(dǎo)人類線粒體相關(guān)疾病的原因。研究證實(shí)FASTK蛋白位于線粒體基質(zhì)中，并調(diào)節(jié)線粒體中基因的表達(dá)[10]。在人類線粒體DNA中有37個(gè)基因是氧化磷酸化所必需的，這些基因表達(dá)的變化與疾病和衰老過(guò)程有關(guān)[11]。FASTKD1和線粒體DNA間存在部分重疊，表明FASTKD1和線粒體RNAs在轉(zhuǎn)錄后不久可相互作用[12-13]。在腹膜、肺和食管的惡性腫瘤中，F(xiàn)ASTKD1表達(dá)水平與復(fù)發(fā)和侵襲的可能性間存在關(guān)聯(lián)[14]。

本研究表明在NSCLC和LUAD患者中FASTKD1"mRNA表達(dá)水平升高與患者較高的OS有顯著相關(guān)性。FASTKD2在線粒體呼吸和RNA加工中具有獨(dú)特功能，并與線粒體轉(zhuǎn)錄物相互作用[15]。FASTKD2與線粒體16S"rRNA結(jié)合，這對(duì)線粒體39S核糖體亞單位的組裝至關(guān)重要[4]。本研究顯示FASTKD2在LUAD患者中呈高表達(dá)，但與患者OS間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。然而，F(xiàn)ASTKD2"mRNA表達(dá)量增加與NSCLC患者的OS降低有關(guān)。FASTKD3是線粒體氧化磷酸化的必需蛋白，同時(shí)在控制各種分子的mRNA穩(wěn)定性方面具有重要功能[16]。本研究在LUAD和LUSC患者中FASTKD3呈高表達(dá)。但在所有NSCLC及LUAD病理亞型患者中，F(xiàn)ASTKD3"mRNA表達(dá)水平升高與患者較高的OS顯著相關(guān)。FASTKD4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-調(diào)節(jié)因子4，是線粒體RNA功能的重要調(diào)節(jié)因子，與多種類型的腫瘤有關(guān)[15]。本研究在LUAD、LUSC和NSCLC患者組織中FASTKD4高表達(dá)。但是，在NSCLC患者中FASTKD4"mRNA表達(dá)水平的升高與患者OS的降低相關(guān)。FASTKD5調(diào)節(jié)幾乎所有線粒體編碼的mRNAs的豐度[15]。本研究在LUAD和LUSC患者組織中FASTKD5"mRNA表達(dá)增加。FASTKD5在體外H1299細(xì)胞中呈高表達(dá)。然而，F(xiàn)ASTKD5的表達(dá)和NSCLC預(yù)后間無(wú)相關(guān)性。

綜上，NSCLC患者中FASTKD2"mRNA表達(dá)的增加有可能作為降低OS的預(yù)后標(biāo)志。盡管本研究證實(shí)人H1299細(xì)胞中FASTKD1～5的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高，但FASTKDs表達(dá)與NSCLC預(yù)后相關(guān)的潛在分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–10–28）

（修回日期：2024–12–23）