羥基磷灰石–蟛蜞菊內(nèi)酯聯(lián)合促成骨分化作用

[摘要]"目的"探討羥基磷灰石–蟛蜞菊內(nèi)酯（hydroxyapatite-wedelolactone，Hap-Wed）聯(lián)合的體外釋藥行為及促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone"marrow"mesenchymal"stem"cells，BMSCs）成骨分化作用。方法"利用色譜技術(shù)檢測Hap-Wed融合材料體外釋藥行為。細(xì)胞連續(xù)傳至第3代后分為：①對照組：完全培養(yǎng)基；②Os組：完全培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)劑（1mmol/L地塞米松、10mmol/L維生素C、1mol/L"β-甘油磷酸鈉）；③Wed組：完全培養(yǎng)基中加入1μg/ml"Wed和成骨誘導(dǎo)劑；""""""""④Hap-Wed組：完全培養(yǎng)基中加入1μg/ml"Wed、成骨誘導(dǎo)劑及Hap。采用堿性磷酸酶（alkaline"phosphates，ALP）活性實(shí)驗(yàn)、茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time"quantitative"polymerase"chain"reaction，RT-qPCR）檢測骨鈣素、Osterix和Runx2的基因表達(dá)情況，分析Hap-Wed對BMSCs成骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果"Hap-Wed融合材料可緩慢釋放藥物，Hap-Wed組與對照組比較，ALP染色陽性數(shù)量、鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量均顯著增加。Hap-Wed組骨鈣素、Osterix和Runx2的基因表達(dá)提高。結(jié)論"Hap-Wed融合材料可緩慢、有效刺激成骨細(xì)胞分化，可為今后蟛蜞菊內(nèi)酯的載體材料發(fā)展提供很好的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]"羥基磷灰石；蟛蜞菊內(nèi)酯；成骨分化；骨質(zhì)疏松癥

[中圖分類號]"R285.5"""nbsp;""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.05.001

Effect"of"hydroxyapatite"and"wedelolactone"on"osteogenic"differentiation

ZHU"Di1，"CHEN"Guangming1，"LIU"Yanqiu2

1.Department"of"General"Medicine，"Affiliated"Jinhua"Hospital，"Zhejiang"University"School"of"Medicine，"Jinhua"321000，"Zhejiang，"China;"2.College"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Shandong"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Jinan"250355，"Shandong，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"in"vitro"drug"release"behavior"of"hydroxyapatite-wedelolactone（Hap-Wed）"and"its"effect"on"promoting"osteogenic"differentiation"of"bone"marrow"mesenchymal"stem"cells"（BMSCs）."Methods"The"in"vitro"release"behavior"of"Hap-Wed"fusion"materials"was"detected"by"chromatographic"technique."After"the"cells"were"passed"continuously"up"to"the"third"generation，"they"were"divided"into："①"control"group："complete"medium;"②"Os"group："osteogenic"inducer"（1mmol/L"dexamethasone，"10mmol/L"vitamin"C，"1mol/L"β-glycerol"phosphate）;"③"Wed"group："1μg/ml"Web"and"osteogenic"inducer"were"added"to"the"complete"medium;"④"Hap-Web"group："1"μg/ml"Web，"osteogenic"inducer"and"Hap"were"added"to"the"complete"medium."Alkaline"phosphates"（ALP）"activity"assay，"alizarin"red"S"staining"assay，"real-time"quantitative"polymerase"chain"reaction"（RT-qPCR）"detection"of"osteocalcin，"Osterix"and"Runx2"gene"expression，"analysis"of"Hap-Wed"on"BMSCs"osteoblast"differentiation."Results"Hap-Wed"fusion"material"released"the"drug"slowly."Compared"with"control"group，"the"number"of"ALP"staining"and"the"number"of"calcified"nodules"increased"significantly"in"Hap-Wed"experimental"group."The"Hap-Wed"experimental"group"increased"gene"expression"of"osteocalcin，"Osterix"and"Runx2."Conclusion"Hap-Wed"fusion"material"can"slow"and"effective"stimulation"of"osteoblast"differentiation，"which"may"provide"a"promising"application"prospect"for"the"future"development"of"the"carrier"material.

[Key"words]"Hydroxyapatite;"Wedelolactone;"Osteogenic"differentiation;"Osteoporosis

骨是人體中的一種動態(tài)器官，主要通過成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收來保持動態(tài)平衡，一旦動態(tài)平衡被打破，就容易導(dǎo)致包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的骨疾病[1]。隨著中國老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病人數(shù)也處于上升趨勢，同時，骨質(zhì)疏松性骨折患者的預(yù)后較差[2-3]。滋陰補(bǔ)腎經(jīng)典中藥墨旱蓮有補(bǔ)益肝腎、滋陰止血、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)之功效。研究表明墨旱蓮相關(guān)提取物及組分有增強(qiáng)體外成骨細(xì)胞生成、抑制破骨細(xì)胞作用，且能增強(qiáng)去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠新骨形成的作用[4]。蟛蜞菊內(nèi)酯（wedelolactone，Wed）有較好的抗骨質(zhì)疏松作用，但Wed在血漿中的濃度較低且不能在缺損骨中保持適當(dāng)濃度[5]。納米羥基磷灰石（hydroxyapatite，Hap）是天然骨的主要組成成分，含有大量人體必需的鈣、磷等微量元素，有很好的生物相容性。Hap在人體中，經(jīng)過體液作用，會將材料內(nèi)部的鈣、磷元素有效游離被機(jī)體吸收，有誘導(dǎo)骨細(xì)胞生長的作用，與骨組織直接作用形成良好的骨性結(jié)合材料，是一類可完全與生物體骨骼牙齒結(jié)合的生物陶瓷，是理想的硬組織修復(fù)、替換材料，已廣泛應(yīng)用于椎骨替換、骨缺損修復(fù)等[6]。本研究采用化學(xué)合成法和冷凍干燥技術(shù)仿生構(gòu)建Hap-Wed骨修復(fù)融合材料，旨在研究Hap與Wed融合后，Wed的體外釋藥行為及促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

1""材料與方法

1.1""實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠，雌性，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（遼）2019-0007，8周齡，體質(zhì)量20～25g，清潔度SPF級，大連醫(yī)科大學(xué)SPF中心提供。

1.2""實(shí)驗(yàn)材料與試劑

Wed由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供，純度gt;98%。Hap樣品通過化學(xué)沉淀法合成。將0.03mol"Ca（NO3）2·4H2O和0.018mol的（NH4）2HPO4分別溶解在300ml和200ml去離子水中，溶液pH值用硝酸調(diào)至2。再將兩種溶液混合，用NH3·H2O將混合溶液pH值調(diào)至10。Hap樣品在過飽和溶液中成核和生長。再將懸浮液密封于廣口瓶，60℃下在水浴中保持4h。將所得的渾濁液離心分離，用去離子水洗滌數(shù)次直至濾液pH值為7。牛血清（美國Gibco公司）；L-DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；RT-qPCR試劑盒等（日本Takara"Bio公司）；堿性磷酸酶（alkaline"phosphates，ALP）試劑盒（美國Sigma-"Aldrich公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；茜素紅（中國Solarbio公司）；間充質(zhì)干細(xì)胞特異性梯度溶液（天津昊陽生物制造公司）；色譜級乙腈（美國Sigma-Aldrich公司）；分析級冰醋酸（美國Sigma-"Aldrich公司）。

1.3""小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone"marrow"mesenchymal"stem"cells，BMSCs）的分離培養(yǎng)方法與分組

從8周齡BALB/c小鼠中抽吸小鼠骨髓，使用間充質(zhì)干細(xì)胞特異性梯度溶液得到間充質(zhì)干細(xì)胞。加入2ml胎牛血清和2ml"PBS，室溫下340g離心20min。將中間層間充質(zhì)干細(xì)胞PBS洗滌后1500轉(zhuǎn)/min離心5min，重懸于含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基中，置于無菌37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。3d后，根據(jù)增殖潛力及對組織培養(yǎng)皿附著力的不同，進(jìn)一步將間充質(zhì)干細(xì)胞與造血細(xì)胞分離，連續(xù)培養(yǎng)6～7d，細(xì)胞融合度達(dá)到90%后用于正式試驗(yàn)[5]。細(xì)胞連續(xù)傳至第3代后分為：①對照組：完全培養(yǎng)基；②Os組：完全培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)劑（1mmol/L地塞米松、10mmol/L維生素C、1mol/L"β-甘油磷酸鈉）；③Wed組：完全培養(yǎng)基中加入1μg/ml"Wed和成骨誘導(dǎo)劑；④Hap-Wed組：完全培養(yǎng)基中加入1μg/ml"Wed、成骨誘導(dǎo)劑及Hap。培養(yǎng)基每3d更換1次。

1.4""檢測方法

安捷倫HPLC色譜系統(tǒng)，色譜柱為5μm，4.6mm×"150mm，二極管陣列檢測器，流動相為乙腈-1%乙酸水，梯度洗脫為0～10min（35∶65），流速1.0ml/min，柱溫35℃，檢測波長249nm，進(jìn)樣量20μl。精密稱取Wed"5mg，加入5ml無水甲醇配置成質(zhì)量濃度為1g/L的Wed儲存液，依次稀釋成100、50、10、1、0.1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，4℃儲存?zhèn)溆谩＞_稱量Hap顆粒100mg，沉浸在濃度為100μmol/L、200μmol/L的Wed中。放置過夜，凍干蒸發(fā)液體。將得到的的顆粒溶解于1ml"PBS溶液中，放置于37℃、15轉(zhuǎn)/min的恒溫空氣搖床中。連續(xù)震蕩后去上清，溶于1ml乙腈溶液中。將乙腈溶液15000g下超速離心15min，取上清液，測定峰面積，進(jìn)樣量20μl。取3代內(nèi)生長良好BMSCs以6×103個細(xì)胞/孔的密度均勻鋪埋于96孔板中，分為對照組、Os組、Wed組、Hap-Wed組，邊緣孔內(nèi)加入無菌水封邊，其余組用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，各組分別加入對應(yīng)藥物，每組3個重復(fù)孔，培養(yǎng)基每4d更換一次培養(yǎng)液，分化到9d后的細(xì)胞用ALP染色試劑盒染色，并在顯微鏡下觀察及計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目。取3代內(nèi)生長良好BMSCs以5×104個細(xì)胞/孔的密度均勻鋪埋于24孔板中，分為對照組、Os組、Wed組、Hap-Wed組，邊緣孔內(nèi)加入無菌水封邊，其余組用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，各組分別加入對應(yīng)藥物，每組3個重復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)21d后用95%戊二醛固定10min，去離子水洗滌2次，室溫下用2%茜素紅（pH值4.1）將細(xì)胞染色15min，并用去離子水洗滌3次。將茜素紅S染色的培養(yǎng)物進(jìn)一步與100mmol/L氯化十六烷基吡啶一起溫育1h，以溶解鈣并將鈣結(jié)合的茜素紅釋放到溶液中[6]。

使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取RNA，合成cDNA模板，進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增40個循環(huán)：95℃初始變性10min，加上50個循環(huán)的95℃"15s，然后60℃"1min[9]。以β-actin為相對內(nèi)參，對mRNA分析。使用引物：小鼠β-actin：正向5’-GTA"CGC"CAA"CAC"AGT"GCT"G-3’；反向5’-CGT"CAT"ACT"CCT"GCT"TGC"TG-3’。mRunx2，正向5’-GCC"GGG"AAT"GAT"GAG"AAC"TA-3’；反向5’-GGT"GAA"ACT"CTT"GCC"TCG"TC-3。m骨鈣素：正向5’-GCC"ATC"ACC"CTG"TCT"CCT"AA-3’；反向5’-GCT"GTG"GAG"AAG"ACA"CAC"GA-3’。mOsterix：正向5’-GGA"GGT"TTC"ACT"CCA"TTC"CA-3’；反向5’-TAG"AAG"GAG"CAA"GGG"GAC"AGA-3’。

1.5""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""Hap樣品的HRTEM表征

通過高分辨率透射電子顯微鏡技術(shù)表征所得Hap樣品的結(jié)晶度和形態(tài)，Hap樣品的優(yōu)選生長取向，樣品顯示出棒狀形態(tài)，有很好的優(yōu)選生長取向，典型的長度為20～30nm。

2.2""Hap-Wed釋放曲線

Wed從Hap材料中迅速大量釋放，至第12h有50%～70%的藥物釋放，之后以持續(xù)低速釋放，7d后依舊有部分藥物留存在Hap材料中，見圖1。

2.3""Hap-Wed對BMSCs成骨細(xì)胞的作用

與Wed組比較，Hap–Wed組孵育9d后ALP活性明顯增強(qiáng)。不同藥物處理BMSCs"21d后，Hap–Wed組茜素紅S染色最明顯，骨礦化程度最強(qiáng)，見圖2。當(dāng)各組藥物連續(xù)孵育9d后，與Wed組和Os組比較，Hap–Wed組骨鈣素、Osterix和Runx2"mRNA的表達(dá)提升。

3""討論

中醫(yī)根據(jù)“腎主骨，生髓”等相關(guān)理論，常使用相關(guān)補(bǔ)腎中藥對骨萎等疾病進(jìn)行治療。根據(jù)當(dāng)前研究進(jìn)展，主要用于骨質(zhì)疏松的相關(guān)補(bǔ)腎中藥有淫羊藿、肉蓯蓉、杜仲、黃芪、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、墨旱蓮、女貞子，另外包括仙靈骨葆等在內(nèi)的相關(guān)復(fù)方同樣有較好治療骨質(zhì)疏松疾病的作用[7-9]。骨穩(wěn)態(tài)主要是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收平衡。成骨細(xì)胞成骨不足或破骨細(xì)胞過度吸收都可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等代謝性骨紊亂疾病的原因。理想的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物具有既可增加骨生成、也可阻止骨骼退化的雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)前臨床治療方法較為局限，可能是由于當(dāng)前臨床藥物的作用靶點(diǎn)未能將骨質(zhì)降解和骨形成分離。因此，挖掘有同時調(diào)節(jié)骨吸收及骨形成的藥物是當(dāng)前骨質(zhì)疏松最新的研究重點(diǎn)[4-5]。

墨旱蓮作為補(bǔ)腎中藥已有幾千年的歷史。墨旱蓮主要含黃酮類、異黃酮類、β-谷甾醇、豆甾醇、香豆素醚等成分，這些成分經(jīng)過機(jī)體代謝作用可轉(zhuǎn)化為甾類激素，這是墨旱蓮治療骨質(zhì)疏松的共同物質(zhì)基礎(chǔ)。Wed是墨旱蓮的主要成分。研究證明Wed通過促進(jìn)成骨細(xì)胞Wnt/GSK3β/β-catenin信號通路和抑制破骨細(xì)胞NF-κB/c-fos/NFATc1通路對骨質(zhì)疏松治療有雙向調(diào)節(jié)作用，同時，Wed可通過提高成骨細(xì)胞活性和抑制破骨細(xì)胞活性來防止去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨質(zhì)流失，是理想的用于骨質(zhì)疏松雙向調(diào)節(jié)藥物[4，10]。

雖然Wed可很好治療骨質(zhì)疏松相關(guān)骨疾病，但是存在Wed在血漿中的濃度較低且不能在缺損骨中保持適當(dāng)濃度的問題。Hap可有效控制藥物的釋放過程，是一種理想的制劑載體。另外，Hap是人體硬組織的一種成分，含有大量的鈣和磷，有很好的骨引導(dǎo)性和生物相容性，常用于臨床相關(guān)骨疾病治療[11-14]。本研究Hap-Wed組表現(xiàn)出更高的ALP活性，表明Hap與Wed聯(lián)合使用對增加ALP活性發(fā)揮協(xié)同作用。另外，最新研究已證實(shí)Hap有微納米雜化結(jié)構(gòu)，可作為藥物遞送系統(tǒng)的載體，有效增加BMSCs細(xì)胞成骨能力[15]。

骨鈣素由成骨細(xì)胞分泌，與骨礦化及鈣離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)，通常用作骨形成過程的標(biāo)記。Hap-Wed聯(lián)合應(yīng)用可對ALP活性及骨礦化水平產(chǎn)生明顯作用。研究表明天然Hap和合成Hap可促進(jìn)MG63細(xì)胞成骨標(biāo)志物的表達(dá)，同樣Hap-Wed聯(lián)合應(yīng)用也可增強(qiáng)Osterix"mRNA表達(dá)。另外，Runx2作為主要的成骨轉(zhuǎn)錄因子參與成骨細(xì)胞成熟過程，還可轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt信號傳導(dǎo)及介導(dǎo)BMSCs細(xì)胞分化作用[16]。Hap-Wed聯(lián)合作用引起骨鈣蛋白，Osterix和Runx2的不同表達(dá)可在一定程度上解釋Hap-Wed對ALP和礦化水平有較好活性。

綜上，Hap對Wed有良好的緩釋性能，本研究通過ALP實(shí)驗(yàn)、茜素紅S染色、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Hap-Wed對BMSCs成骨分化有協(xié)同作用，Hap-"Wed聯(lián)合材料可能是一種理想的骨修復(fù)納米材料。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–11–19）

（修回日期：2024–12–26）