聚苯乙烯納米塑料對公鴨睪丸的損傷作用

摘 要：

旨在揭示聚苯乙烯納米塑料（PS-NPs）的雄性生殖毒性，本試驗以雄性紹興鴨為研究對象，探究了PS-NPs對鴨睪丸組織的影響。試驗將32只紹興公鴨隨機分為空白Control組、L-NPs組、M-NPs組和H-NPs組共4組（每組8只），分別飼喂飼料濃度為0、1、10、100 mg·kg-1 的 PS-NPs。45 d稱重后致死，采集鴨的睪丸，計算睪丸系數(shù)，HE染色觀察各組睪丸組織病理變化；試劑盒檢測睪丸組織中丙二醛（MDA）含量以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性；Western blot檢測氧化損傷相關(guān)蛋白Nrf2、NQO1和HO-1的表達水平；實時熒光定量PCR檢測炎癥相關(guān)基因TNF-α和IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與Control組相比，隨著PS-NPs處理濃度升高，H-NPs組睪丸系數(shù)顯著降低（P＜0.05）；病理學結(jié)果顯示，曲精小管間的間隙不斷變大，間質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少，曲精小管管壁結(jié)構(gòu)模糊；M-NPs組和H-NPs組睪丸組織MDA含量顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）升高，GSH、SOD和CAT活性顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下降；Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，M-NPs組和H-NPs組Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下降；實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Control組相比，M-NPs組和H-NPs組TNF-α、IL-6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）升高。結(jié)果表明，PS-NPs能引起紹興鴨睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、炎癥和氧化應激，并且其損傷程度與PS-NPs暴露劑量呈正相關(guān)；PS-NPs引起的炎癥反應與Nrf2/HO-1信號通路密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：

聚苯乙烯納米塑料；鴨；睪丸；氧化應激；炎癥

中圖分類號：X503.22；S859.8

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0925-09

收稿日期：2024-03-26

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)支持項目（2023YFD1801100）；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃資助（D18007）；江蘇高校優(yōu)秀學科建設工程資助項目（PAPD）；江蘇?。〒P州大學）研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃項目（SJCX23-2066）

作者簡介：顧雅怡（1998-），女，江蘇無錫人，碩士生，主要從事營養(yǎng)代謝病與中毒病研究，E-mail：guyy0815@163.com

*通信作者：卞建春，主要從事營養(yǎng)代謝病與中毒病研究，E-mail：jcbian@yzu.edu.cn

Damaging Effect of Polystyrene Nanoplastics on the Testicles of Male Ducks

GU" Yayi1，2， XIA" Sugan1， LIU" Pengli1， ZOU" Hui1， GU" Jianhong1， YUAN" Yan1， LIU" Xuezhong1，

LIU" Zongping1， BIAN" Jianchun1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：

In order to reveal the male reproductive toxicity of polystyrene nanoplastics （PS-NPs）， this study investigated the effects of PS-NPs on duck testicular tissue using male Shaoxing ducks. In this study， 32 Shaoxing ducks were randomly divided into 4 groups（8 ducks in each group）， namely， blank Control group， L-NPs group， M-NPs group， and H-NPs group ， and were fed with PS-NPs at dietary concentrations of 0， 1， 10 and 100 mg·kg-1. After 45 days， the body weight of the ducks were weighed， the testes of the ducks were collected， testis coefficients were calculated， the pathological changes of testis tissues of each group were observed by HE staining. The testicular tissues were tested for malondialdehyde （MDA） content and the activities of glutathione peroxidase （GSH-Px）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） by kit. The expression levels of oxidative damage-related proteins Nrf2， NQO1 and HO-1 were detected by Western blot. The mRNA levels of inflammation-related genes TNF-α and IL-6 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that the testicular coefficient was significantly reduced in the H-NPs group with the increase of PS-NPs treatment concentration compared with the control group （P＜0.05）. The pathological results showed that the interstices between the convoluted seminiferous tubules were continuously enlarged， the number of interstitial cells was gradually reduced， and the structure of convoluted tubule wall was blurred. The testicular tissues of the M-NPs group and H-NPs group had a significant （P＜0.05） and highly significant （P＜0.01） increase in the content of MDA. The activity of GSH， SOD and CAT decreased significantly （P＜0.05） and very significantly （P＜0.01）. Western blot results showed that the protein expression levels of Nrf2， NQO1 and HO-1 present a trend of significant （P＜0.05） or highly significant decrease （P＜0.01） in the M-NPs group and H-NPs group. The real-time fluorescence quantitative PCR results showed that the mRNA transcript levels of TNF-α and IL-6 genes were significantly （P＜0.05） and highly significant increased （P＜0.01）. The results showed that PS-NPs could cause morphological and structural changes， inflammation and oxidative stress in the testicular tissues of Shaoxing ducks. The degree of damage was positively correlated with the dose of PS-NPs exposure. The inflammatory response caused by PS-NPs may be closely related to the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Key words：

polystyrene nanoplastics; duck; testicle; oxidative stress; inflammation

*Corresponding author：" BIAN Jianchun， E-mail： jcbian@yzu.edu.cn

作為一種具有特殊性質(zhì)的新興污染物，微塑料的環(huán)境和生物危害性越來越受到人們的關(guān)注。有研究表明，陸地微塑料經(jīng)過大氣沉積、雨水沖刷和地表徑流等遷移至淡水環(huán)境［1］，我國長江［2］、珠江［3］和黃河［4］流域等淡水環(huán)境均存在較嚴重的微塑料污染的情況。微塑料不僅嚴重污染環(huán)境，還可進入動物機體，危害動物健康。粒徑較小的微塑料顆粒例如5 μm的塑料顆?？稍谛∈蟮奈改c道、肝和腎中積累 ［5］，而粒徑更小的納米塑料（小于100 nm的微塑料顆粒）可穿透細胞膜，損傷細胞器結(jié)構(gòu)和功能，造成一系列的毒性作用［6］。鴨的覓食習慣和生活環(huán)境使其更易接觸到微塑料，有研究發(fā)現(xiàn)，在鴨等禽類的消化道發(fā)現(xiàn)有微塑料的存在［7］，微米級塑料顆?？梢鸱喣c道菌群紊亂和氧化應激［8］。近年來，水禽繁殖能力下降的現(xiàn)象也受到人們的重視，然而，到目前為止，人們對微塑料，尤其是納米塑料（nanomicroplastics，NPs）是否能對水禽雄性生殖系統(tǒng)組織造成毒性損傷尚不清楚。因此本研究以紹興鴨為研究對象，探究不同劑量PS-NPs對紹興鴨睪丸的毒性影響，旨在為進一步揭示其作用機制及其防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

32只1日齡紹興健康公鴨，購自紹興咸亨紹鴨育種有限公司。所有試驗操作均按照國家研究委員會《實驗動物護理與使用指南》的建議進行，并經(jīng)揚州大學動物護理與使用委員會批準（批準ID：202303015）。

1.2 主要試劑和儀器

100 nm聚苯乙烯微塑料（江蘇智川科技）；MDA、CAT、GSH、SOD試劑盒（南京建成生物研究所）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑復合物（蘇州新賽美生物科技有限公司）；β-Actin抗體（Proteintech）、Nrf2、NOO1、HO-1抗體（CST）。

多孔位酶標儀（BioTek公司，America）；5810R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）SDS-PAGE蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國BIORAD公司）；AB7500熒光定量PCR儀（Thermo公司，America）。

1.3 動物分組與處理

將32只公鴨預飼一周，稱重后，隨機分為Control組、L-NPs組、M-NPs組、H-NPs組，拌料處理，分別對應100 nm粒徑的PS-NPs暴露劑量為0、1、10、100 mg·kg-1，每組8只。45 d稱重并麻醉后頸靜脈放血致死，取其睪丸組織進行試驗，處死前1 d禁食。

1.4 睪丸臟器指數(shù)計算

公鴨稱重處死后立即取其隨后取其睪丸組織稱重，并根據(jù)以下公式計算睪丸臟器系數(shù)（%）。

睪丸臟器系數(shù)=（睪丸的重量/體重）×100。

1.5 睪丸組織形態(tài)學觀察

將新鮮睪丸組織用4%多聚甲醛固定24 h，隨后用無水乙醇梯度脫水，浸蠟包埋切片，待石蠟融化后依次脫蠟，然后用蘇木精-伊紅染色，染色后的切片經(jīng)脫水透明封片干燥后，置于顯微鏡下觀察。

1.6 MDA含量和GSH、CAT和SOD活性的檢測

稱取20 mg睪丸組織并制成組織勻漿，4 ℃ 3 000 r·min-1 離心3 min后取上清，用試劑盒比色法檢測MDA含量及GSH-Px、CAT和SOD活性。

1.7 氧化應激相關(guān)蛋白表達水平的檢測

免疫印跡法（Western blot）檢測氧化應激相關(guān)蛋白的表達情況。稱取20 mg睪丸組織，加入裂解液用組織勻漿機將其制成組織勻漿裂解20 min，超聲破碎30 s，4 ℃ 12 000 r ·min-1離心10 min，收集上清，用BCA法檢測總蛋白濃度，加入5× SDS蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，放入-80 ℃保存。將上述蛋白樣品室溫溶解進行SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝膠電泳，使組織蛋白分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂乳室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，一抗孵育過夜，TBST洗滌5次，每次5 min，二抗孵育2 h，TBST洗滌5次，每次5 min。將顯色液混勻覆蓋于PVDF膜表面，反應后放入化學發(fā)光成像儀顯影檢測氧化應激相關(guān)蛋白Nrf2、NQO1和HO-1的表達水平。

1.8 炎癥相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

稱取10 mg睪丸組織，通過Trizol法提取組織總RNA，Nanodrop測定RNA濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA以及實時熒光定量PCR反應體系。引物序列如表1所示。通過2- ΔΔCt進行結(jié)果分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。采用One-Way ANOVA進行差異顯著性分析，結(jié)果均以“平均數(shù)±標準差（x-±s）”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PS-NPs對公鴨體重和睪丸組織臟器系數(shù)的影響

PS-NPs對公鴨體重和睪丸系數(shù)的影響情況見圖1，由圖1可知，隨著PS-NPs處理時間的延長，體重增長逐漸變緩，但無顯著性。同時隨著PS-NPs處理濃度的增加，公鴨體重和睪丸系數(shù)呈劑量依賴性下降，與Control組相比，H-NPs組睪丸系數(shù)呈顯著下降（P＜0.05）。

2.2 PS-NPs對睪丸組織形態(tài)學的影響

通過HE染色觀察試驗鴨睪丸組織形態(tài)學變化，結(jié)果（圖2）可見，Control組睪丸組織曲精小管連接緊密，管壁清晰，間質(zhì)細胞排列緊密；與Control組相比，隨著PS-NPs處理濃度的增加，曲精小管間的間隙不斷變大，間質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少，M-NPs組和H-NPs組睪丸組織曲精小管管壁結(jié)構(gòu)模糊（藍色箭頭）。說明PS-NPs可以損傷公鴨睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3 PS-NPs對公鴨睪丸組織MDA、GSH、CAT和SOD的影響

試劑盒檢測MDA含量和GSH-Px、T-SOD、CAT的活性，結(jié)果（圖3）可知，隨著PS-NPs處理濃度的增加，MDA含量呈劑量依賴性增加，GSH-Px、SOD和CAT活性呈劑量依賴性下降，M-NPs組和H-NPs組MDA含量呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）升高；M-NPs組和H-NPs組GSH-Px、SOD和CAT活性呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下降。結(jié)果表明，PS-NPs可損傷公鴨睪丸組織抗氧化系統(tǒng)，并存在劑量效應關(guān)系。

2.4 PS-NPs對睪丸組織氧化應激相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測PS-NPs對睪丸組織氧化應激相關(guān)蛋白表達水平的影響，結(jié)果（圖4）可知，隨著PS-NPs處理濃度的增加，Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達水平呈劑量依賴性下降趨勢，并且M-NPs組和H-NPs組蛋白表達水平呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下降趨勢。結(jié)果表明PS-NPs可造成公鴨睪丸組織氧化損傷，并存在劑量效應關(guān)系。

2.5 PS-NPs對睪丸組織炎癥相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過實時熒光定量PCR檢測TNF-α和IL-6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，由結(jié)果（圖5）可知，與Control組相比，L-NPs組TNF-α和IL-6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化，M-NPs組和H-NPs組TNF-α和IL-6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）升高。結(jié)果表明PS-NPs可造成公鴨睪丸組織炎性損傷。

3 討 論

微塑料已然成為全球性的環(huán)境問題。有研究表明，我國淡水流域普遍存在微塑料污染的現(xiàn)象［9-11］。鴨既能在陸地生活，又能在水中生活。因此，鴨等水禽暴露于微塑料的風險大大增加。針對近年來鴨等水禽繁殖能力下降的現(xiàn)象，展開微塑料對鴨雄性生殖毒性的研究十分必要。有報道稱成年人（約60 kg）每天攝入微塑料顆粒為2.4～700 mg·kg-1，同時一些研究表明微塑料造成小鼠和大鼠睪丸組織損傷的毒性劑量分別為40 mg·g-1和50 mg·kg-1，造成雞損傷肝腸損傷的毒性劑量為1 mg·L-1以上［12-14］，這為本試驗的PS-NPs暴露劑量提供了一定的依據(jù)。同時根據(jù)體表面積公式換算，由此在研究PS-NPs對公鴨睪丸組織的損傷作用時選擇了0、1、10、100 mg·kg-1的處理濃度。

動物染毒后，體重和受損的臟器重量可能發(fā)生改變，臟器系數(shù)也隨之改變。本試驗通過稱量鴨體重和睪丸重量，并計算臟器系數(shù)來探究PS-NPs對紹興鴨體重和睪丸系數(shù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，體重變化無顯著性，而睪丸系數(shù)呈劑量依賴性下降，且H-NPs組顯著下降。本試驗結(jié)果顯示PS-NPs可導致睪丸系數(shù)下降，該結(jié)果與Jin等［15］的研究一致。一般引起炎癥的疾病常會引起

血管通透性的改變從而導致組織水腫，而本試驗中睪丸系數(shù)下降，這可能與微塑料的類型、直徑、濃度和暴露時間相關(guān)，該結(jié)果與HE切片未觀察到組織水腫一致。此外，Xie等［16］研究結(jié)果表明微塑料可以進入睪丸細胞并導致其睪丸組織形態(tài)學改變。本試驗睪丸組織病理切片顯示，與Control組相比，NPs組曲精小管管壁結(jié)構(gòu)和間隙以及間質(zhì)細胞數(shù)量均有不同程度的變化，M-NPs和H-NPs組損傷尤為明顯。這進一步證明PS-NPs可以降低公鴨睪丸系數(shù)，損傷其形態(tài)結(jié)構(gòu)。遺憾的是，本試驗的病理切片不能分辨出PS-NPs。有大量研究表明微塑料可進入大鼠、小鼠等睪丸組織和細胞并在其中蓄積［12，17-19］，而本試驗采用的是常見的納米級微塑料，粒徑更小，應更易進入睪丸組織并蓄積。

越來越多證據(jù)表明氧化應激是微塑料誘導各組織損傷的主要機制之一［20-22］。氧化應激是機體內(nèi)活性氧大量積累且超出抗氧化系統(tǒng)對其的清除能力，導致機體氧化作用和抗氧化作用失衡，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。長期接觸微塑料會導致ROS持續(xù)積累，破壞抗氧化平衡，產(chǎn)生大量抗氧化產(chǎn)物MDA，導致GSH-Px、T-SOD、CAT等抗氧化酶活性降低或喪失［23］。這與本試驗結(jié)果一致，通過檢測睪丸的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，MDA含量呈劑量依賴性增加，GSH-Px、SOD和CAT活性呈劑量依賴性下降，表明公鴨睪丸抗氧化機制遭到破壞，提示PS-NPs可誘導公鴨睪丸組織氧化損傷。

機體的氧化應激不僅體現(xiàn)在MDA和抗氧化酶的變化，還涉及到一些相關(guān)蛋白的變化，這些蛋白也能夠反映機體的氧化損傷程度。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)蛋白（Nrf2）是抗氧化損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過調(diào)控下游的血紅素氧和酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）等蛋白的表達進一步調(diào)控抗氧化應激水平［24］。為進一步探究PS-NPs對公鴨睪丸組織的氧化損傷作用，本試驗通過Western blot檢測氧化應激相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達水平呈劑量依賴性下降，并且M-NPs組和H-NPs組呈顯著或極顯著下降趨勢。這與Hou等［25］對小鼠睪丸的研究結(jié)果一致。說明PS-NPs能損傷公鴨睪丸組織的抗氧化能力，引發(fā)睪丸組織氧化應激反應。

促炎細胞因子TNF-α和IL-6被認為是反映機體炎癥和疾病嚴重程度的重要指標之一。有研究表明，PS-NPs誘導小鼠睪丸中TNF-α和IL-6蛋白表達水平升高［26］。這與本試驗結(jié)果相符，通過實時熒光定量PCR檢測TNF-α和IL-6基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，睪丸組織中TNF-α和IL-6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈劑量依賴性升高，并且M-NPs組和H-NPs組炎癥基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈顯著或極顯著升高。這說明PS-NPs能增加睪丸組織炎癥因子的表達，引起炎癥反應。

Nrf2和HO-1是炎癥信號級聯(lián)反應和氧化應激反應的關(guān)鍵組成部分，可以協(xié)調(diào)多種炎癥因子表達［27］。Nrf2與HO-1結(jié)合后催化血紅素降解為一氧化碳和游離鐵，并且催化膽綠素降解為膽紅素、游離血紅素具有促炎作用，一氧化碳和膽紅素具有抗炎作用［28］。本試驗的結(jié)果表明，PS-NPs是通過下調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達水平，使游離血紅素增加，一氧化碳和膽紅素生成減少，最終導致睪丸組織抗氧化能力和抗炎能力損傷。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，PS-NPs能引起紹興鴨睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、炎癥和氧化應激，并且睪丸組織的損傷程度與PS-NPs暴露劑量呈正相關(guān)，PS-NPs引起的炎癥反應與Nrf2/HO-1信號通路密切相關(guān)。

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（編輯 白永平）