基于DNA甲基化組學(xué)技術(shù)分析TET1基因?qū)π∈髐NK細胞DNA甲基化的影響

摘 要：

本研究旨在探究去甲基化酶1（ten eleven translocation， TET 1）對小鼠子宮內(nèi)自然殺傷細胞（uterine natural killer， uNK）DNA甲基化的影響，深入了解其分子調(diào)控機制。無菌采集妊娠10 d小鼠子宮蛻膜，分離純化uNK細胞進行培養(yǎng)，利用RNA干擾技術(shù)敲低TET 1基因的表達，提取TET 1干擾組和正常對照組細胞的總DNA，利用簡化基因組DNA甲基化測序（reduced representation bisulfite sequencing， RRBS）技術(shù)進行測序，測序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析進行兩組樣本差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region， DMR）的統(tǒng)計與注釋，并進一步對DMR相關(guān)基因進行GO數(shù)據(jù)庫分析及注釋，了解相關(guān)基因的功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對其調(diào)控的信號通路進行富集分析。結(jié)果顯示，TET 1干擾組相較對照組共有14 120個DMRs，其中高甲基化的DMR有4 897個，低甲基化的DMR有9 223個，分布在基因體（genebody）上的DMR最多，共9 762個，占總數(shù)的69.14%。DMR廣泛分布于基因組的不同元件，且有些基因不同元件同時存在高甲基化和低甲基化的DMR。GO注釋結(jié)果顯示，存在DMR的基因主要集中在ATP結(jié)合、核酸結(jié)合、細胞組建、細胞分化、胚胎發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖負調(diào)控等方面。KEGG數(shù)據(jù)庫分析顯示，DMR主要在代謝通路呈現(xiàn)顯著富集，其中丙酮酸代謝通路共有12個參與代謝的關(guān)鍵分子出現(xiàn)了54個DMR，是出現(xiàn)DMR顯著富集的代謝通路，其中乙酰輔酶A合成酶（Acss）、乳酸脫氫酶B（Ldhb）和丙酮酸激酶（Pklr）的DMR呈現(xiàn)單一高甲基化狀態(tài)。此外，PI3K/AKT信號通路和HIF-1信號通路在介導(dǎo)丙酮酸代謝過程中發(fā)揮重要作用，且在基因體和啟動子上的DMR也出現(xiàn)顯著富集。綜上，TET 1對小鼠uNK細胞具有甲基化調(diào)控作用，丙酮酸代謝是其發(fā)揮調(diào)控作用的主要途徑，Acss、Ldhb和Pklr是其潛在的調(diào)控靶分子，PI3K/AKT和HIF-1是參與調(diào)控的重要信號通路。

關(guān)鍵詞：

TET 1基因；uNK細胞；甲基化組學(xué)；丙酮酸；小鼠

中圖分類號：

S857.2 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0912-13

收稿日期：2024-04-07

基金項目：國家自然基金（32002356）；重慶市自然基金（cstc2019jcyj-msxmX0140）；重慶市科企聯(lián)合體種質(zhì)資源收集利用與品種試驗項目（草食牲畜）

作者簡介：趙靜賢（2001-），女，新疆庫爾勒人，碩士生，主要從事動物免疫學(xué)研究，E-mail：1912790377@qq.com；楊曉偉（1980-），副教授，主要從事動物生殖免疫學(xué)研究，E-mail： yangxiaowei396@163.com。趙靜賢和楊曉偉為同等貢獻作者

*通信作者：趙光偉，主要從事動物疾病實驗室診斷研究，E-mail：stay612@163.com；趙永聚，主要從事草食牲畜遺傳改良等領(lǐng)域的教學(xué)和研究工作，E-mail：zyongju@163.com

Analysis of the Effect of TET 1 Gene on Methylation of Mouse uNK Cells based on

DNA Methylation Histology Technique

ZHAO" Jingxian1， YANG" Xiaowei1， 2， 3， LIU" Yanyan1， ZHAO" Ziliang1， 4， ZHAO" Guangwei1*， ZHAO" Yongju2， 3*

（1.College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460，" China;

2.College of Animal Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400715，" China;

3.Chongqing Key Laboratory of Herbivore Science， Chongqing 400715，" China;

4.National Pig Technology Innovation Center， Chongqing 402460，" China）

Abstract：

The purpose of this study was to investigate the effect of ten eleven translocation 1 （TET 1） on the methylation of the DNA of mouse uterine natural killer （uNK） cells， and to gain insight into its molecular regulatory mechanism. Mouse uterine metaphase was aseptically collected on the 10th day of gestation， and the uNK cells were isolated and purified for culture. The expression of TET 1 gene was knocked down by RNA interference technology. Then， total DNA from cells of the interference group and the normal control group were extracted， respectively. Sequencing was performed using reduced representation bisulfite sequencing （RRBS） method， and the results were analyzed by bioinformatics software for the statistics and annotation of differentially methylated region （DMR） in the two group samples， and further analyzed by the GO database for DMR-related genes to understand their functions. Also， the sequencing results were analyzed for the differentially methylated region （DMR） annotation， and the enriched signaling pathways in which regulated by the KEGG database. The results showed that there were 14 120 DMRs in the TET 1 interference group when compared with the control group， of which 4 897 were hypermethylated DMRs and 9 223 were hypomethylated DMRs. The largest number of DMRs were distributed in the genebody， with a total of 9 762 DMRs， accounting for 69.14% of the total number of DMRs. DMRs were widely distributed in the different elements of the genome， and some genes had DMRs with both hypermethylated and hypomethylated in different elements. GO annotation results showed that the DMRs were mainly concentrated in ATP binding， nucleic acid binding， cell formation， cell differentiation， embryonic development， RNA polymerase II transcriptional regulation and negative regulation of cell proliferation， etc. KEGG database analysis results revealed that the DMRs were significantly enriched in the metabolic pathways， with a total of 12 key molecules involved in metabolism in the pyruvate metabolic pathway， and 54 DMRs appeared， which was the most significant enrichment of DMRs in the metabolic pathway. Among the 12 key molecules， acetyl-coA synthetase （Acss）， lactate dehydrogenase B （Ldhb）， and pyruvate kinase L/R （Pklr） exhibited a single hypermethylated status. In addition， significant enrichment of DMRs were also found in the PI3K/AKT signaling pathway and HIF-1 signaling pathway， indicating that DMRs play important roles in mediating pyruvate metabolism. Thus， TET 1 has a methylation regulatory effect mouse uNK cells， and pyruvate metabolism is the main pathway for its regulatory effect. What’s more， Acss， Ldhb and Pklr are potential regulatory target molecules， while PI3K/AKT and HIF-1 are important signaling pathways which involved in regulation.

Key words：

TET 1; uNK cell; methylomics; pyruvate; mouse

*Corresponding authors：" ZHAO Guangwei， E-mail： stay612@163.com; ZHAO Yongju， E-mail： zyongju@163.com

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要分支，在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)和畜牧業(yè)等眾多領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用［1］，大量研究顯示其在卵巢卵泡發(fā)育［2］、雄性不育［3］、動物胚胎發(fā)育［4］等眾多方面發(fā)揮著重要的作用，其過程主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine， SAM）作為甲基供體在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子進行甲基化完成［5-6］，胞嘧啶的甲基化是一個動態(tài)可逆過程，去甲基化酶（ten eleven translocation，TET）能夠通過氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）使其變成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），實現(xiàn)DNA去甲基化作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)TET家族包含 TET 1、TET 2和TET 3三個成員［8］，其中TET 1在調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，Yamaguchi等［9］發(fā)現(xiàn)TET 1缺乏會顯著降低卵母細胞數(shù)量，影響母鼠的生育能力。此后，Xu等［10］在探索豬卵母細胞體外成熟機制方面進行了更深入的研究，推測TET家族對豬卵母細胞排出第一極體的過程具有正向調(diào)控作用。Yamaguchi等［11］、Khoueiry等［12］相繼發(fā)現(xiàn)TET 1的敲除或缺失將會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育不良，甚至死亡。此外，TET 1也是調(diào)控免疫細胞活性的一種重要的表觀遺傳修飾分子。Peng等［13］通過鑒定小鼠先天免疫細胞（innate lymphoid cell， ILC）和NK細胞亞群之間的差異甲基化和羥甲基化DNA區(qū)域，發(fā)現(xiàn)TET家族參與調(diào)控ILC并發(fā)揮積極作用。Yang等［14］發(fā)現(xiàn)，硫化氫促進TET 1和TET 2的表達以介導(dǎo)TGF-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）和IL-2（interleukin-2， IL-2）信號下游的Foxp3（forkhead box protein P3， Foxp3）去甲基化，進而促進調(diào)節(jié)性T細胞的功能和維持免疫穩(wěn)態(tài)。此外，Orlanski等［15］發(fā)現(xiàn)敲除發(fā)育早期階段B細胞上的TET蛋白后，導(dǎo)致早期B細胞去甲基化缺乏，進而影響附近B細胞的基因表達，造成B細胞分化和功能缺陷。說明TET 1在調(diào)控妊娠、胎兒發(fā)育及免疫細胞活性等生命活動中具有重要的調(diào)控作用。

哺乳動物子宮內(nèi)自然殺傷細胞（uterine natural killer， uNK）是妊娠期在子宮內(nèi)膜短暫存在的一類NK細胞亞群，是妊娠早期胎盤蛻膜中數(shù)量最多的免疫細胞［16］，其增殖分化對于維持正常妊娠和胎兒發(fā)育具有重要意義［17］?，F(xiàn)有的研究表明uNK細胞異常增殖與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性植入失敗、散發(fā)性流產(chǎn)和胎兒生長受限等疾病密切相關(guān)［18］，例如當(dāng)uNK細胞數(shù)目異常升高時會表達細胞毒性受體，對細胞具有殺傷作用從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)；反之，當(dāng)uNK細胞比例顯著下降時，其分泌的IFN-γ減少，對Th17細胞的極化抑制作用下降，導(dǎo)致大量促炎因子（如IL-1β和IL-6）表達增加，引起子宮局部炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致胎兒定植失?。?9-20］。因此，uNK細胞對于維持正常妊娠過程發(fā)揮了巨大的作用，然而該細胞的調(diào)控機制尚不明確，前期研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)uNK細胞中TET 1基因的表達量，能夠影響其關(guān)鍵細胞因子（IFN-γ、VEGF-C 和TGF-β1）的轉(zhuǎn)錄［21］，因而TET 1對uNK細胞具有調(diào)控作用。鑒于此，本試驗擬采用簡化基因組DNA甲基化測序（reduced representation bisulfite sequencing， RRBS）技術(shù)，檢測TET 1對小鼠uNK細胞DNA甲基化的影響，深入了解其調(diào)控機制，為動物繁殖障礙性疾病的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及實驗動物

磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司（貨號DP705）；Acegen Rapid RRBS Library Prep Kit購自深圳艾斯基因科技有限公司（貨號AG0422）；ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國Zymo Research公司（貨號D5008）；Agilent DNA 1000 Kit購自美國Agilent科技有限公司（貨號5067-1504）；QubitTM dsDNA HS Assay Kit購自美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司（貨號Q32854）；NovaSeq Reagent Kit購自美國Illumina公司（貨號PE150）。

ABI 9700/2720 PCR儀、ABI Qpcr儀（美國，ABI公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國，Agilent公司）；Labchip GX 生物大分子分析儀（美國，PerkinElmer公司）；高通量二代測序儀（美國，Illumina公司）。

成年雌、雄昆明小鼠（10～12周齡，體重25 g左右）購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，正常飼喂于西南大學(xué)SPF實驗動物房。

1.2 小鼠uNK細胞的分離與培養(yǎng)

參考文獻［21］方法，無菌采集妊娠10 d左右小鼠子宮蛻膜，利用剪刀和0.1%的膠原酶I將其處理成細胞團塊，使用紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液分離出小鼠淋巴細胞，再以鏈霉親和素包被磁珠法，從淋巴細胞中分選出uNK細胞，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、5％青鏈霉素和10 ng·mL-1 IL-15的1640低糖培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 慢病毒滴度測定

采用本課題組前期構(gòu)建成功的重組干擾質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒［21］，將慢病毒包裝的TET 1重組干擾質(zhì)粒梯度稀釋后轉(zhuǎn)染至處于對數(shù)生長期的293T細胞，待細胞密度高于80%時，抽提各稀釋度細胞的RNA，利用RT-qPCR技術(shù)比較對照組標準曲線和試驗組的Ct值差異計算滴度，其公式為滴度（TU/Ml）=［平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)×感染時細胞的數(shù)目×病毒的稀釋倍數(shù)×1 000］/ 加入稀釋病毒的體積數(shù)。其中，目的基因WPRE和內(nèi)參基因GADPH的檢測引物序列見表1。

1.4 小鼠uNK細胞TET 1干擾模型的建立

取生長狀態(tài)良好的小鼠uNK細胞進行計數(shù)，按照1.5×106細胞接種6孔板，參考本課題組前期建立的方法以MOI為10～200的比值加入慢病毒［21］，轉(zhuǎn)染96 h后，收獲TET 1干擾的uNK細胞，共3個重復(fù)，記為TET 1干擾組；同時收獲正常培養(yǎng)的uNK細胞，共3個重復(fù)，記為對照組；6組細胞樣本各取100μL提取RNA，用于RT-qPCR技術(shù)檢測目的基因TET 1的表達情況，其中，目的基因TET 1和內(nèi)參基因β-actin的檢測引物序列見表1。剩余所有樣本用于基因組DNA甲基化組測定。

1.5 細胞樣本DNA提取與檢測

按照磁珠法（通用型）基因組DNA提取試劑盒說明書分別提取6組細胞樣本基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳對樣品進行質(zhì)檢，結(jié)果提示基因組DNA主帶清晰，沒有明顯降解。利用Nanodrop超微量分光光度計和Qubit 2.0熒光儀進行DNA純度檢測和濃度的測定，保證樣本的OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0，且含量在1.5 μg以上，DNA樣品低溫送至北京奧維森基因科技有限公司用于后續(xù)建庫測序。

1.6 RRBS文庫制備及測序

按照Acegen Rapid RRBS Library Prep Kit試劑盒說明書，使用限制性核酸內(nèi)切酶Msp I將上述質(zhì)檢合格的基因組總DNA切割為100～350 bp的片段，對純化后產(chǎn)物使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit 試劑盒進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，對回收產(chǎn)物使用PCR擴增完成文庫構(gòu)建。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1X AMPure XP純化，使用Qubit 2.0熒光儀定量檢測，將文庫稀釋到1 ng·μL-1，文庫中插入片段長度通過Agilent 2100進行檢測，再通過qPCR方法準確定量文庫有效濃度（文庫有效濃度gt;2 nmol·L-1），確保文庫的質(zhì)量。

質(zhì)量合格的DNA文庫使用Illumina Novaseq 6000上機測序，選用邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）的雙端150 bp測序（PE150）作為測序策略。

1.7 數(shù)據(jù)生物信息分析

獲得原始測序序列（Sequenced Reads）后，通過FastQCv_0.11.9工具進行原始序列質(zhì)量統(tǒng)計，通過Trimmomaticv_0.39軟件降低低質(zhì)量和測序接頭數(shù)據(jù)，通過BSMAPv_0.22.3軟件將優(yōu)化后的測序數(shù)據(jù)與參比基因組進行對比，收集比對的統(tǒng)計信息，主要包括C位點的測序深度、覆蓋度，Msp I的酶切效率和CpG位點覆蓋。其中，參考基因組的版本為mm10（GCF_000001635.24，注釋：22 June 2016）。

1.8 差異甲基化區(qū)域識別與結(jié)果注釋

通過二元分隔算法結(jié)合雙重統(tǒng)計學(xué)檢驗，利用Metilenev_0.2.8軟件對兩組樣本的差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions， DMR）進行分析，分別使用CG、CHG和CHH位點尋找DMRs，并對其進行區(qū)域注釋，對鑒定的DMR平均甲基化水平進行聚類熱圖繪制，觀察甲基化水平在組合間差異情況。

1.9 DMR相關(guān)基因的GO注釋和KEGG通路富集分析

分別利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對DMR相關(guān)基因的功能進行注釋分析，同時對基因顯著富集的信號通路進行分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析及作圖軟件

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標準誤（x-±sX-）”表示，方差檢驗采用單因素ANOVA方差分析，以P＜0.05為顯著性判斷標準；采用Graphpad prim軟件繪制圖片。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒滴度測定

收獲經(jīng)梯度稀釋慢病毒感染的293T細胞，利用RT-qPCR方法對目的基因WPRE和GADPH進行檢測，通過公式計算得出重組干擾質(zhì)粒包被慢病毒的滴度為1.12 TU·mL-1。

2.2 小鼠uNK細胞TET 1基因表達

待小鼠uNK細胞轉(zhuǎn)染慢病毒96h后，收取TET 1干擾組和對照組共6個細胞樣本（每組3個重復(fù)）各100 μL，通過RT-qPCR的方法對目的基因TET 1和β-actin進行檢測，結(jié)果如圖1所示，TET 1干擾組各組TET 1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組，組內(nèi)差異不顯著，表明小鼠uNK細胞TET 1干擾模型建立成功，且試驗重復(fù)性良好。

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

對下機后每個樣本原始數(shù)據(jù)采用Trimming的方式截去測序接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，進行原始數(shù)據(jù)質(zhì)量的優(yōu)化。結(jié)果顯示：去甲基化酶TET 1干擾組3個樣本優(yōu)化后堿基數(shù)分別為4 946 708 853、4 916 698 452、5 007 778 090，質(zhì)量指標Q20分別達到96.98%、97.09%和96.86%，Q30分別為89.51%、89.30%和88.54%，對照組3個樣本優(yōu)化后堿基數(shù)分別為4 953 400 258、4 901 118 203和4 920 968 110，質(zhì)量指標Q20分別達到96.99%、96.83%和96.97%，Q30分別為89.16%、90.28%和89.88%，6個樣品質(zhì)量指標Q20均超過95%，

Q30均超過85%，表明優(yōu)化后測試數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，如表2所示，可用于進一步分析。

2.4 C位點的測序深度、覆蓋度與MspI 酶切效率及覆蓋CpG 位點統(tǒng)計

對去甲基酶TET 1干擾組和對照組共6個樣本優(yōu)化后的數(shù)據(jù)進行C位點的覆蓋度統(tǒng)計，干擾組uNK細胞樣本CG類型C位點數(shù)量分別為4 971 883、4 921 960和5 326 157，有效覆蓋深度分別為15.737 09、18.209 16和15.892 16，測序深度5×以上位點的覆蓋度分別為0.559 367、0.615 603和0.560 050，測序深度10×以上位點的覆蓋度分別為0.417 201、0.492 745和0.434 085，對照組uNK細胞樣本CG類型C位點數(shù)量分別為4 477 985、4 827 758和5 326 157，有效覆蓋深度分別為20.956 05、14.268 55和14.328 09，測序深度5×以上位點的覆蓋度分別為0.638 982、0.518 964和0.500 710，測序深度10×以上位點的覆蓋度分別為0.516 772、0.368 129和0.356 494。CHG和CHH類型C位點測序深度和覆蓋度結(jié)果，詳見表3。

2.5 差異甲基化區(qū)域（DMR）統(tǒng)計與注釋

利用Metilenev_0.2.8軟件分析TET 1干擾組和對照組樣本的差異甲基化區(qū)域（DMR），結(jié)果顯示：TET 1干擾組與對照組相比，共有14 120個DMR，其中4 897個DMR為高甲基差異區(qū)域，9 223個DMR為低甲基差異區(qū)域。其中9 762個DMR分布在基因體（genebody）上，占總數(shù)的69.14%，3 597個DMR分布在外顯子（exon）上，占總數(shù)的25.48%，分布在重復(fù)序列（repeat）、啟動子（promoter）、5′非翻譯區(qū)（5′-untranslated region， 5′UTR）、CpG島區(qū)（CpG island， cgi）、上游2k區(qū)（upstream 2k）、CpG島岸區(qū)（CpG shore， cgi-shore）、下游2k（downstream 2k） 區(qū)和3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated region， 3′UTR）的數(shù)量占比分別為24.11%、12.39%、10.28%、8.57%、8.36%、6.28%、5.86%和3.09%（圖2A），兩組樣本基因甲基化水平聚類分析差異性結(jié)果如圖2B所示。

2.6 DMR相關(guān)基因功能分析

將得到DMR區(qū)域相關(guān)基因利用GO數(shù)據(jù)庫富集，進一步分析其基因主要功能，結(jié)果顯示細胞組件是基因體和啟動子DMR注釋數(shù)量最多的部分（圖3），其中膜、細胞質(zhì)、核、細胞外泌體等是二者共同注釋細胞組件條目，此外部分基因體DMR注釋在細胞突起、細胞結(jié)、細胞骨架等條目（圖3A），而少量啟動子DMR注釋在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和黏著斑（圖3B）；分子功能部分的鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、嗅覺受體活性、DNA結(jié)合、金屬離子結(jié)合以及蛋白質(zhì)結(jié)合條目是基因體和啟動子DMR共同注釋條目，而ATP結(jié)合和核苷酸結(jié)合兩個條目僅部分基因體DMR注釋。

2.7 DMR相關(guān)基因通路富集及分析

將基因體和啟動子區(qū)域DMR分別進行KEGG通路富集，二者最為顯著的25條通路信息如圖4所示，可見基因體和啟動子上的DMR均在代謝通路中最為富集，且與細胞能量代謝相關(guān)的cGMP-PKG、cAMP、PI3K/AKT和HIF-1信號通路也出現(xiàn)顯著富集，說明能量代謝在TET 1調(diào)控小鼠uNK細胞甲基化過程中發(fā)揮著重要的作用。

進一步分析能量代謝途徑發(fā)現(xiàn)丙酮酸代謝途徑中差異DMR最為顯著，參與丙酮酸代謝途徑的關(guān)鍵分子中有12個分子的基因元件上出現(xiàn)54個DMR，其中13個為高甲基化DMR，41個為低甲基化DMR（表4）。13個高甲基化DMR分布在乙酰輔酶A合成酶（Acss）、乳酸脫氫酶B（Ldhb）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK 1）、丙酮酸羧化酶（Pcx）、丙酮酸激酶（Pklr）的不同基因元件中，其中Acss的差異顯著性最高；而41個低甲基化DMR分布在丙酮酸脫氫酶 （Pdha1）、乙酰輔酶A羧化酶β（Acacb）、乳酸脫氫酶D（Ldhd）、乙二醛酶1（Glo 1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）、丙酮酸羧化酶（Pcx）、醛脫氫酶2（Aldh 2）、酰基磷酸酶2（Acyp2）基因不同元件。

結(jié)合TET 1所具有的去甲基化生物學(xué)功能，TET 1干擾組去甲基化的能力受到抑制，因而其調(diào)控的基因組中會呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)。在丙酮酸代謝途徑出現(xiàn)顯著甲基化DMR的關(guān)鍵分子中，共有Acss、Ldhb、PCK 1、Pcx和Pklr 5個酶的基因中表現(xiàn)高甲基化，其中Acss、Ldhb和Pklr基因的DMR均呈現(xiàn)單一高甲基化（表4），其余兩個分子不同元件的DMR表現(xiàn)為高甲基化和低甲基化同時存在，因而Acss、Ldhb和Pklr應(yīng)是TET 1調(diào)控uNK細胞甲基化潛在的重要靶分子。由于PI3K/AKT信號通路和HIF-1信號通路均是參與細胞能量代謝的經(jīng)典通路，而丙酮酸是糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)等代謝過程中的中心產(chǎn)物，與能量代謝息息相關(guān)，且這兩個通路在基因體和啟動子上的DMR也出現(xiàn)富集，因而PI3K/AKT和HIF-1信號通路是參與TET1調(diào)控uNK細胞的重要信號通路。

3 討 論

DNA甲基化是在胞嘧啶上第5位碳原子甲基化變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC）或5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的反應(yīng)，在生命領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育［22］、造血系統(tǒng)［23］及腫瘤等［24-25］相關(guān)疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。胞嘧啶甲基化導(dǎo)致DNA的轉(zhuǎn)錄不能正常延伸，從而使得基因沉默，因此高甲基化往往意味著調(diào)控基因的沉默，低甲基化會激活基因的轉(zhuǎn)錄與表達，借此來調(diào)控基因的表達。而TET 1能在Fe2+和α-酮戊二酸的輔助下將5-甲基胞嘧啶（5-mc）氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），實現(xiàn)DNA去甲基化作用，借此對多種生命活動進行調(diào)控，目前已經(jīng)證實TET 1在胚胎發(fā)育［26］、干細胞重編程［27］以及免疫細胞Treg的分化、穩(wěn)定［28］等方面具有重要的調(diào)控作用，且課題組前期也發(fā)現(xiàn)TET 1對維持正常妊娠發(fā)揮重要作用的uNK細胞具有調(diào)控作用［21］，但對調(diào)控機制尚不明確，鑒于TET 1具有去甲基化的能力，因此推測其很有可能是通過調(diào)控某些重要通路中基因的甲基化來實現(xiàn)的，因此本試驗通過RNA干擾的方式敲低uNK細胞中TET 1的表達，對比正常uNK細胞進行甲基化組學(xué)測序分析。

目前，用于DNA甲基化測序的方法主要有全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）、簡化甲基化測序（RRBS）、精準DNA甲基化和羥甲基化測序（oxBS-seq）、羥甲基化DNA免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）等4種方式，其中RRBS主要利用限制性內(nèi)切酶對基因進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要表觀調(diào)控區(qū)域進行重亞硫酸鹽測序，該方法可以減少樣本DNA需求量，顯著提高CpG區(qū)域測序深度，能增強在CpG島、啟動子區(qū)域和增強子元件區(qū)域分辨率的精準度，是一種準確、高效的DNA甲基化研究方法［29］，本試驗中的uNK細胞為原代細胞，不易獲取且增殖分化速度較慢，因此采用RRBS方法對其進行DNA甲基化測序分析，能夠保證在有限的DNA濃度下準確分析甲基化結(jié)果。

與對照組相比，TET 1干擾組uNK細胞中共篩選到14 120個甲基化差異區(qū)域（DMR），其中高甲基DMR為4 897個，低甲基化DMR為9 223個，位于基因體（69.14%）和外顯子（25.48%）上的DMR數(shù)量最多，說明TET 1是廣泛作用于uNK細胞的基因組，而非特異性作用于某單一基因，且uNK細胞內(nèi)極有可能存在TET 1的拮抗機制，通過DNA甲基化重編程平衡TET 1干擾造成的活性紊亂，已有研究證實在小鼠胚胎成纖維細胞內(nèi)TET 1與甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt通過拮抗關(guān)系維持正常DNA甲基化水平［30］。

本試驗中通過KEGG通路富集顯示基因體和啟動子上的DMR均在代謝通路中最為顯著，這說明TET 1對小鼠uNK細胞的調(diào)控主要是從物質(zhì)能量代謝方面發(fā)揮作用的，而進一步分析發(fā)現(xiàn)丙酮酸代謝在代謝通路中的差異尤為顯著，丙酮酸是細胞內(nèi)重要的小分子有機物，是糖、蛋白質(zhì)和脂肪三者代謝過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，也是整個代謝網(wǎng)絡(luò)的中心產(chǎn)物［31］。試驗結(jié)果顯示12個參與丙酮酸代謝的關(guān)鍵分子上共有54個DMR，作為DMR出現(xiàn)最為廣泛和集中的一個代謝途徑，表明TET 1應(yīng)是主要通過調(diào)控丙酮酸進而影響uNK細胞的能量代謝，這與丙酮酸促進T細胞分化并調(diào)控T細胞以增強其抗腫瘤作用［32，33］、介導(dǎo)巨噬細胞參與炎癥反應(yīng)［34］具有類似的現(xiàn)象。而該試驗結(jié)果說明丙酮酸代謝同樣對uNK細胞具有調(diào)控作用，且甲基化是其調(diào)控細胞活性的手段之一。TET 1具有去甲基化的生物學(xué)功能，TET 1干擾組由于基因的表達受到干擾使得去甲基化的能力受到抑制，因而受其調(diào)控的基因會呈現(xiàn)高甲基化的狀態(tài)。在對丙酮酸代謝途徑中關(guān)鍵分子出現(xiàn)顯著高甲基化DMR的分析中發(fā)現(xiàn)，Acss、Ldhb和Pklr三個分子中的DMR在所有DNA元件上呈現(xiàn)單一高甲基化，而其余兩個在啟動子、外顯子、內(nèi)含子、基因體、2K上游區(qū)、5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)上表現(xiàn)既有高甲基化DMR，又有低甲基化DMR，因此Acss、Ldhb和Pklr三個酶極有可能是TET 1調(diào)控uNK細胞甲基化的靶分子，需要進一步通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對其進一步驗證。

PI3K/AKT和HIF-1信號通路均是參與細胞能量代謝的經(jīng)典通路，如脂質(zhì)代謝基因FTO介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路影響乳腺癌細胞能量代謝［35］，CD38蛋白通過增加AKT、mTOR及PI3K的磷酸化以激活PI3K/AKT信號通路來調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的能量代謝［36］，中藥槐耳則是通過介導(dǎo)PI3K/AKT/HIF-1α通路抑制肺癌細胞的能量代謝，顯示其抗癌活性［37］，而HIF-1更是作為調(diào)節(jié)細胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子成為治療癌癥的候選靶點［38］。大量研究顯示二者均參與丙酮酸代謝途徑，Cerniglia等［39］發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路對腫瘤細胞耗氧量的調(diào)控與丙酮酸脫氫酶的磷酸化有關(guān)，Zhou等［40］發(fā)現(xiàn)丙酮酸通過誘導(dǎo)GSK3β磷酸化參與激活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)，從而抑制黑色素細胞合成黑色素，丙酮酸還是激活HIF-1通路的激活劑［41-42］。此外，PI3K/AKT和HIF-1信號通路參與去甲基化酶TET 1的表觀遺傳調(diào)控作用。子宮內(nèi)膜癌發(fā)展過程中，由胰島素誘導(dǎo)表達的TET 1通過激活PI3K/AKT通路，促進子宮內(nèi)膜癌細胞分化［43］。在缺氧環(huán)境下，脂肪細胞內(nèi)HIF-1通過誘導(dǎo)TET 1表達降低脂肪細胞因子DNA啟動子甲基化，誘導(dǎo)其表達［44］。在本試驗發(fā)現(xiàn)這兩個通路的基因體和啟動子上的DMR出現(xiàn)了顯著富集，因而認為PI3K/AKT和HIF-1信號通路是參與TET 1調(diào)控uNK細胞的重要信號通路。

4 結(jié) 論

TET 1對小鼠uNK細胞具有甲基化調(diào)控作用，丙酮酸代謝是其發(fā)揮調(diào)控作用的主要途徑，Acss、Ldhb和Pklr是其潛在的靶分子，PI3K/AKT和HIF-1通路是參與其調(diào)控作用的重要信號通路。

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（編輯 白永平）