豬流行性腹瀉病毒感染對(duì)小腸杯狀細(xì)胞的影響及其機(jī)制的初步分析

摘 要：

本研究旨在探明豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）對(duì)仔豬腸道黏液分泌的影響并揭示其潛在的分子機(jī)制。構(gòu)建仔豬PEDV感染模型，通過(guò)阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸-雪夫（Alcian blue-periodic acid-Schiff，AB-PAS）染色和免疫熒光染色，揭示病毒感染對(duì)仔豬腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量和功能的影響。進(jìn)一步利用腸道干細(xì)胞構(gòu)建杯狀細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探明PEDV在該細(xì)胞模型的復(fù)制特點(diǎn)后，初步解析PEDV感染對(duì)杯狀細(xì)胞黏液蛋白轉(zhuǎn)錄及其分泌調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的影響。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，PEDV主要感染仔豬的空腸和回腸，其對(duì)空腸具有更高的易感性，并能顯著抑制腸道黏膜中杯狀細(xì)胞的數(shù)量和分泌功能。進(jìn)一步利用腸道干細(xì)胞建立了杯狀細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)病毒感染顯著降低了杯狀細(xì)胞Muc2、TFF3和SPDEF基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)，黏液分泌調(diào)控的關(guān)鍵通路MAPK信號(hào)通路的活性也受到了明顯抑制。PEDV感染會(huì)導(dǎo)致仔豬腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，黏蛋白分泌水平降低。病毒對(duì)MAPK信號(hào)途徑的抑制可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的關(guān)鍵原因。

關(guān)鍵詞：

PEDV；杯狀細(xì)胞；MAPK信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：S858.285.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)： 0366-6964（2025）02-0900-12

收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1800805-02）

作者簡(jiǎn)介：劉芮伶（1998-），女，四川攀枝花人，碩士，主要從事仔豬黏膜免疫研究，E-mail：lrl33316407@163.com

*通信作者：楊 倩，主要從事動(dòng)物黏膜免疫、上皮細(xì)胞與病原微生物相互作用研究，E-mail： zxbyq@njau.edu.cn

Preliminary Study on the Mechanism of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infection Affecting Small Intestinal Goblet Cells

LIU" Ruiling， LI" Yuchen， TANG" Rongfeng， YANG" Qian*

（Animal Mucosal Immunology Laboratory， College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：

The purpose of this study was to find out the specific effects of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） on intestinal goblet cells in piglets， and to reveal its potential mechanism. The model of PEDV infection in piglets was established， and the specific effects of virus infection on the number of goblet cells and mucus secretion in piglets′ intestines were revealed by using Alcian blue-periodic acid-Schiff （AB-PAS） staining and immunofluorescence staining. In order to verify the results of in vivo experiments， an in vitro experimental model of goblet cells was further constructed by using intestinal stem cells. In this model， firstly， the replication characteristics of PEDV are explored. Then， the effects of PEDV infection on transcription of functional genes （Muc2， TFF3， SPDEF） in goblet cells were studied. Finally， the influence of virus infection on the core regulatory pathway （MAPK signaling pathway） in the biological process of goblet cells was detected. Through the observation of tissue sections， it was found that PEDV mainly infected the jejunum and ileum of piglets， and jejunum was more susceptible to virus. Infection leads to severe atrophy of intestinal villi， significant decrease of goblet cells and serious loss of mucin. In addition， the in vitro culture model of goblet cells was successfully established， and the replication characteristics of PEDV in this model were revealed. Further research based on this in vitro infection model showed that PEDV infection significantly reduced the transcription level of Muc2， TFF3 and SPDEF genes in goblet cells， and at the same time， the activity of MAPK signaling pathway was also inhibited. PEDV infection can lead to the decrease of goblet cells and mucin secretion level in piglets. The inhibition of MAPK signaling pathway by virus may be the key reason for this phenomenon.

Key words：

PEDV; Goblet cell; MAPK signaling pathway

*Corresponding author：" YANG Qian， E-mail： zxbyq@njau.edu.cn

近年來(lái)，冠狀病毒的頻繁暴發(fā)對(duì)人類及動(dòng)物健康造成了巨大威脅。其中，豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），作為一種臨床上危害尤為嚴(yán)重的豬腸道冠狀病毒，已在全球范圍內(nèi)對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。作為一種腸道病毒，PEDV主要侵害新生仔豬的腸上皮細(xì)胞［3］。因此，當(dāng)前研究多聚焦于其對(duì)腸上皮細(xì)胞的調(diào)控作用，如揭示病毒感染的關(guān)鍵受體及抑制干擾素反應(yīng)機(jī)制等［4-5］。然而，病毒在接觸腸上皮細(xì)胞之前，首先接觸的是覆蓋于腸上皮細(xì)胞表面的黏液層。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，黏液層主要發(fā)揮潤(rùn)滑食物的作用，但近年的研究揭示，這一黏液層實(shí)際上富含多種具有直接抗病毒活性的免疫物質(zhì)［6］。因此，突破黏液屏障是建立病毒感染的必需步驟［7］。已有研究表明，PEDV感染會(huì)導(dǎo)致腸道黏液分泌顯著降低［6，8-16］，但其中的具體機(jī)制，仍有待進(jìn)一步探究。

黏液屏障的形成主要依賴于杯狀細(xì)胞，這些細(xì)胞在抵御病原微生物入侵時(shí)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［17-19］。眾多研究表明，病毒能夠通過(guò)調(diào)控杯狀細(xì)胞來(lái)削弱黏液屏障，進(jìn)而建立腸道感染。例如，輪狀病毒通過(guò)改變杯狀細(xì)胞數(shù)量來(lái)破壞腸道黏液屏障，為病毒感染創(chuàng)造有利條件［20］；而星狀病毒則通過(guò)干擾杯狀細(xì)胞分泌黏液的功能，改變腸道黏液層的防御能力，從而促使病毒感染的發(fā)生［21］。鑒于以上研究背景，本研究旨在明確PEDV對(duì)腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏液分泌能力的影響。通過(guò)建立體外杯狀細(xì)胞培養(yǎng)模型，探究PEDV感染特征及病毒對(duì)黏液分泌和杯狀細(xì)胞分化通路的影響，以期為開(kāi)發(fā)針對(duì)杯狀細(xì)胞保護(hù)和恢復(fù)的新PEDV防御策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用3和7日齡健康三元雜交豬（杜洛克×長(zhǎng)白×大白），均由江蘇省南京市高淳養(yǎng)豬場(chǎng)提供。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：超凈工作臺(tái)、熒光定量PCR儀LC480、激光共聚焦熒光顯微鏡Zeiss LSM980。

主要試劑：胎牛血清、DMEM/F12（Gibco公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊公司）、AB-PAS染色試劑盒（賽維爾公司）、Muc2抗體（Abbexa公司）、UEA-1染料（Sigma公司）、PEDV抗體（Medgene公司）、594標(biāo)記山羊抗兔IgG、488標(biāo)記山羊抗鼠IgG（翌圣生物公司）。

1.3 毒株

PEDV野生型毒株Zhejiang 08為本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.4 動(dòng)物分組與樣品采集

挑選6頭健康3日齡仔豬， 自由飲水、采食， 常規(guī)飼養(yǎng)管理。對(duì)照組（3頭）口服3 mL PBS，PEDV組（3頭）口服3 mL PEDV活病毒（105 PFU·mL-1）。攻毒3 d后，PEDV仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀。將所有仔豬安樂(lè)死，采集仔豬十二指腸、空腸和回腸樣品，制備組織切片。

1.5 AB-PAS染色觀察腸道組織杯狀細(xì)胞分布情況

將組織切片浸入二甲苯中，進(jìn)行脫蠟處理，隨后使用梯度酒精（如100%、95%、85%、75%）進(jìn)行水化。使用阿利新藍(lán)染色液（pH 2.5）染色10～20 min，自來(lái)水沖洗5 min，蒸餾水洗1 min，然后用過(guò)碘酸溶液染色10 min，自來(lái)水沖洗1 min，蒸餾水洗1 min，隨后用Schiff試劑室溫避光染色5～15 min，自來(lái)水沖洗5 min，蒸餾水洗1 min。使用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，最后乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。

1.6 免疫熒光染色觀察PEDV感染對(duì)杯狀細(xì)胞黏蛋白分泌的影響

參照AB-PAS染色步驟進(jìn)行水化。隨后，使用0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。5%BSA封閉，TritonX-100 通透20 min，隨后一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育2 h，DAPI核色染15 min，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。一抗使用PEDV-N多克隆抗體（1∶200）時(shí)，二抗使用 488標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（1∶200）；一抗使用 Muc 2多克隆抗體（1∶200）時(shí)，二抗使用 594標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）。

1.7 通過(guò)腸道干細(xì)胞建立杯狀細(xì)胞體外培養(yǎng)模型

參考Wang等［22］的方法，建立腸道干細(xì)胞氣液界面培養(yǎng)模型。采集7日齡健康三元仔豬（PEDV陰性）小腸組織，剪成3 cm小段后使用PBS漂洗，隨后置于含有EDTA的PBS在4 ℃中震蕩消化1 h。隨后，使用70 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾去除消化液中大體積的組織，并通過(guò)離心收集隱窩干細(xì)胞。將收集的干細(xì)胞用細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel重懸（含有EGF、Noggin、R-spondin和Rock抑制劑），37 ℃靜置至Matrigel凝固后，加入DMEM/F12培養(yǎng)基（含青鏈霉素、B27補(bǔ)充物、N2補(bǔ)充物等），等待其分化為具有絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)的腸類器官（Enteroids）模型。培養(yǎng)5 d后將豬小腸類器官消化為單細(xì)胞懸液，鋪設(shè)于Transwell小室，待其形成單層細(xì)胞后，棄去上室液體構(gòu)建氣液培養(yǎng)模型。該氣液培養(yǎng)模型培養(yǎng)7 d，其中杯狀細(xì)胞的陽(yáng)性率達(dá)到70%，可作為杯狀細(xì)胞體外模型用于后續(xù)研究。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.8 PEDV感染體外培養(yǎng)的杯狀細(xì)胞模型

待杯狀細(xì)胞分化完成，用 PBS清洗， 在Transwell小室上室添加PEDV病毒液感染細(xì)胞4 h（MOI=1）， 隨后棄去上清液， 在小室下室添加含有5 μg·mL-1胰酶的DMEM/F12空白培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于0、2、4、6、12和24 h分別收集細(xì)胞的RNA樣品，檢測(cè)PEDV在細(xì)胞中的生長(zhǎng)復(fù)制情況。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平

接毒后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間使用TRIzol法分別提取各孔細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)PEDV N、Muc2、SPDEF、TFF3、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAP2K1基因mRNA表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算，分析各組轉(zhuǎn)錄因子mRNA的水平變化。RT-qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix 5 μL，ddH2O 3.4 μL，總反應(yīng)體積為10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。RT-qPCR引物序列見(jiàn)表1。

1.10 Western blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路激活情況

將細(xì)胞表面上清吸出后用空白 DMEM 培養(yǎng)基清洗三遍，加入 200 μL 含有 1% PMSF 的 RIPA 強(qiáng)裂解液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上靜置 15 min 使細(xì)胞總蛋白完全釋放。將裂解的細(xì)胞蛋白液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 的無(wú)酶離心管中，12 000 r·min-1離心 15 min 后收集蛋白上清。用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后統(tǒng)一蛋白上樣量。按比例加入 5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸 15 min 使蛋白完全變性后進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳（60 V）。電泳完成后使用 eBlotTM L1 快速濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜（提前用甲醇活化），然后將轉(zhuǎn)印好的 PVDF 膜浸入 5%脫脂乳中室溫封閉2 h。隨后一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育2 h，使用 ECL 發(fā)光液顯色并拍攝照片。一抗使用 ERK多克隆抗體（1∶1 000）和p-ERK多克隆抗體（1∶2 000），二抗使用 HRP山羊抗兔IgG（1∶8 000），內(nèi)參使用 Anti-β-actin-HRP 抗體（1∶5 000）。

1.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）”表示，用GraphPad prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV感染導(dǎo)致腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量減少

收集口服感染PEDV 72 h后的仔豬的十二指腸、空腸和回腸腸段，進(jìn)行AB-PAS和免疫熒光染色觀察腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量和病毒感染情況。觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組腸絨毛正常，杯狀細(xì)胞分布均勻。而PEDV組腸絨毛萎縮，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少，該現(xiàn)象在PEDV陽(yáng)性細(xì)胞更多的空腸部位最為明顯（圖1）。鑒于PEDV陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況與腸道的損傷情況一致，表明PEDV感染是導(dǎo)致腸道損傷和杯狀數(shù)量減少的主要原因。

2.2 PEDV感染導(dǎo)致腸道杯狀細(xì)胞黏蛋白分泌功能受損

本研究使用Muc2（杯狀細(xì)胞特征性黏蛋白）抗體進(jìn)行免疫熒光染色，深入探究PEDV感染對(duì)杯狀細(xì)胞黏蛋白分泌功能的具體影響［18，23］。結(jié)果顯示，對(duì)照組杯狀細(xì)胞黏蛋白充盈，細(xì)胞分泌功能正常。而PEDV組杯狀細(xì)胞黏蛋白著色減少，細(xì)胞分泌功能受損，并且可以觀察到PEDV和Muc2定位于同一細(xì)胞的現(xiàn)象，說(shuō)明PEDV可以感染腸道杯狀細(xì)胞（圖2）。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在PEDV易感性更高的空腸部位，杯狀細(xì)胞黏蛋白減少最明顯，表明PEDV可以通過(guò)感染杯狀細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害其黏蛋白分泌功能。

2.3 杯狀細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立

本研究參照Wang等［22］的方法，建立豬小腸杯狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型（圖3A）。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞緊密排列。PAS結(jié)果顯示，培養(yǎng)模型中大部分細(xì)胞為杯狀細(xì)胞，占比超過(guò)70%（圖3B）。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第7天時(shí)，杯狀細(xì)胞培養(yǎng)模型的游離端（上室）存在明顯的黏液（圖3C），表明該體外培養(yǎng)能夠維持其分泌黏液的能力。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Muc2、TFF3和SPDEF等基因的轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)過(guò)程中均顯著升高（圖3D），表明該體外培養(yǎng)模型支持杯狀細(xì)胞的正常功能表達(dá)，為后續(xù)研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.4 PEDV感染導(dǎo)致杯狀細(xì)胞黏蛋白轉(zhuǎn)錄水平下降

在體外構(gòu)建杯狀細(xì)胞的PEDV接毒模型，并測(cè)定病毒在杯狀細(xì)胞中的復(fù)制曲線。結(jié)果表明，PEDV成功感染杯狀細(xì)胞并有效復(fù)制。病毒感染后的2～6 h為潛伏期，此階段病毒拷貝數(shù)保持穩(wěn)定，主要進(jìn)行病毒粒子的裝配工作；6～12 h進(jìn)入裂解期，與2 hpi相比，病毒拷貝數(shù)激增了23倍，表明病毒粒子在此階段實(shí)現(xiàn)了增殖；12～24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)PEDV拷貝數(shù)維持在較高的水平，保持病毒增殖的高峰狀態(tài)（圖4A和E）。進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)杯狀細(xì)胞黏蛋白相關(guān)基因表的達(dá)情況。結(jié)果顯示，從PEDV感染的潛伏期開(kāi)始，杯狀細(xì)胞中Muc2（杯狀細(xì)胞黏液骨架蛋白［23-24］）和TFF3（杯狀細(xì)胞黏液保護(hù)分子［25-26］）的轉(zhuǎn)錄水平即呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，并且這種轉(zhuǎn)錄抑制現(xiàn)象一直延續(xù)至感染平穩(wěn)期（圖4B和C）。免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步佐證了Muc2的含量下降，表明PEDV感染嚴(yán)重?fù)p傷杯狀細(xì)胞的分泌功能（圖4E）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黏蛋白上游基因SPDEF（杯狀細(xì)胞黏蛋白核心轉(zhuǎn)錄因子［27］）的轉(zhuǎn)錄水平同樣出現(xiàn)了顯著降低。這一發(fā)現(xiàn)提示，PEDV感染可能通過(guò)抑制黏蛋白轉(zhuǎn)錄因子SPDEF的表達(dá)，進(jìn)而降低黏蛋白表達(dá)（圖4D）。

2.5 PEDV感染抑制MAPK信號(hào)通路

MAPK信號(hào)通路在杯狀細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程中扮演著重要角色，既可以通過(guò)調(diào)控杯狀細(xì)胞的分化來(lái)影響其數(shù)量［28］，還可以通過(guò)調(diào)控杯狀細(xì)胞黏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)影響其黏液分泌功能［29］。為探究PEDV感染是否通過(guò)調(diào)控該通路影響杯狀細(xì)胞，收集了不同感染期的杯狀細(xì)胞RNA，并通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)MAPK通路激活情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，PEDV感染的潛伏期至平穩(wěn)期，MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵基因（MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAP2K1）轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)降低，ERK1/2磷酸化水平也下降（圖5）。這種抑制趨勢(shì)與黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)的時(shí)間高度吻合，表明PEDV感染可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的活性，從而損害杯狀細(xì)胞的數(shù)量和黏液分泌功能。

3 討 論

腸道杯狀細(xì)胞主要通過(guò)分泌黏蛋白，構(gòu)建起腸絨毛的保護(hù)屏障，為腸道抵御外界病原體提供了重要的防線［30］。近年來(lái)的研究顯示，杯狀細(xì)胞的數(shù)量與腸道對(duì)病原體的防護(hù)效果密切相關(guān)［31］，而其黏液分泌功能更是直接影響病原體的清除［32］。因此，當(dāng)病原體入侵時(shí)，杯狀細(xì)胞會(huì)做出積極響應(yīng)，通過(guò)增加數(shù)量［33］和迅速分泌大量黏液來(lái)抵御感染［7，34］。本研究觀察到，口服感染PEDV的仔豬腸道中，杯狀細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，且黏液分泌功能幾乎喪失。這種數(shù)量和功能的雙重打擊使得腸道對(duì)外部病原體的抵抗能力大幅下降，為PEDV的進(jìn)一步感染和復(fù)制創(chuàng)造了有利條件。此外，這種變化還可能增加腸道對(duì)其他病原體的易感性，進(jìn)而提高了繼發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少與空腸絨毛萎縮的嚴(yán)重程度正相關(guān)，這進(jìn)一步證實(shí)了杯狀細(xì)胞數(shù)量可以作為評(píng)估PEDV感染腸道病理學(xué)的一個(gè)重要指標(biāo)。采用免疫熒光染色技術(shù)觀察到PEDV與Muc2存在共定位現(xiàn)象，這再次證實(shí)了PEDV能夠入侵杯狀細(xì)胞，與前人的研究結(jié)果一致［35］ ，病毒可能通過(guò)感染杯狀細(xì)胞進(jìn)而影響?zhàn)ひ悍置诠δ堋?/p>

為了進(jìn)一步探究PEDV調(diào)控杯狀細(xì)胞黏液分泌的機(jī)制，參考Wang等［22］的方法，構(gòu)建了基于腸道干細(xì)胞的體外杯狀細(xì)胞培養(yǎng)模型。在該模型中，杯狀細(xì)胞占比高達(dá)70%，并且PEDV的復(fù)制模式與經(jīng)典的IPEC-J2細(xì)胞接毒模型相似［36］，具有典型的病毒生命周期，包括潛伏期（2～6 h）、裂解期（6～12 h）和穩(wěn)定期（12～24 h）。因此，該模型可以用于研究病毒感染對(duì)杯狀細(xì)胞的影響。與傳統(tǒng)細(xì)胞系相比，本研究構(gòu)建的模型保持了仔豬的遺傳信息和生理特點(diǎn)，更能真實(shí)地反映病毒感染對(duì)杯狀細(xì)胞的影響［9，37］。

利用上述模型發(fā)現(xiàn)，PEDV感染能夠顯著抑制杯狀細(xì)胞中黏蛋白相關(guān)基因（Muc2和TFF3）以及黏蛋白上游轉(zhuǎn)錄因子（SPDEF）的轉(zhuǎn)錄水平，這與本研究在體內(nèi)試驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象一致。這一結(jié)果證實(shí)了PEDV感染對(duì)杯狀細(xì)胞功能的損害，為了揭示損害機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)了相關(guān)的信號(hào)通路。杯狀細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程受多種信號(hào)通路的復(fù)合調(diào)控，其中MAPK信號(hào)通路處于核心地位。首先，MAPK信號(hào)通路可以影響杯狀細(xì)胞的分化過(guò)程，改變腸道杯狀細(xì)胞的數(shù)量［38］。其次，該信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞的黏液分泌功能。MAPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控啟動(dòng)子的活性來(lái)影響?zhàn)さ鞍祝ㄈ鏜uc2）的轉(zhuǎn)錄效率，從而精細(xì)調(diào)控黏液的產(chǎn)生［39］，因此，該通路的激活可以顯著增強(qiáng)黏蛋白基因的表達(dá)水平［40］。同時(shí)，MAPK信號(hào)通路也間接通過(guò)SPDEF調(diào)控杯狀細(xì)胞免疫活性因子（如TFF3）的表達(dá)［41］，進(jìn)一步調(diào)控杯狀細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染能夠顯著抑制MAPK信號(hào)通路活性，這可能是導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量減少和功能受損的重要原因。通過(guò)抑制這一通路，PEDV可能阻礙了杯狀細(xì)胞的補(bǔ)充機(jī)制，從而導(dǎo)致腸道中杯狀細(xì)胞的數(shù)量大幅下降，并且影響了黏蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的黏液不能正常表達(dá)，進(jìn)而損害杯狀細(xì)胞的黏液分泌功能。然而，影響杯狀細(xì)胞黏液分泌的因素還有很多，比如NLRP6炎癥小體［42］和EGFR-PI3K信號(hào)通路［43］。未來(lái)，還需要進(jìn)一步探究PEDV感染導(dǎo)致杯狀細(xì)胞功能受損的其他潛在機(jī)制，以期更全面地揭示PEDV對(duì)腸道健康的影響及其機(jī)制。

綜上所述，本研究在探明PEDV感染對(duì)腸道杯狀細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害后，通過(guò)建立體外杯狀細(xì)胞培養(yǎng)模型，進(jìn)一步解析了其潛在機(jī)制。本研究不僅加深了對(duì)PEDV致病機(jī)制的理解，還為開(kāi)發(fā)以杯狀細(xì)胞為中心的防御策略提供了理論基礎(chǔ)。未來(lái)，將繼續(xù)深入研究PEDV與杯狀細(xì)胞之間的相互作用，以期為防控PEDV感染提供新的思路和方法。

4 結(jié) 論

本研究指出PEDV感染會(huì)損傷仔豬腸道杯狀細(xì)胞，造成其數(shù)量減少并且降低其黏蛋白分泌水平。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建體外杯狀細(xì)胞培養(yǎng)模型，明確了PEDV可以感染杯狀細(xì)胞并且會(huì)抑制其黏蛋白產(chǎn)生，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路活性被抑制，初步探明病毒感染導(dǎo)致的MAPK信號(hào)活性的抑制是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的關(guān)鍵原因。本研究結(jié)果表明PEDV感染對(duì)腸道黏液屏障的影響，為后續(xù)開(kāi)發(fā)新的的防控策略提供了理論依據(jù)。

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（編輯 白永平）