豬IL-1β單克隆抗體制備及其抗炎癥反應(yīng)活性

摘 要：

IL-1β可介導(dǎo)炎癥病理，阻斷IL-1活性具有重要抗炎治療作用。本研究通過構(gòu)建豬IL-1β原核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)和蛋白純化，制備重組蛋白。采用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備獲得4株穩(wěn)定分泌IL-1β單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株（1E2、2H3、5H3及7E7）；4株單抗腹水ELISA效價高達(dá)1∶1 024 000；5H3單抗識別的抗原表位為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202KRYPKRD208。脂多糖（LPS）小鼠炎癥模型抗炎試驗結(jié)果顯示，相對LPS對照組，IL-1β單抗處理組小鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量及臨床癥狀評分顯著降低，表明4株單抗均有較好抗炎效果，其中1E2單抗抗炎作用最優(yōu)，為豬IL-1β阻斷藥物研究奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

IL-1β；單克隆抗體；炎癥治療

中圖分類號：

S852.659.6 """"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0890-10

收稿日期：2024-03-25

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32230103）；國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-35）；江蘇省自主創(chuàng)新研發(fā)基金項目（CX（22）1011）

作者簡介：李 璠（1997-），女，陜西漢中人，碩士生，主要從事動物傳染病學(xué)研究，E-mail：962392369@qq.com

*通信作者：姜 平，主要從事動物傳染病學(xué)研究，E-mail： jiangp@njau.edu.cn

Preparation and Anti-inflammatory Activity of Porcine IL-1β Monoclonal Antibody

LI" Fan， SUN" Haifeng， SUN" Meng， GAO" Yanxiao， SUN" Yangyang， ZHANG" Lujie， BAI" Juan， JIANG" Ping*

（Key Laboratory of Animal Bacteriology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：

IL-1β mediates inflammatory pathology， and blocking IL-1 activity has important anti-inflammatory effects. In this study， recombinant protein was prepared by constructing porcine IL-1β prokaryotic expression plasmid， expression by Escherichia coli and protein purification. Four hybridoma cell lines （1E2， 2H3， 5H3 and 7E7） with stable IL-1β monoclonal antibody secretion were prepared by cell hybridoma technique. The ELISA titer of the 4 mAbs in ascites were up to 1： 1 024 000. The epitope of 5H3 mAb was 149DLKREVVFCM158. The epitope recognized by 1E2， 2H3 and 7E7 mAb was 202KRYPKRD208. The anti-inflammatory test results of lipopolysaccharide （LPS） mice inflammation model showed that compared with LPS control group， serum NO， TNF-α， IL-6 and IL-1β contents and clinical symptom score of mice treated with IL-1β monoclonal antibody were significantly reduced， indicating that all the four strains of monoclonal antibody had better anti-inflammatory effect， and 1E2 monoclonal antibody had the best anti-inflammatory effect. It laid an important foundation for the study of porcine IL-1β blocking drugs.

Key words：

IL-1β; monoclonal antibody; inflammatory therapy

*Corresponding author：" JIANG Ping， E-mail： jiangp@njau.edu.cn

細(xì)胞因子是一種伴隨著炎癥、免疫激活、細(xì)胞分化及死亡的一種多肽，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1-2］。過度的免疫激活和細(xì)胞因子釋放可誘導(dǎo)發(fā)熱、血管滲漏、腹瀉、心肌病和肺損傷［3-5］。細(xì)胞炎性死亡可促進(jìn)成熟的IL-1β釋放到細(xì)胞，從而介導(dǎo)炎癥［6］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流行性腹瀉病毒等重要病原感染可產(chǎn)生IL-1β，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［7-9］。配合采用相應(yīng)的抗炎治療，將降低病毒感染的發(fā)病率及死亡率，可利于防止豬病情惡化。單克隆抗體及其衍生物，包括雙特異性抗體、抗體-藥物綴合物和抗體片段，是目前發(fā)展最快的一類治療分子［10］。目前尚無針對豬強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的IL-1抗體阻斷治療藥物。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得IL-1β重組蛋白，研制出4株單克隆抗體，采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）小鼠炎癥模型［11-13］，證明本研究研制的豬IL-1β單克隆抗體具有較好抗炎效果，為IL-1β阻斷藥物研究奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

地塞米松購自Solarbio公司；一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒（化學(xué)法）、小鼠腫瘤壞死因子α ELISA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素1 β ELISA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6 ELISA 試劑盒均購自Solarbio公司。2×Phanta Max Master Mix 和Pres-tained Protein Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP和HPR-SPA購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HisSep Ni-NTA Agarose Resin購自上海翊圣生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech 生物科技有限公司；TanonTM High-sig ECL Western blot 底物試劑盒購自天能科技有限公司；異丙基硫代-β-D半乳糖（IPTG）、PEG1450、50×HAT、50×HT和LPS購自美國Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）、大腸桿菌E. coli T1、Rosetta和BL21均由本實驗室保存。

SPF 級雌性ICR小鼠（4～5周齡，18～20 g），雌性BALB/c小鼠（6～8周齡）購自揚(yáng)州大學(xué)實驗動物中心。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)豬IL-1β（NCBI： NM_214055.1）基因序列， 選擇第115—268 aa活性基因部分，采用 TMHMM Serverv.2.0網(wǎng)站軟件進(jìn)行蛋白性質(zhì)分析，該部分均為胞外區(qū)。設(shè)計PCR引物：IL-1β-F：5′-CCGCTCGAGGCCAACGTGCAGTCTATGGAG-TGCAA-3′，含有XhoⅠ 酶切位點（下劃線處）；IL-1β-R：5′- CGCGGATCCGGGAGAGAGGACTTCCATGG-3′，含有BamH Ⅰ 酶切位點（下劃線處），用于擴(kuò)增IL-1β片段，大小為462 bp。提取豬肺泡巨噬細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。將目的片段和pCold Ⅰ載體通過XhoⅠ 和BamH Ⅰ 雙酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至T1菌，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定正確后送通用生物公司測序，結(jié)果比對正確，將重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-IL-1β于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

參考文獻(xiàn)［14］中的方法，將重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-IL-1β轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)，16 ℃培養(yǎng)6 h。收集菌體超聲破碎，分離上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)形式，采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白，純化IL-1β蛋白用超濾管進(jìn)行濃縮后測定蛋白濃度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 豬IL-1β單克隆抗體的制備

1.4.1 動物免疫

根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］，將純化后的重組IL-1β蛋白與等體積ISA206佐劑混合，充分乳化后皮下注射小鼠，50 μg·只-1，間接ELISA測定小鼠血清抗體效價，當(dāng)抗體效價≥1∶10 000時，用重組IL-1β蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫。3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4.2 細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞篩選

根據(jù)參考文獻(xiàn)［16-17］，取加強(qiáng)免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，按照7∶1的比例混合均勻，加入PEG1450進(jìn)行融合。將融合完成的細(xì)胞按照不同密度鋪至含有2% HAT選擇性培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，培養(yǎng)7 d左右，觀察雜交瘤長成小團(tuán)后，進(jìn)行全換液，間隔24～36 h取雜交瘤細(xì)胞上清，用間接ELISA抗體檢測方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行2～3次亞克隆。傳代至20代，擴(kuò)大培養(yǎng)至T25細(xì)胞瓶，于液氮中保存。

1.4.3 間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞

參考文獻(xiàn)［18］報道的方法，用重組IL-1β蛋白作為包被抗原，雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP作為二抗，融合前小鼠血清和SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液上清分別作為陽、陰性對照。測定每孔OD450 nm值，S/N＞2.1，則判定為陽性。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體細(xì)胞株分泌穩(wěn)定性及亞型鑒定

將陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，第5、10、15和20代各凍存2支細(xì)胞，并收集其營養(yǎng)液測定抗體效價。按照抗體亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行抗體亞型鑒定。

1.5.2 單克隆抗體的特異性反應(yīng)鑒定

取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染pCAGGS-IL-1β質(zhì)粒的293T細(xì)胞樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用制備的單抗培養(yǎng)液上清進(jìn)行Western blot反應(yīng)性鑒定。

1.6 腹水制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］，取8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射500 μL無菌液體石蠟。7 d后，腹腔注射3×106～4×106個雜交瘤細(xì)胞。7 d后觀察，小鼠腹部脹大，且觸之有波動感時，用頭皮針采集腹水。收集的腹水12 000 r·min-1離心10 min，取上清，分裝后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 B細(xì)胞抗原表位鑒定

根據(jù)豬IL-1β基因序列，設(shè)計12個截短體引物序列（表1），將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGEX-4T-1載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)，用 SDS-PAGE 驗證截短體是否成功表達(dá)。以雜交瘤上清作為一抗，通過 Western blot 鑒定單抗針對的B細(xì)胞抗原表位。

1.8 單克隆抗體小鼠抗炎效果測定

1.8.1 小鼠試驗1

根據(jù)文獻(xiàn)［20-22］報道的方法，將小鼠隨機(jī)分為空白組、LPS對照組、地塞米松組、單抗處理組（1E2、2H3、5H3、7E7），共7組，5只·組-1。地塞米松組和單抗處理組分別腹腔注射地塞米松（15 mg·kg-1）、單抗腹水原液200 μL，LPS對照組和空白組腹腔注射生理鹽水200 μL。各組處理1 h后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射LPS（15 mg·kg-1），觀察至第12小時，進(jìn)行眼球采血分離血清，測定NO、TNF-α、IL-6及IL-1β含量，或于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。NO的濃度測定采用NO含量檢測試劑盒通過化學(xué)法檢測。TNF-α、IL-6及IL-1β的濃度采用 ELISA 試劑盒檢測，按說明書操作。

1.8.2 小鼠試驗2

按試驗1方法分組和處理，單抗處理組選擇抗炎作用最強(qiáng)及最弱的兩組，共5組，5只·組-1。各組處理后1 h后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射LPS（15 mg·kg-1），飼養(yǎng)觀察3、6、9、12、24和36 h，記錄小鼠臨床癥狀，參考相關(guān)文獻(xiàn)［23］，按照表2評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，計算各組臨床計分平均值，并統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β基因表達(dá)與重組蛋白的制備

采用PCR方法擴(kuò)增豬IL-1β基因并克隆至pCold Ⅰ載體，經(jīng)過雙酶切鑒定以及測序比對正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，目的蛋白大小約18.4 ku，與預(yù)期大小一致（圖1A），包涵體純化濃縮后顯示單一條帶，說明純化效果較好（圖1B）。Western blot 結(jié)果顯示，重組IL-1β蛋白與 His抗體有良好的反應(yīng)特性（圖1C），可用作免疫原。

2.2 IL-1β免疫小鼠血清ELISA抗體測定

將IL-1β重組蛋白免疫小鼠，3次免疫后，免疫的5只小鼠血清效價均達(dá)到了1∶10 000，選擇其中抗體效價最高的小鼠，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，用于下一步細(xì)胞融合。

2.3 單克隆抗體制備及其效價測定

通過間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行亞克隆，最終獲得4株穩(wěn)定分泌豬IL-1β抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1E2、2H3、5H3和7E7。將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代至20代，每隔5代取細(xì)胞上清檢測抗體效價，結(jié)果顯示，效價基本穩(wěn)定。用4株雜交瘤細(xì)胞分別制備小鼠腹水并測定其效價，4株單抗制備的腹水ELISA效價為1∶（1.024～2.048）×106。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

ELISA結(jié)果顯示，1E2、2H3、7E7單抗重鏈屬于IgG1亞類，5H3單抗重鏈屬于IgG2b亞類，4株單抗輕鏈類型均屬于Kappa型。

2.5 單克隆抗體 Western blot 特異性鑒定

Western blot結(jié)果見圖2，4株單克隆抗體均能與轉(zhuǎn)染pCAGGS-IL-1β質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞樣品發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與未轉(zhuǎn)染pCAGGS-IL-1β質(zhì)粒的HEK 293T細(xì)胞樣品反應(yīng)。

2.6 單克隆抗體表位鑒定

SDS-PAGE檢測IL-1β 12個截短體蛋白，圖3（A）顯示其大小與理論相符。用GST抗體進(jìn)行Western blot 鑒定，圖3（B）顯示重組蛋白正確表達(dá)。

取IL-1β截短體蛋白，以4株IL-1β單克隆抗體進(jìn)行Western blot 鑒定，結(jié)果如圖4所示。5H3單抗所識別的抗原表位為149～158 aa，其氨基酸序列為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202～208 aa，其氨基酸序列為202KRYPKRD208。抗原表位所在的豬和小鼠IL-1β對應(yīng)的氨基酸序列比對結(jié)果如圖5所示。

2.7 IL-1β單抗抗炎效果測定

2.7.1 小鼠血清炎癥因子測定結(jié)果

LPS注射后12h，各組小鼠眼球采血，測定血清炎癥因子含量，結(jié)果表明：LPS對照組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β均明顯高于空白組（Plt;0.05）。地塞米松組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β均明顯低于LPS對照組 （Plt;0.05）。4株IL-1β單抗組結(jié)果顯示，1E2單抗處理組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β明顯低于LPS組（Plt;0.05），與地塞米松組相似；5H3和7E7單抗處理組TNF-α、IL-6和IL-1β明顯低于LPS組（Plt;0.05），與地塞米松組相似（Pgt;0.05）（圖6），試驗結(jié)果表明4株單抗均有抗炎效果，1E2單抗抗炎效果最好，相比之下2H3單抗抗炎效果最弱。

2.7.2 小鼠臨床觀察和臨床計分

為了進(jìn)一步明確IL-1β單抗治療炎癥效果，選擇上述拮抗小鼠血清炎癥因子效果最強(qiáng)和最弱的兩個單抗1E2和2H3進(jìn)行小鼠試驗，LPS刺激后觀察3、6、9、12、24和36 h，記錄各組小鼠臨床癥狀并計分，結(jié)果見表3。LPS對照組小鼠，在LPS刺激后6～36 h，眼結(jié)膜發(fā)炎，活動能力逐漸減弱，48h后共死亡2只小鼠。地塞米松組、1E2、2H3單抗處理組小鼠，在LPS刺激后6～12 h眼結(jié)膜發(fā)炎，活動能力逐漸減弱，12h后逐漸恢復(fù)，48h后基本恢復(fù)正常狀態(tài)。各時間點地塞米松組、1E2和2H3單抗組的臨床計分值顯著低于LPS對照組（Plt;0.05），表明1E2、2H3兩株單抗均有抗炎作用，且1E2單抗作用更強(qiáng)。

3 討 論

IL-1β和IL-18是炎性小體介導(dǎo)的活化后由caspase-1加工的重要炎性細(xì)胞因子［24］。IL-1β產(chǎn)生過量會導(dǎo)致自身免疫性并引起自身炎性疾?。?5］。IL-1可介導(dǎo)炎癥病理作用，阻斷IL-1活性藥物治療可快速減輕有些疾病嚴(yán)重程度，如心力衰竭［26］和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［27］。目前，3種IL-1阻滯劑已被批準(zhǔn)，分別為阿那白滯素、利洛那西普和卡那單抗［25］。本研究通過大腸桿菌表達(dá)豬IL-1β蛋白，并進(jìn)行純化，制備重組蛋白。采用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了4株IL-1β單克隆抗體（1E2、2H3、5H3及7E7），小鼠炎癥模型試驗證明其具有較強(qiáng)的抗炎作用，為IL-1β單抗藥物研究奠定了重要基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的單克隆抗體具有完整的抗體結(jié)構(gòu)，具有結(jié)合抗原和內(nèi)源性免疫受體的固有能力［10，28］。該類生物治療劑需要具備高穩(wěn)定性、特異性和適應(yīng)性等特點［29］。本研究制備的4株IL-1β單克隆抗體（1E2、2H3、5H3及7E7），其中1E2、5H3及7E7單抗腹水ELISA效價高達(dá)1∶2 048 000，2H3單抗腹水ELISA效價1∶1 024 000。小鼠抗炎試驗結(jié)果顯示，1E2、5H3及7E7抗炎效果優(yōu)于2H3。該結(jié)果表明IL-1β單抗抗炎活性可能與其抗體效價有關(guān)，單抗親和力有待進(jìn)一步測定。

豬和小鼠的IL-1β基因核苷酸序列相似性為74.5%，推導(dǎo)的氨基酸序列相似性性為65.4%。本研究單抗識別的B細(xì)胞抗原表位結(jié)果顯示，5H3單抗所識別的抗原表位為149～158 aa，其氨基酸序列為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202～208 aa，其氨基酸序列為202KRYPKRD208。這兩個抗原表位在豬和小鼠的IL-1β對應(yīng)的氨基酸序列存在一些差異，而IL-1β單抗小鼠炎癥模型試驗證明其具有抗炎活性，提示單抗識別的抗原表位中關(guān)鍵氨基酸功能位點有待進(jìn)一步研究。本研究選擇地塞米松作為抗炎治療試驗陽性對照，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。

小鼠單抗藥物進(jìn)入人體會引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致其被加速清除［30-31］。因此，治療性抗體一般需要將小鼠抗體的氨基酸序列進(jìn)行基因工程人源化改造，形成嵌合抗體。本研究通過小鼠試驗證明IL-1β單抗1E2具有顯著抗炎作用。小鼠單抗腹水原液含有白蛋白、血清白蛋白、脂類蛋白等成分，但單抗效價比較高，腹腔注射劑量僅200 μL·只-1，小鼠注射后沒有異常臨床表現(xiàn)。當(dāng)然，為了避免其它因素干擾，選用純化單抗進(jìn)行治療試驗更佳。目前，生豬疾病較多，炎癥病理反應(yīng)比較普遍，后續(xù)研究可通過IL-1β單抗基因測序，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建小鼠-豬嵌合抗體，延長抗體的半衰期并且降低其免疫原性，可為豬病臨床治療提供新的抗體治療制劑奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究研制4株豬IL-1β單克隆抗體，鑒定出2個IL-1β蛋白抗原表位，分別位于149DLKREVVFCM158和202KRYPKRD208。通過小鼠試驗證明IL-1β單抗1E2具有顯著抗炎作用，與地塞米松組相似，可用于豬IL-1β阻斷藥物的進(jìn)一步研究。

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（編輯 白永平）