番茄HD-Zip家族基因鑒定及非生物脅迫下HD-ZipⅢ亞家族基因的表達分析

關鍵詞：番茄；HD-Zip家族；生物信息學分析；基因表達：非生物脅迫

中圖分類號：S641.2：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0011-11

番茄（Solanum lycopersicum L.）是茄科茄屬的一年生草本植物，是全世界栽培最為普遍的果菜之一，也是全球種植面積最大的園藝作物之一，年產(chǎn)量呈逐年增加趨勢。

HD-Zip是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它的特點是具有兩個基本序列——同源結構域堿基序列和亮氨酸拉鏈堿基序列。HD-Zip家族成員參與了植物根、莖、葉、花、果實等器官的形成和生長發(fā)育，并在植物對光周期、溫度、干旱、鹽堿等多種逆境的響應過程中起著重要作用。HD-Zip家族分為四個亞家族：HD-Zip Ⅰ、HD -ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ，不同亞家族的成員具有不同的功能和表達模式：HD-Zip Ⅰ主要參與非生物脅迫及環(huán)境適應性，對植物的生長發(fā)育和逆境響應起著重要作用，其表達水平受光周期、溫度、干旱和鹽堿等多種環(huán)境因素的影響；HD-ZipⅡ主要參與植物對生物和非生物逆境的響應，如蟲害、病害以及干旱、高鹽、低溫等，植物可通過調(diào)整體內(nèi)HD-ZipⅡ的表達水平來更好地適應環(huán)境；HD-ZipⅢ主要在植物的根和莖發(fā)育過程中起著關鍵的調(diào)控作用，同時還參與了植物對各種脅迫的響應；HD-ZipⅣ主要在表皮細胞中特異表達，對表皮細胞的發(fā)育、毛狀體的形成等起重要作用。

目前，HD-Zip家族基因在黃瓜、蘋果等作物中都已經(jīng)被鑒定，但在番茄中的研究還較少。本研究以番茄基因組為基礎，利用生物信息學方法系統(tǒng)鑒定番茄HD-Zip家族基因，并對各成員進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和進化樹分析、染色體定位、共線性分析、基因結構及順式作用原件分析，同時探究HD-ZipⅢ成員在低溫、鹽、干旱、脫落酸（ABA）處理下的表達特性，旨在為深入研究HD-ZipⅢ家族基因在番茄響應逆境脅迫中的作用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1番茄HD-Zip家族基因的鑒定

番茄的全基因組數(shù)據(jù)從番茄基因組網(wǎng)站SolGenomics Network（https：//solgenomics.net）獲得，擬南芥全基因組數(shù)據(jù)在TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org）下載。采用BLAST的Blastp程序進行全基因組檢索（設置參數(shù)Elt;10^--10，相似性gt;40%），獲得與擬南芥HD-Zip相似性較高的番茄HD-Zip序列，再與PlantTFDB（Plant Tran-scription Factor Database， https：//planttfdbgao-lab.org）網(wǎng)站中的番茄HD-Zip序列進行比對，最終篩選出56個番茄HD-Zip家族基因。利用軟件TBtools對蛋白序列的基本理化性質(zhì)，如氨基酸數(shù)目、等電點和分子質(zhì)量等進行預測。

1.2番茄HD-Zip家族成員系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA軟件對擬南芥及篩選出的番茄HD-Zip氨基酸序列進行多序列比對分析，并通過鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，自展值（Bootstrap）設定為1000。利用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。

1.3番茄HD-Zip家族基因共線性分析

使用TBtools軟件進行番茄HD-Zip家族基因的基因組內(nèi)共線性分析以及與擬南芥基因組間的共線性分析，并進行物種內(nèi)和物種間共線性的可視化處理。

1.4番茄HD-Zip家族基因染色體定位分析

在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中搜索HD-Zip家族基因的染色體定位信息，利用TBtools生成染色體分布圖。

1.5番茄HD-Zip家族基因結構和motif分析

應用在線工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/）預測分析番茄HD-Zip蛋白序列的motif，搜尋motif值設置為10，其他參數(shù)設定為默認值。應用NCBI的在線工具NCBI Batch Web CD-Search Tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）預測分析番茄HD-Zip家族成員的保守結構域。番茄HD-Zip家族成員的外顯子和內(nèi)含子位置信息參考基因組注釋信息GFF文件，最后利用軟件TBtools中的（Gene Structure View）進行可視化處理。

1.6番茄HD-Zip家族基因順式作用原件分析

利用TBtools提取HD-Zip家族基因5’端上游2.0 kb序列作為啟動子序列，在Plant CARE在線網(wǎng)站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件分析，最后利用TBtools篩選保留常見功能元件并利用“Gene Structure View（ Advanced）”繪制可視化圖。

1.7番茄HD-ZipⅢ亞家族成員的表達模式分析

1.7.1基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達模式

從公開的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（http：//ted.bti.cornell.edu）和番茄eFP網(wǎng)站（http：//bar.utoronto.ca/efp_tomato/cgi-bin/efpWeb.cgi）獲得番茄品種Heinz的組織表達數(shù)據(jù)，包括整根、葉片、未開放的花蕾、完全開放的花、直徑1cm果、直徑2cm果、直徑3cm果、成熟的綠果、開始轉(zhuǎn)色的果實和轉(zhuǎn)色后10d的果實。

1.7.2不同非生物脅迫下的表達分析 為了研究HD-ZipⅢ亞家族基因在低溫、鹽、干旱和ABA四種非生物脅迫下的表達規(guī)律，選用番茄品種Ailsa Craig進行實驗。番茄幼苗在人工氣候室內(nèi)培育，光周期為16h/8h（光／暗），溫度為（25±1）℃。選擇生長相對均勻的四葉一心期番茄植株進行脅迫處理：將番茄植株轉(zhuǎn)移到4℃培養(yǎng)箱中進行冷處理：將植株根部浸泡在200 mmol/L NaCl溶液中進行鹽脅迫處理；對番茄幼苗噴施100μmol/L ABA，進行ABA處理：用20% PEG6000溶液浸泡植株根部，模擬干旱脅迫。每個處理設置3個生物學重復，每個重復12株幼苗，分別于處理0、3、6、9、12、24 h采集番茄幼苗同一部位的葉片，置于液氮中迅速冷凍保存。

1.7.3RNA提取和定量實時PCR分析 使用翌圣生物科技（上海）股份有限公司的MolPure（R）TRleasyTM Plus Total RNA Kit試劑盒從樣本中提取總RNA。隨后，采用該公司的Hifair（R）@Ⅲ1 stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。使用NCBI Primer-BIAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計了HD-ZipⅢ基因的特異性引物（表1）。熒光定量采用北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司的2×RealStar Probe Fast Mixture試劑盒，PCR反應體系總體積為20μL（包括cDNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，qPCR Mix 10μL，ddH₂O補齊至總體積），使用LightCycler480Ⅱ儀器（羅氏，德國）進行qRT-PCR。PCR程序設置為：95℃預變性5 min;隨后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性15s，60℃退火30s。每組分析3個生物學重復，每個反應分析3個技術重復。番茄β-Actin基因（Solyc039078400）用作內(nèi)部對照?；虻南鄬Ρ磉_量使用2^-ΔΔCt方法計算，用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理，通過GraphPadPrism中文版進行誤差分析和繪圖。

2結果與分析

2.1番茄HD-Zip家族成員理化性質(zhì)分析

從番茄全基因組中共鑒定出56個HD-Zip家族基因（表2），其編碼蛋白序列長度為174～851個氨基酸，Solyc07g062790的最短，Solyc02g024070的最長；分子量為20255.06～93508.51 Da，Solyc07g062790的最小，Solyc08g076370的最大；等電點為4.57～9.54，Solycllg010270的最低，Solyc07g054380的最高，其中73.21%的蛋白等電點小于7，表明番茄HD-Zip家族可能是一類酸性蛋白：不穩(wěn)定指數(shù)為34.55～73.16，Solyc069050160的最小，Solyc05g008050的最大，其中94.64%的蛋白為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)大于40）；脂肪指數(shù)在55.94～90.79，Solyc06g060830的最小，Solyc06g035940的最大；所有番茄HD-Zip蛋白的總平均疏水指數(shù)（GRAVY）均lt;0，表現(xiàn)為親水性。

2.2番茄HD-Zip家族成員進化樹分析

將篩選到的56條番茄HD-Zip蛋白序列與已知的擬南芥HD-Zip蛋白序列進行進化樹構建，結果（圖1）顯示，這些蛋白序列被聚為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞家族，并且番茄每個亞家族的占比與擬南芥的相似，均為Ⅰ和Ⅳ亞家族的占比最大，Ⅲ亞家族的占比最小。通過進化樹還可以看出，Ⅲ和Ⅳ亞家族先聚為一支，然后才分為兩支，說明這兩個亞家族的HD-Zip蛋白親緣關系更近。

2.3番茄HD-Zip家族基因的共線性分析

對番茄HD-Zip家族成員的基因組內(nèi)共線性分析發(fā)現(xiàn)，除了9號染色體外，其他染色體上均有HD-Zip基因存在共線性，共有30個番茄HD-Zip家族成員間存在共線性（圖2），表明這些成對的共線性基因可能有相似的功能。通過番茄與擬南芥的基因組間共線性分析發(fā)現(xiàn)，兩個物種間共有34對存在共線性的HD-Zip家族基因（圖3）。

2.4番茄HD-Zip家族基因的染色體定位

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，番茄HD-Zip家族基因不均勻地分布在12條染色體上，其中，2、3號染色體上分布的基因數(shù)量最多，分別為9、10個，基因在2號染色體上僅分布在下端，而在3號染色體上下端均有分布；7、9、10、12號染色體上分布的基因數(shù)最少，僅2個：其他染色體上分布的基因數(shù)在5個左右（圖4）。

2.5番茄HD-Zip家族成員的基因結構分析

通過對番茄56個HD-Zip家族蛋白進行保守基序檢索，共確認了10個不同的基序（Motif 1—Motif 10），其中，所有蛋白序列都包含Motif 1、Motif 2和Motif 3，這三個保守基序構成了HD-Zip家族特征的保守基序HD、LZ，并且各亞家族內(nèi)的基序比較一致，其中HD-ZipⅢ和Ⅳ兩個亞家族包含的Motif數(shù)量最多，可能具有多樣的生物學功能（圖5a）。

通過CD-search的Pfarm數(shù)據(jù)庫檢索到HD-Zip家族成員的保守結構域，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關系發(fā)現(xiàn)各亞家族內(nèi)成員具有相似的結構域（圖5b）。

對番茄HD-Zip家族基因的外顯子和內(nèi)含子分布情況進行分析，結果（圖5c）顯示，HD-Zip Ⅰ與Ⅱ亞家族的基因長度比較接近，內(nèi)含子0～3個，外顯子1～4個；Ⅲ與Ⅳ亞家族的基因長度相近，內(nèi)含子6～13個，外顯子7～18個，其中Ⅲ亞家族的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量最多。

2.6番茄HD-Zip家族成員順式作用元件分析

為了更好地預測番茄HD-Zip家族基因的生物學功能，對其5′UTR上游2 kb的啟動子序列進行順式作用元件預測，并主要挑選與脅迫及激素響應有關的順式作用元件進行分析，旨在探究番茄HD-Zip家族基因與非生物脅迫及激素的響應關系。結果（圖6）顯示，茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件出現(xiàn)的頻率最高，其次是脫落酸響應元件、厭氧感應元件、光響應元件，說明番茄HD-Zip家族基因與這些生物學功能有關。

2.7基于轉(zhuǎn)錄組分析揭示HD-ZipⅢ亞家族基因的表達模式

對番茄HD-ZipⅢ亞家族5個基因的表達模式進行轉(zhuǎn)錄組分析，結果（圖7）發(fā)現(xiàn)，這5個HD-ZipⅢ亞家族基因均在番茄根中高表達，具有根特異性。此外，Solyc12g1044410在轉(zhuǎn)色后10d的果實中有較高表達，Solyc03g120910在3cm未成熟果實中高表達，Solyc02g024070在未開放花蕾中表達量較高。

2.8番茄HD-ZipⅢ亞家族基因在冷、鹽、干旱和ABA脅迫下的表達分析

為進一步研究HD-ZIPⅢ亞家族基因的生物學功能，利用qRT-PCR方法分析了該亞家族的5個基因在冷、鹽、干旱和ABA脅迫處理下的表達量變化，結果表明，在冷脅迫下（圖8a），Solyc03g120910、Solyc12g044410和Solyc02g024070的表達量總體均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，前者在處理6h的表達量達到最高，后兩者處理12h的表達量最高；Solyc08g066500的表達量先下降后上升，Solyc11g1069470的表達量整體呈下降趨勢；5個基因中Solyc03g120910對冷脅迫的響應最強，處理6h時的表達量比Oh上調(diào)了10.3倍。在鹽脅迫下（圖8b），Solyc03g120910的表達量先下降后上升，處理24h的表達量最高；Solyc02g024070的表達量整體呈下降趨勢，其他基因的表達量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；其中Solyc11g069470對鹽脅迫的響應最強，處理3h時的表達量比Oh上調(diào)了1.0倍。在干旱脅迫下（圖8c），Solyc08g066500和Solyc02g024070的表達量總體呈下降趨勢，Solyc12g044410和Solyc11g069470的表達量整體呈上升趨勢，Solyc03g120910的表達量整體呈先上升后下降趨勢；其中Solyc03g120910對干旱脅迫的響應最強，處理6h時的表達量最高，與0h相比上調(diào)了1.6倍。在ABA脅迫下（圖8d），5個基因的表達量變化相似，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且都在處理6h時達到最高，其中Soly08g066500對ABA脅迫的響應最強，處理6h時與Oh相比表達量上調(diào)了5.4倍。另外，同一基因在不同的非生物脅迫下表達量差異也比較明顯，如So-ly08g066500在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達量變化趨勢相反，Solyc03g120910在鹽脅迫下與其他脅迫下的表達量變化趨勢相反，說明該亞家族基因在不同非生物脅迫中發(fā)揮的作用不同。

3討論與結論

植物的生長發(fā)育過程離不開轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子影響著植物發(fā)育各階段的生物功能，本試驗利用生物信息學方法，從全基因組水平對番茄HD-Zip家族基因進行鑒定和系統(tǒng)研究，共鑒定到56個HD-Zip家族基因，與擬南芥、黃瓜相比數(shù)量相對較多，而且這些基因在染色體上的分布并不均勻，這與在黃瓜和擬南芥中的研究一致。系統(tǒng)進化分析結果顯示，番茄HD-Zip家族也分為了四個亞家族，其中，Ⅲ和Ⅳ亞家族基因來自同一個大的分支，親緣關系較近，這與祁存英等在青稞中的研究結果相似。前人在黃瓜、青稞、甜瓜上的研究發(fā)現(xiàn)HD-ZipⅢ亞家族成員數(shù)量最少，本研究對番茄的研究也得出同樣的結論，說明該亞家族高度保守。

前人在辣椒以及馬鈴薯HD-Zip家族基因共線性分析時發(fā)現(xiàn)，許多該家族基因之間存在共線性，這與本研究在番茄上得出的結論相一致，說明片段復制是HD-Zip家族擴增的主要原因。分析番茄HD-Zip家族成員的基因結構發(fā)現(xiàn)，各亞家族內(nèi)的基因結構都比較接近.I和Ⅱ亞家族基因的外顯子數(shù)量較少，Ⅲ和Ⅳ亞家族基因的外顯子數(shù)量較多，這與尹麗娟等在甜瓜上的研究結果比較一致，說明Ⅰ和Ⅱ亞家族的基因結構比較簡單，Ⅲ和Ⅳ亞家族的基因結構比較復雜。對番茄HD -Zip家族基因進行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)每個亞家族內(nèi)的基因啟動子區(qū)順式作用元件基本相同，但不同亞家族的順式作用元件出現(xiàn)頻率不同，其中，Ⅰ亞家族中MYB響應元件出現(xiàn)頻率最高，Ⅱ亞家族中脫落酸響應元件出現(xiàn)頻率最高，Ⅲ和Ⅳ亞家族中厭氧誘導作用元件出現(xiàn)頻率最高，這與周佩娜等在荊芥中得出的不同亞家族的順式作用元件不同相一致。

對番茄HD-ZipⅢ亞家族基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，該亞家族基因均在番茄根中特異性表達。前人研究發(fā)現(xiàn)非生物脅迫對HD-ZipⅢ亞家族基因的表達有顯著影響，因此，本研究利用qRT -PCR分析了番茄該亞家族基因在冷、鹽、干旱和ABA脅迫下的表達情況，結果表明，四種非生物脅迫對5個HD-ZipⅢ亞家族基因的表達量均有較大影響，不同基因在不同脅迫下的表達不同，其中，Soly03g120910在冷脅迫下表達量顯著提高，同時還受干旱脅迫誘導上調(diào)表達；Solyc11g069470對鹽脅迫響應最強，而So-ly08g066500對ABA處理響應最強。

本研究從番茄基因組中共鑒定出56個HD-Zip家族基因，分為四個亞家族，其中HD-ZipⅢ亞家族基因?qū)?、鹽、旱、ABA等非生物脅迫都能做出響應，但不同基因?qū)Σ煌{迫的響應不同。本研究結果可為番茄HD-Zip家族成員的生物學功能研究與HD-ZipⅢ亞家族抗非生物脅迫分子機制研究提供參考，同時為耐脅迫新品種分子育種提供方向。