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    水楊酰腙型高選擇性鋁離子熒光探針的合成及其應(yīng)用研究

    2025-03-15 00:00:00譚浩雪王忠龍楊曉琴饒小平趙平姜倩
    分析化學(xué) 2025年2期
    關(guān)鍵詞:識(shí)別

    摘要 本研究以香草醛衍生物為原料合成了4 種水楊酰腙型化合物(L1~L4),采用核磁共振(NMR)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。光學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針L1 和L3 可作為鋁離子(Al3+)熒光探針,加入Al3+后,探針L1 溶液的熒光顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色,檢出限為25.1 nmol/L。與探針L1 相比,探針L3 與Al3+絡(luò)合后溶液熒光顏色由無色變色綠色,檢出限為17.3 nmol/L。探針L1 和L3 在Al3+檢測(cè)方面具有響應(yīng)時(shí)間短、選擇性好和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。通過HRMS 和1H NMR 證明了探針L1 和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針L1 和L3 的細(xì)胞毒性低,在檢測(cè)生物體內(nèi)Al3+方面具有較大的應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞 熒光探針;水楊酰腙型化合物;鋁離子;識(shí)別;細(xì)胞成像

    作為地殼中含量最豐富的金屬元素,鋁元素被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、水凈化處理和藥物合成等多個(gè)領(lǐng)域[1-5]。然而,鋁元素的不合理使用導(dǎo)致環(huán)境中游離的Al3+過量積累,對(duì)生態(tài)系統(tǒng)以及人體健康造成嚴(yán)重影響。人體內(nèi)Al3+的過量積累對(duì)鈣的吸收有嚴(yán)重干擾,并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及其他器官造成嚴(yán)重?fù)p害,進(jìn)而引起多種疾病,如骨質(zhì)疏松癥、帕金森癥和阿爾茲海默病等[6-9]。此外,環(huán)境中過量積累的Al3+會(huì)對(duì)植物以及海洋生物產(chǎn)生致命影響[10-11]。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中Al3+濃度的最高限量值為7.41 μmol/L[12-14]。因此,對(duì)環(huán)境及生物體中Al3+的含量進(jìn)行分析,建立一種高靈敏度、高選擇性的Al3+快速檢測(cè)方法具有重要意義。

    目前, Al3+檢測(cè)方法包括高效液相色譜法(HPLC)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)和原子發(fā)射光譜法(AES)[15-18]等。與這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比,熒光探針法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速、可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),在監(jiān)測(cè)活細(xì)胞及生物組織內(nèi)分析物含量方面發(fā)揮了重要作用[19-21]。近年來,研究者開發(fā)了一系列用于Al3+檢測(cè)的高選擇性、高靈敏度熒光探針,初步實(shí)現(xiàn)了生物組織內(nèi)Al3+的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[22-24]。但是,目前的Al3+熒光探針依然存在細(xì)胞毒性高、合成過程復(fù)雜等問題。設(shè)計(jì)開發(fā)合成簡(jiǎn)單、光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異的新型Al3+熒光探針是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

    席夫堿類熒光探針因其成本低、絡(luò)合能力強(qiáng)、合成簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間短和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注;同時(shí),較低的細(xì)胞毒性、良好的光穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的細(xì)胞穿透力使其被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)多種分析物的檢測(cè)。席夫堿類化合物結(jié)構(gòu)中C=N 與苯環(huán)形成的共軛結(jié)構(gòu)使得探針呈弱熒光發(fā)射,而結(jié)構(gòu)中的亞胺或甲亞胺基團(tuán)(–RC=N–)為金屬離子絡(luò)合提供了富氮、富氧的配位環(huán)境[25-27]。與金屬離子配位后,共軛剛性骨架的形成引起體系熒光強(qiáng)度顯著變化,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量金屬離子的檢測(cè)[28-32]。近年來,研究者開發(fā)了很多席夫堿類熒光探針, Tomer 等[33]設(shè)計(jì)合成了席夫堿類Cu2+熒光探針并將其應(yīng)用于環(huán)境水樣品中Cu2+的檢測(cè); Fu 等[34]合成了席夫堿類化合物并將其應(yīng)用于Zn2+和Al3+的檢測(cè),該雙功能熒光探針可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Zn2+和Al3+的痕量檢測(cè);Liu 等[35]合成了一系列席夫堿類化合物,并將其應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)Al3+的檢測(cè)。

    香草醛作為唯一商業(yè)化的芳香類木質(zhì)素衍生物,其來源廣、價(jià)格低,具有極大的工業(yè)化潛力。此外,從結(jié)構(gòu)上來看,香草醛及其衍生物作為有機(jī)合成的重要中間體,具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性,易于通過化學(xué)合成方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。本研究以鄰香草醛、香草醛、水楊醛和間茴香醛為原料,與水楊酰肼反應(yīng),合成了4 種水楊酰腙型化合物(L1~L4),對(duì)比了這4 種化合物與Al3+的熒光響應(yīng)情況,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和核磁共振氫譜(1H NMR)探究了Al3+的響應(yīng)機(jī)理。最后,通過細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了探針在細(xì)胞內(nèi)痕量Al3+檢測(cè)方面的應(yīng)用潛力。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    F-7100 熒光分光光度計(jì)和UH5300 紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司);JMS-800D 高分辨質(zhì)譜儀(日本電子株式會(huì)社);FM-4P-TCSPC 瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(德國HORIBA JobinYvon 公司);AV 400 MHz 核磁共振波譜儀(德國Bruker 公司);STARTER2100 pH 測(cè)試儀(奧豪斯儀器(上海)有限公司);N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);TCS SP8 共聚焦顯微鏡(德國Leica 公司)。

    香草醛、鄰香草醛、水楊醛、間茴香醛、水楊酰肼、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇、無水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺及其它試劑均購自上海泰坦科技股份有限公司。所用試劑均為分析純,不經(jīng)進(jìn)一步處理,直接使用。

    1.2 合成方法

    實(shí)驗(yàn)所用化合物L(fēng)1~L4 的合成路線如式(1)所示:

    1.2.1 化合物L(fēng)1 的合成

    將水楊醛(244.24 mg, 2 mmol)和水楊酰肼(304.30 mg, 2 mmol)加入到無水乙醇(30 mL)中,加熱回流2 h,采用薄層色譜(TLC)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后,減壓濃縮回收溶劑,得到387.34 mg 黃色固體L1,產(chǎn)率為75.08%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ∶12.04(s, 1H)、11.80(s, 1H)、11.21(s, 1H)、8.69(s, 1H)、7.90(dd, J=8.0, 1.7 Hz, 1H)、7.57(dd, J=7.7, 1.7 Hz, 1H)、7.46(ddd, J=8.6, 7.2, 1.6 Hz,1H)、7.32 (ddd, J=8.5, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 6.97(ddd, J=15.4, 8.0, 4.2 Hz, 4H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ∶164.97、159.48、157.98、149.42、134.45、132.09、129.92、129.05、119.87、119.49、119.09、117.77、116.92、116.09。HRMS(ESI)calcd for C14H12N2O3 [M+H]+ 257.9423, found 257.9431 (詳見電子版文后支持信息圖S1~S3)。

    1.2.2 化合物L(fēng)2 的合成

    將間茴香醛(272.45 mg, 2 mmol)和水楊酰肼(304.30 mg, 2 mmol)加入到無水乙醇(30 mL)中,加熱回流2 h,采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后,減壓濃縮回收溶劑,得到412.31 mg 棕色固體L2,產(chǎn)率為76.07%。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ∶12.12(s, 2H)、8.80(s, 1H)、7.90(ddd, J=13.2, 7.8, 1.7 Hz,2H)、7.44(qd, J=8.4, 1.8 Hz, 2H)、7.13(d, J=8.4 Hz, 1H)、7.04(t, J=7.5 Hz, 1H)、6.98~6.82(m,2H)、3.88(s, 3H)。13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ∶165.62、160.59、158.35、144.49、134.27、132.27、128.74、126.09、122.59、121.25、118.88、117.99、116.01、112.37、56.19。HRMS(ESI) calcd forC15H14N2O3[M+H]+271.1075, found 271.1082(詳見電子版文后支持信息圖S4~S6)。

    1.2.3 化合物L(fēng)3 的合成

    將鄰香草醛(304.25 mg, 2 mmol)和水楊酰肼(304.30 mg, 2 mmol)加入到無水乙醇(30 mL)中,加熱回流10 h,采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后,減壓濃縮回收溶劑,得到446.13 mg 黃色固體L3,產(chǎn)率為77.69%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ∶11.94(d, J=14.2 Hz, 2H)、10.95(s, 1H)、8.75(s, 1H)、7.95(dd, J=8.0, 1.7 Hz, 1H)、7.57~7.44(m, 1H)、7.22(d, J=7.8 Hz, 1H)、7.13~7.07(m, 1H)、7.07~6.97(m, 2H)、6.92(t, J=7.9 Hz, 1H),、3.87(s, 3H)。13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ∶165.00、159.55、149.31、148.45、147.71、134.41、129.06、121.20、119.56、119.44、119.35、117.78、116.15、114.42、56.30。HRMS(ESI)calcd for C16H16N2O3[M+H]+287.1051, found 287.1060(詳見電子版文后支持信息圖S7~S9)。

    1.2.4 化合物L(fēng)4 的合成

    將香草醛(304.25 mg, 2 mmol)和水楊酰肼(304.30 mg, 2 mmol)加入到無水乙醇(30 mL)中,加熱回流10 h,采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后,減壓濃縮回收溶劑,得到434.59 mg 黃色固體L4,產(chǎn)率為75.68%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ∶11.98(s, 1H)、11.73(s, 1H)、9.70(d, J=63.5 Hz, 1H)、8.36(s, 1H)、7.90(dd, J=8.0, 1.7 Hz, 1H)、7.44(ddd, J=8.5, 7.1, 1.7 Hz, 1H)、7.34(d, J=1.9 Hz, 1H)、7.12(dd, J=8.2, 1.9 Hz, 1H)、7.01~6.92(m, 2H)、6.86(d, J=8.1 Hz, 1H)、3.84(s, 3H)。13C NMR(101 MHz, DMSO-d6),δ∶165.08、159.70、149.81、149.71、148.52、134.18、128.81、125.92、122.89、119.33、117.77、116.22、115.93、109.53、56.02。HRMS(ESI)calcd for C16H16N2O3[M+H]+ 287.1051,found 287.1060(詳見電子版文后支持信息圖S10~S12)。

    1.3 溶液配制及光譜測(cè)試條件

    將化合物L(fēng)1~L4 分別溶于DMF-H2O(1∶1, V/V)中,制備濃度為1.0 mmol/L 的探針母液,光譜測(cè)試時(shí)將探針母液稀釋至10 μmol/L。在靈敏度測(cè)試實(shí)驗(yàn)中,以AlCl3 配制不同濃度的Al3+溶液,分別滴入探針溶液中,記錄在不同濃度Al3+條件下探針溶液的熒光光譜變化情況。Al3+的檢出限(LOD)的計(jì)算公式為:LOD=3σ /k,其中, σ為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差, k 為熒光強(qiáng)度與探針濃度的斜率。配制濃度為100 μmol/L 的不同金屬離子溶液(Ca2+、Cr3+、Cu2+、Cd2+、Al3+、Ni3+、Co2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Hg+和Ag+),在選擇性實(shí)驗(yàn)中,將不同金屬離子溶液分別加入探針溶液中,記錄金屬離子加入后探針溶液熒光光譜的變化情況。在干擾性實(shí)驗(yàn)中,將Al3+分別加入到含有不同金屬離子的探針溶液中,記錄加入后體系的熒光光譜變化。

    在pH 響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,使用HCl 或NaOH 配制不同pH 值的探針溶液,并加入100 μmol/L Al3+,記錄熒光光譜的變化。動(dòng)力學(xué)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,記錄加入Al3+后體系在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光光譜變化情況。熒光光譜測(cè)試中的激發(fā)波長為375 nm,狹縫寬度為3 nm/5 nm。

    1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

    通過CCK-8 法考察探針對(duì)HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。HeLa 細(xì)胞在MEM+10% FBS 的條件下培養(yǎng),然后將HeLa 細(xì)胞置于96 孔板中,在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。向培養(yǎng)基中分別添加探針L1 和L3(0、3.13、6.25、12.5、50 和100 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,加入CCK-8 溶液,在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h,在搖床上輕輕混勻10 min。采用酶標(biāo)儀讀取各孔的光密度值(OD 值),按下面公式計(jì)算抑制率(I):I (%)=(1–OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100。

    1.5 細(xì)胞成像

    在37 ℃、5% CO2 的條件下, HeLa 細(xì)胞在含有10% FBS 和探針L1 和L3 的96 孔板中培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)基中添加5 μmol/L 探針L1 和L3,孵育30 min。用PBS 溶液洗滌3 次后,再分別與10、15 和20 μmol/L Al3+孵育30 min。對(duì)照組HeLa 細(xì)胞分別與5 μmol/L 探針L1 和L3 孵育30 min,與20 μmol/LAl3+孵育30 min,再與EDTA(60 μmol/L)孵育30 min。細(xì)胞成像前, HeLa 細(xì)胞用PBS 清洗3 次,去除細(xì)胞外的Al3+,采用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 目標(biāo)化合物的合成

    在探針的構(gòu)建中,選擇合適的熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)是設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。本研究選擇水楊醛、間茴香醛、鄰香草醛和香草醛為原料,與水楊酰肼發(fā)生加成消除反應(yīng),得到水楊酰腙型熒光化合物L(fēng)1~L4,采用HRMS、1H NMR 和13C NMR 確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)?;衔锝Y(jié)構(gòu)中的甲亞胺基、酰基和羥基為金屬離子提供了富氮、富氧的配位環(huán)境。香草醛及其衍生物具有優(yōu)異的熒光性能,可作為探針的熒光基團(tuán)。水楊酰腙型熒光探針可用作特異性熒光探針對(duì)Al3+進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。此外,該合成路線具有化合物產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、提純方便和原料廉價(jià)易得等特點(diǎn)。

    2.2 化合物L(fēng)1~L4 的光物理性質(zhì)研究

    化合物L(fēng)1~L4 在DMF-H2O(1∶1, V/V)體系中的熒光發(fā)射光譜見電子版文后支持信息圖S13?;衔風(fēng)3 和L1 分別在500 和450 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰,化合物L(fēng)2 和L4 未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰。為進(jìn)一步了解化合物L(fēng)1~L4 熒光性能差異的原因,利用密度泛函理論計(jì)算(DFT)對(duì)化合物L(fēng)1~L4 的幾何結(jié)構(gòu)以及對(duì)應(yīng)的最低未占分子軌道(LUMO)和最高已占分子軌道(HOMO)進(jìn)行分析。如圖1 所示,化合物L(fēng)1~L4 的LUMO 軌道主要分布于整個(gè)化合物結(jié)構(gòu)中,而HOMO 軌道電子云主要分布于N-芐亞甲基乙酰肼結(jié)構(gòu)中。HOMO 軌道能量值越高,表明電子束縛力越小,容易給出電子。因此,化合物L(fēng)1(HOMO:?5.80 eV)與L3 (HOMO:?5.75 eV)相比,化合物L(fēng)3 結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基間位–OCH3 的引入有利于苯環(huán)上供電子能力的提高?;衔風(fēng)2 (HOMO:?5.93 eV)與L3 (HOMO:–5.75 eV)相比, L3 結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基鄰位–OH 的引入,使得苯環(huán)上的供電子能力明顯提高。對(duì)比L1(HOMO:–5.80 eV)與L2 (HOMO:–5.75 eV)發(fā)現(xiàn),與N-芐亞甲基間位–OCH3 的引入相比,鄰位–OH 的引入更有利于苯環(huán)供電子能力的提高。對(duì)比化合物L(fēng)3(HOMO:–5.75 eV)與L4(HOMO:–5.87 eV)發(fā)現(xiàn),與N-芐亞甲基對(duì)位–OH 的引入相比,鄰位–OH 的引入更有利于苯環(huán)供電子能力的提高。以上結(jié)果表明,水楊酰腙結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基鄰位–OH 和間位–OCH3 的引入最大程度上增加了苯環(huán)的供電子能力。

    考察了加入Al3+前后化合物紫外-可見吸收光譜的變化。加入Al3+后,化合物L(fēng)1 在375 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰(電子版文后支持信息圖S14)?;衔風(fēng)3 與Al3+后絡(luò)合后,在385 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰(電子版文后支持信息圖S15)。進(jìn)一步通過熒光光譜分析化合物L(fēng)1~L4 對(duì)Al3+的熒光響應(yīng)性能,如電子版文后支持信息圖S16 所示,加入Al3+后,化合物L(fēng)1 和L3 溶液均出現(xiàn)明顯的熒光變化, L1 在450 nm 處的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng),體系顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色,而化合物L(fēng)3 在500 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰,體系顯示明顯的綠色熒光?;衔風(fēng)2 和L4 對(duì)Al3+僅有較弱的熒光響應(yīng)。因此,化合物L(fēng)1 和L3 可作為熒光探針對(duì)Al3+進(jìn)行檢測(cè)。

    2.3 探針對(duì)Al3+的選擇性和抗干擾性能

    考察了探針L1 和L3 在其它金屬離子存在下對(duì)Al3+的熒光響應(yīng)。如圖2A 所示,在其它干擾金屬離子(Ca2+、Cr3+、Cu2+、Cd2+、Al3+、Ni3+、Co2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Hg+和Ag+)存在的情況下,探針L1在DMF-H2O(1∶1, V/V; pH=7)體系中均未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰,只有加入100 μmol/L Al3+后,體系的熒光強(qiáng)度明顯升高。同時(shí),在含有不同金屬離子的探針L1溶液中分別加入Al3+ (100 μmol/L),體系均出現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng)。

    如圖2B 所示,在其它金屬離子存在的條件下,探針L3 在DMF-H2O(1∶1, V/V;pH=7)體系中均未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰,只有加入100 μmol/L Al3+后,體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。在上述探針L3 溶液中加入不同金屬離子后,再加入100 μmol/L Al3+,體系在500 nm 處的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明,探針L1 和L3 對(duì)Al3+均具有較好的選擇性,其它金屬離子未對(duì)Al3+的檢測(cè)產(chǎn)生影響。

    2.4 體系pH 值及響應(yīng)時(shí)間的影響

    考察了探針L1 和L3 識(shí)別Al3+的響應(yīng)時(shí)間。由圖3A 可知,加入Al3+ 90 s 后,探針L1 的DMF-H2O 溶液(1∶1, V/V;pH=7)出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光響應(yīng)信號(hào),隨著時(shí)間延長,探針L1 體系的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng),1600 s 后體系依然維持較強(qiáng)的熒光發(fā)射。同樣,在探針L3 的DMF-H2O(1∶1, V/V;pH=7)溶液中加入Al3+, 90 s 后體系出現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng),隨著時(shí)間延長,體系熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng), 1600 s 后體系依然維持穩(wěn)定的熒光發(fā)射(圖3B)。因此,探針L1 和L3 可以快速有效實(shí)現(xiàn)Al3+的檢測(cè)。

    進(jìn)一步考察了探針L1 和L3 在pH 2~13 范圍內(nèi)對(duì)Al3+的識(shí)別能力,結(jié)果見電子版文后支持信息圖S17 和S18。在pH 6~11 范圍內(nèi),探針L1 和L3 保持穩(wěn)定的熒光發(fā)射,能夠選擇性識(shí)別Al3+。

    2.5 探針對(duì)Al3+的檢出限

    在探針L1 的DMF-H2O(1∶1, V/V; pH=7)溶液中分別加入不同濃度的Al3+(0~200 μmol/L),如圖4A 所示,隨著加入的Al3+濃度增大,探針L1 在450 nm 處的熒光強(qiáng)度不斷增加。在20~160 μmol/L 范圍內(nèi),Al3+濃度與探針L1 在450 nm 處的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系(圖4B),線性回歸方程為y=7.01x+377.69(R2=0.9927)。根據(jù)公式LOD=3σ/k,計(jì)算得到檢出限為25.1 nmol/L。

    如圖5A 所示,在探針L3 的DMF-H2O(1∶1, V/V;pH=7)溶液中分別加入不同濃度的Al3+,隨著溶液中Al3+濃度(0~160 μmol/L)增加,探針L3 在500 nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸增大,在17.3~120 μmol/L 濃度范圍內(nèi), Al3+濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y=4.93x+402.37(R2=0.9932)(圖5B)。計(jì)算得到檢出限為17.3 nmol/L。因此,合成的探針L1 和L3 在Al3+檢測(cè)中均具有較好的靈敏度[36-42]。

    2.6 探針對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理研究

    通過Job’s 曲線證明了探針L1 和L3 與Al3+以1∶1 的比例絡(luò)合(見電子版文后支持信息圖S19)。通過1H NMR 和MS 進(jìn)一步探究探針L1和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。如圖6A 所示,在探針L1的1H NMR 譜圖中,羥基上的Ha 和Hb 的化學(xué)位移峰分別出現(xiàn)在δ 11.84 和11.61 處,酰胺上的Hc 的化學(xué)位移峰出現(xiàn)在δ 11.15處。加入Al3+后,在δ 11.84 和11.15 處的羥基上的Ha 以及酰胺上的Hc 的峰逐漸消失,在δ 11.61 處的羥基上的Hb 信號(hào)移動(dòng)至δ 11.66 處。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)探針L1 與Al3+的識(shí)別機(jī)理如圖6B 所示。此外,探針L3 以及探針L3-Al3+的1H NMR 結(jié)果表明,與Al3+絡(luò)合后,探針L3 中的羥基上的Ha(δ 11.94)與酰胺上的Hc(δ 10.95)的信號(hào)峰消失,羥基上的Hb 的信號(hào)峰由δ 11.94 轉(zhuǎn)移至δ 11.51(電子版文后支持信息圖S20A)。Al3+與探針L3 的配位機(jī)理與探針L1 相似(電子版文后支持信息圖S20B),結(jié)構(gòu)中羥基上的O 以及酰胺基上的N 與Al3+配位。通過LCMS 進(jìn)一步驗(yàn)證以上推測(cè)結(jié)果,如電子版文后支持信息圖S21A 所示,在m/z 351.30 處出現(xiàn)的離子峰可歸屬于L1-Al3+([M?1]+,計(jì)算值為m/z 351.99);如電子版文后支持信息圖S21B 所示,在m/z 381.20 處出現(xiàn)的離子峰可歸屬于L3-Al3+([M?1]+,計(jì)算值為m/z 381.00)。

    通過DFT計(jì)算進(jìn)一步驗(yàn)證探針L1 和L3 與Al3+的配位機(jī)理。圖6C 展現(xiàn)了探針L1 和探針L1-Al3+優(yōu)化后的幾何結(jié)構(gòu),以及對(duì)應(yīng)的LUMO和HOMO 軌道。探針L1 的LUMO 軌道電子云分布于整個(gè)分子結(jié)構(gòu)中,而HOMO 軌道的電子云分布于N-芐亞甲基乙酰肼結(jié)構(gòu)中。此外,探針L1-Al3+的LUMO 軌道電子集中在Al3+周圍, HOMO 軌道的電子分布集中在N-芐亞甲基上。探針L1-Al3+的HOMO-LUMO 能帶能隙(1.56 eV)明顯小于探針L1(4.18 eV)。同時(shí),探針L3 的HOMO-LUMO 能帶能隙值為4.11 eV,探針L3-Al3+的能帶能隙值減至1.22 eV,此結(jié)果表明,探針L1和探針L3與Al3+形成穩(wěn)定的配合物。此外,探針L3-Al3+的HOMOLUMO能帶能隙值(1.22 eV)小于探針L1-Al3+(1.56 eV),與探針L1-Al3+相比,探針L3-Al3+的最大熒光發(fā)射峰明顯紅移,分別移至500 nm(L3-Al3+)和450 nm(L1-Al3+),詳見電子版文后支持信息圖S20C。

    2.7 細(xì)胞內(nèi)Al3+的熒光成像

    采用CCK-8 法評(píng)價(jià)探針對(duì)HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示,當(dāng)使用3.125、6.25、12.5、25、50 和100 μmol/L 的探針L1 和L3 處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞存活率均大于80%(電子版文后支持信息圖S22A 和S22B);當(dāng)探針L1 和L3 的濃度為200 μmol/L 時(shí),細(xì)胞存活率大于50%。上述結(jié)果表明,探針L1 和L3的細(xì)胞毒性較低,可應(yīng)用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。

    為進(jìn)一步評(píng)價(jià)探針L1 和L3 示蹤活細(xì)胞中Al3+的能力,采用探針L1 和L3 進(jìn)行了細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。如圖7A 所示,將HeLa 細(xì)胞與探針L1 孵育30 min 后,未出現(xiàn)明顯的熒光現(xiàn)象。將探針L1 預(yù)處理的HeLa細(xì)胞與不同濃度Al3+(0、5、10、15 和20 μmol/L)孵育30 min 后, HeLa 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色熒光。同時(shí),隨著Al3+濃度增大,細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)。此外,探針L3 預(yù)處理的HeLa 細(xì)胞與不同濃度的Al3+(0、5、10、15 和20 μmol/L)孵育30 min 后, HeLa 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光,熒光強(qiáng)度隨Al3+濃度升高而逐漸增強(qiáng)(圖7B)。對(duì)照組中, HeLa 細(xì)胞與探針L1 和L3 孵育30 min 后,依次加入20 μmol/LAl3+和60 μmol/L EDTA 后,體系中未出現(xiàn)明顯熒光,表明Al3+與EDTA 形成絡(luò)合物后,體系未出現(xiàn)明顯熒光。因此,探針L1 和L3 均具有較好的細(xì)胞滲透性,可用于細(xì)胞內(nèi)Al3+的檢測(cè)。

    3 結(jié)論

    設(shè)計(jì)合成了新型水楊酰腙型化合物L(fēng)1~L4,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。對(duì)比化合物L(fēng)1~L4 與Al3+的熒光響應(yīng)結(jié)果,表明化合物L(fēng)1 和L3 可作為Al3+熒光探針。在DMF-H2O(1∶1, V/V;pH=7)體系中,探針L1和L3 可實(shí)現(xiàn)Al3+的特異性識(shí)別,以及快速且高靈敏的檢測(cè),檢出限分別為25.1 和17.3 nmol/L。采用1H NMR、MS 以及理論計(jì)算進(jìn)一步分析了探針L1 和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。探針L1 和L3 的細(xì)胞毒性低,可用于活細(xì)胞中Al3+的熒光成像。本研究為特異性Al3+熒光探針的合成提供了新思路。

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    支持信息

    水楊酰腙型高選擇性鋁離子熒光探針的合成及其應(yīng)用研究

    譚浩雪 王忠龍 楊曉琴 饒小平 趙平 姜倩

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 32160350)和云南省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(Nos. 202201AU070069, 202301BD070001-117)資助。

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