諾麗果內(nèi)生菌的分離及其代謝物的抗氧化活性

摘要：從新鮮諾麗果（Morinda citrifolia）中分離出9株內(nèi)生菌，分別用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)離心后獲得的上清液為胞外代謝物，離心后的菌體經(jīng)超聲波破碎細胞獲得胞內(nèi)代謝物（內(nèi)溶物），測試胞外代謝物和內(nèi)溶物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫的清除效果和總還原力。結(jié)果表明，9株諾麗果內(nèi)生菌菌株的胞外代謝物及菌體內(nèi)溶物的抗氧化活性各有差異，其中，3#內(nèi)生菌胞外代謝物對DPPH自由基的清除率達95.49%，4#內(nèi)生菌菌體內(nèi)溶物對DPPH自由基的清除率達92.47%，均超過同等體積90 μmol/L的抗壞血酸；2#內(nèi)生菌胞外代謝物對羥自由基的清除效果遠超抗壞血酸，達98.13%，3#內(nèi)生菌菌體內(nèi)溶物對羥自由基的清除率為78.00%，是抗壞血酸的2倍；3#內(nèi)生菌胞外代謝產(chǎn)物對超氧陰離子的清除率達100%；4#內(nèi)生菌菌體內(nèi)溶物的總還原力最高。

關(guān)鍵詞：諾麗果（Morinda citrifolia）； 內(nèi)生菌； 代謝物； 抗氧化活性

中圖分類號：Q936" " " " "文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0059-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.011 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation of endophytic bacteria from Morinda citrifolia and antioxidant activity of its metabolites

ZHANG San-yan， CHEN Xue-ru， JIN Wei-hua

（College of Nursing and Health Management， Wuhan Donghu University， Wuhan" 430212， China）

Abstract： Nine endophytic bacteria were isolated from fresh Morinda citrifolia， which were cultured in the liquid medium respectively. The supernatant obtained after centrifuging the culture broth was the extracellular metabolite， and the intracellular metabolite （intracellular content） was obtained by ultrasonic cell disruption of the centrifuged bacteria. The scavenging effects on DPPH free radicals， hydroxyl free radicals， superoxide anions， hydrogen peroxide and the total reducing power of the extracellular metabolites and intracellular contents were tested. The results showed that the antioxidant activities of the extracellular metabolites and intracellular contents of the nine endophytic bacteria strains from Morinda citrifolia were different. Among them， the scavenging rate of the extracellular metabolites of 3# endophyte on DPPH free radicals reached 95.49%， and that of the intracellular content of 4# endophyte on DPPH free radicals reached 92.47%， both exceeding that of 90 μmol/L ascorbic acid of the same volume. The scavenging effect of the extracellular metabolites of 2# endophyte on hydroxyl free radicals was far beyond that of ascorbic acid， reaching 98.13%. The scavenging rate of hydroxyl free radicals of the intracellular content of 3# endophyte was 78.00%， which was twice that of ascorbic acid. The scavenging rate of the extracellular metabolite of 3# endophyte on superoxide anions reached 100%. The total reducing power of the intracellular content of 4# endophyte was the highest.

Key words： Morinda citrifolia； endogenous bacteria； metabolite； antioxidant activity

諾麗果（Morinda citrifolia）具有豐富的人體必需氨基酸、非必需氨基酸、維生素、塞洛寧、虹苷類及礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素和強大的抗氧化活性［1］，使其成為增強免疫能力的良好保健食品［2］，諾麗果中主要的微量營養(yǎng)物質(zhì)是有機酸、多酚和生物堿［3］，研究發(fā)現(xiàn)，諾麗果中的多種活性成分具有體外抗腫瘤［4-6］、抑菌作用［7］。諾麗酵素是諾麗果的一種常見食用方法，其制備通常采用自體發(fā)酵（傳統(tǒng)發(fā)酵）和接種發(fā)酵兩種方法，自體發(fā)酵利用諾麗果自身所帶微生物發(fā)酵，需要較長時間發(fā)酵成熟，接種酵母菌或乳酸菌，由于菌種量大、發(fā)酵速度快，兩種方法都能獲得強抗氧化作用的酵素［8］。田亮等［9］的研究發(fā)現(xiàn)采用自發(fā)酵的方式，不同品種的諾麗果制備的酵素抗氧化活性有較大差異，可能是由于不同品種諾麗果自身化學(xué)成分不同，或者不同品種諾麗果自帶菌群（內(nèi)生菌）的差異所致。此外，孫碧琪等［10］對4種諾麗果來源的內(nèi)生菌進行了抗氧化和抑菌作用測試，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力與抑菌作用大小呈正相關(guān)，這無疑為諾麗果內(nèi)生菌在食品行業(yè)的廣泛應(yīng)用開辟了廣闊的前景。植物內(nèi)生菌長期與健康植物伴生，隨著這種伴生關(guān)系的發(fā)展，這些內(nèi)生菌產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物性質(zhì)會與植物代謝物類似，諾麗果內(nèi)生菌和諾麗果提取物對某些微生物的相同拮抗作用也證明了這一點，由于微生物在生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方面比植物更具優(yōu)勢，使得植物內(nèi)生菌成為天然的資源庫而被廣泛研究和利用［11］，在用傳統(tǒng)方法制作諾麗酵素過程中，諾麗果內(nèi)生菌有可能起著重要作用。目前關(guān)于諾麗果內(nèi)生菌及其代謝物抗氧化的研究均局限在以諾麗果本身為發(fā)酵原料方面，鮮見關(guān)于諾麗果內(nèi)生菌在離開諾麗果后，其代謝產(chǎn)物是否具有抗氧化活性的研究報道，這無疑限制了諾麗果內(nèi)生菌的開發(fā)利用。因此，有必要對諾麗果中的內(nèi)生菌進行分離純化，進而研究這些內(nèi)生菌在生長代謝后，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物是否具有良好的應(yīng)用價值，以方便為諾麗果內(nèi)生菌在實際應(yīng)用中的篩選和大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)、利用進行理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

諾麗果采自海南省陵水縣；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基，貨號D9132），Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物，英國Oxoid；氯化鈉、葡萄糖、乙醇、乳酸、石炭酸、FeSO4·7H2O、水楊酸、Tris-HCl、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸（VC），以上化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

YS100型普通光學(xué)顯微鏡，尼康（NiKon）；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；RE1501014型紫外分光光度計、D-37520型離心機，武漢匯能智科技有限公司；AUY120型分析天平，日本島津公司；MJ-300BS-Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HQY-C-J型恒溫搖床，金壇市鴻科儀器廠；HH-60型恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 諾麗果內(nèi)生菌的分離純化和染色觀察 參考文獻［12］進行內(nèi)生菌分離，新鮮諾麗果用無菌水清洗后依次用70%乙醇溶液浸泡3 min， 2.6%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，70%乙醇溶液清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸取表面多余水分。將最后一次清洗的水少量涂布于固體LB和PDA培養(yǎng)基平板上作對照，要求對照平板無菌落生長，確保表面滅菌徹底。然后在超凈工作臺中剝皮處理，將果肉切塊放入已滅菌的含少量無菌水的錐形瓶中，將錐形瓶置于28 ℃的恒溫搖床，150 r/min振蕩增菌培養(yǎng)，至可見微生物生長后，采用稀釋涂平板法分離內(nèi)生菌，其中LB培養(yǎng)基主要用于細菌分離，PDA培養(yǎng)基用于真菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.2.2 內(nèi)生菌胞外代謝物及胞內(nèi)代謝物的制備 取對數(shù)生長期的菌液5 mL（A600 nm=0.45），接種于250 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫搖床，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，然后12 000 r/mim離心5 min，得內(nèi)生菌胞外代謝產(chǎn)物溶液（上清液），進行抗氧化活性測試。

在無菌操作下取30 mL菌液，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用20 mL無菌水洗滌2次，最后用20 mL無菌水懸浮沉淀，使用細胞破碎儀在冰水浴中破碎細胞，超聲功率400 W，超聲時間3 s間歇3 s，至顯微鏡下無完整細胞為止，破碎后10 000 r/min離心10 min，取上清液，得胞內(nèi)代謝物溶液（內(nèi)溶物），進行抗氧化活性測試。

1.2.3 DPPH法測抗氧化活性 參照馮沼潤等［13］和Khan等［14］的方法。取3支潔凈且干燥的試管I、J、O，I試管中加入2.0 mL待測液和2.0 mL的DPPH溶液；J試管中加入2.0 mL待測液和2.0 mL無水乙醇；O試管中加入2.0 mL的DPPH 溶液和2.0 mL無水乙醇。反應(yīng)1.0 min后，用石英比色皿測混合溶液在517 nm處的吸光度（A517 nm），以無水乙醇作對照，另以90 μmol/L的抗壞血酸溶液作為陽性對照。以上設(shè)置3次平行試驗，取平均值。

DPPH 法清除率計算公式：

DPPH 清除率=[（1-Ai-AjAo）×100%]" " （1）

式中，Ai、Aj、Ao分別為I、J、O 3個試管中的混合溶液在517 nm處的吸光度，每組進行3次平行試驗，取平均值。Aj的目的是消除樣品本身的顏色對測定結(jié)果的干擾，清除率越大，抗氧化活性就越高。

1.2.4 羥自由基清除能力測試 采用水楊酸法［15］并適當(dāng)修改，分別吸取1.0 mL待測液、1.0 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）與1.0 mL H2O2溶液（10 mmol/L）于干燥、潔凈的試管中混合均勻，在37 ℃的恒溫水浴鍋中靜置10 min，加入1.0 mL水楊酸（9 mmol/L）溶液，混勻后37 ℃靜置30 min，吸取1.0 mL溶液，加4.0 mL無菌水稀釋，測定反應(yīng)溶液的A510 nm（Ai），以無菌水代替待測液作空白對照，測A510 nm（Ao）。為消除樣品本身的顏色對測定結(jié)果的干擾，同時設(shè)置陰性對照組，將上述方法中的1 mL過氧化氫溶液換成無菌水，測其A510 nm（Aj），以上試驗重復(fù)3次，取平均值。

羥自由基清除率計算公式：

羥自由基清除率=[（1-Ai-AjAo）×100%]" " （2）

1.2.5 清除H2O2的能力測試 參考文獻［16，17］，并略進行修改，分別取2.0 mL待測液及1%過氧化氫溶液0.25 mL（用pH 7.4磷酸緩沖液配制），混勻后室溫（20 ℃）反應(yīng)20 min后，吸取0.5 mL反應(yīng)液，將反應(yīng)液分別稀釋4倍（胞外代謝物）和8倍（內(nèi)溶物）后，測A240 nm（Ai）。用2 mL無菌水代替待測液，重復(fù)上述步驟，測A240 nm（Ao），作為空白對照。為消除樣品本身的顏色對測定結(jié)果的干擾，將上述方法中的0.25 mL 1%的過氧化氫溶液換成無菌水測A240 nm（Aj）。以上進行3次平行試驗，取平均值。

清除過氧化氫能力計算公式：

過氧化氫清除率=[（1-Ai-AjAo）×100%]" " （3）

1.2.6 超氧陰離子清除能力測試 采用鄰苯三酚自氧化速率法，參考文獻［18］并適當(dāng)修改，分別吸取2.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH=8.2）和1 mL無菌水，在25 ℃恒溫水浴鍋中靜置20 min后，迅速加入0.5 mL在25 ℃條件下預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后記錄5 min內(nèi)溶液在320 nm處的吸光度，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制時間（t）-吸光度（A）曲線，并在線性范圍內(nèi)計算反應(yīng)物在單位時間內(nèi)吸光度的變化，從而得出鄰苯三酚的自氧化速率；用1 mL待測液代替上述1 mL無菌水，重復(fù)上述試驗步驟，得出在待測液作用下鄰苯三酚的自氧化速率；以90 μmol/L 的抗壞血酸溶液作為陽性對照，以上設(shè)置3次平行試驗，取平均值。

超氧陰離子自由基清除率計算公式：

超氧陰離子清除率=[（1-V1V0）×100%] （4）

式中，V0是鄰苯三酚的自氧化速率；V1為待測液（或抗壞血酸溶液）作用下鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.7 總還原能力測試 參考文獻［19］的方法，并略作修改，取2.5 mL的待測液，與2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL的鐵氰化鉀溶液（1%，W/V（質(zhì)量/體積）混勻，50 ℃條件下恒溫水浴20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%，W/V），混勻后取2.5 mL加入到2.5 mL無菌水中，加入0.5 mL三氯化鐵溶液（0.1%，W/V），混勻，測定混合物的A700 nm。以2.5 mL無菌水代替待測液作為空白對照，以2.5 mL的90 μmol/L抗壞血酸溶液作為陽性對照，重復(fù)上述步驟。A700 nm越大，說明還原力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗果內(nèi)生菌的菌落形態(tài)和顯微特征

如圖1、圖2所示，從諾麗果中分離到9個菌株，從菌落形體和染色結(jié)果初步判斷，除了5#菌株為細菌外，其他8個菌株均為放線菌。后續(xù)根據(jù)試驗結(jié)果篩選有價值的菌種進行DNA測序，以確定菌種的種屬。

2.2 諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物和內(nèi)溶物對DPPH自由基的清除效果

從圖3可以看出，3#菌胞外代謝物對DPPH自由基的清除效果最好，清除率達95.49%，超過同體積90 μmol/L的VC（88.45%），6#菌胞外代謝物對DPPH自由基的清除效果最差，清除率僅為1.14%。1#、2#、4#、5#、7#、9#菌胞外代謝物均有較高清除DPPH自由基的效果，但較VC的清除效果略低。

如圖4所示，4#諾麗果內(nèi)生菌內(nèi)溶物對DPPH自由基的清除效果最好，清除率達92.47%；2#諾麗果內(nèi)生菌內(nèi)溶物的清除效果最差，清除率僅為8.97%。

2.3 諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物和內(nèi)溶物對羥自由基的清除效果

從圖5、圖6可以看出，與同體積90 μmol/L的抗壞血酸相比，大部分諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物對羥自由基都具有良好的清除效果，尤其是2#菌株，清除率達98.13%；3#菌內(nèi)溶物對羥自由基的清除效果較好，清除率達78%，其他菌株在這方面略顯不足。

2.4 諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物和內(nèi)溶物對超氧陰離子的清除效果

如圖7所示，3#和6#內(nèi)生菌胞外代謝物均具有比同體積90 μmol/L的抗壞血酸更強的清除超氧陰離子的能力，其中3#菌株的清除率最強，達100%。

由圖8可以看出，5#內(nèi)生菌內(nèi)溶物對超氧陰離子清除效果最好，清除率為58.70%。其他菌株內(nèi)生菌內(nèi)溶物對超氧陰離子的清除率均未超過50%，但均高于同體積90 μmol/L的抗壞血酸。

2.5 諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物和內(nèi)溶物對過氧化氫的清除效果

如圖9所示，與同體積90 μmol/L的抗壞血酸相比，2株諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物對H2O2具有良好的清除效果，6#菌株清除能力最強，清除率達89.13%；其次是3#菌株，清除率達70.81%。

如圖10所示，8#內(nèi)生菌內(nèi)溶物對H2O2的清除效果最好，清除率達89.57%；4#、5#、6#、9#內(nèi)生菌內(nèi)溶物對H2O2的清除效果很差，清除率均未達10%。

2.6 諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物和內(nèi)溶物的總還原力

如圖11所示，7#諾麗果內(nèi)生菌胞外代謝物的A700 nm最大，達0.55，總還原力最強，是同體積90 μmol/L抗壞血酸的1.96倍；6#和1#菌株總還原力次之，A700 nm分別為0.52、0.52。

如圖12所示，4#諾麗果內(nèi)生菌內(nèi)溶物的A700 nm最大，達0.59，總還原力最高，是同體積90 μmol/L抗壞血酸的2.11倍；3#菌株總還原力次之，A700 nm為0.46；5#菌株總還原力最小，A700 nm僅為0.19，其他菌株與同體積90 μmol/L抗壞血酸的總還原力相當(dāng)。

3 小結(jié)

從諾麗果中分離內(nèi)生菌的菌落和菌苔形態(tài)大部分與孫碧琪等［10］報道的類似；諾麗果內(nèi)生菌在與諾麗果長期的共生進化過程中，能代謝出具有強還原活性的物質(zhì)；雖然不同的諾麗果內(nèi)生菌株表現(xiàn)出不同強度的還原力，其總還原力不等于胞外代謝物和內(nèi)溶物的還原力簡單相加，不同抗氧化活性物質(zhì)的還原作用方式不同，與趙宏亮等［17］的報道一致。諾麗果內(nèi)生菌胞內(nèi)外代謝物具有與諾麗果本身化學(xué)成分類似的強還原性，與植物相比，微生物培養(yǎng)更簡單快速，獲得微生物的抗氧化活性物質(zhì)更容易，所以，開發(fā)諾麗果內(nèi)生菌資源具有更廣闊的前景，可能成為未來基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐中的熱點。但在菌種選育方面，必須根據(jù)實際情況選擇相應(yīng)的菌種，如以消除超氧陰離子為目的的情況下，用2#菌株發(fā)酵獲得發(fā)酵液產(chǎn)品就是最佳選擇。此外，微生物的生長代謝與生長環(huán)境息息相關(guān)，代謝產(chǎn)物和菌體內(nèi)容物與培養(yǎng)（發(fā)酵）條件有關(guān)，郝玉潔等［20］的研究報道了諾麗果在37 ℃自然發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)和活性物質(zhì)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延遲，發(fā)酵果汁的理化性質(zhì)和活性物質(zhì)組成均有較大程度的變化，說明諾麗果自帶的內(nèi)生菌在發(fā)酵過程中隨著環(huán)境的變化，代謝也隨之變化，因此，單用某培養(yǎng)條件，尚不能確定其最好的抗氧化效果，優(yōu)化發(fā)酵工藝這方面還需進一步研究，表明菌種的分離純化及單個菌種的發(fā)酵研究更有利于諾麗果內(nèi)生菌的開發(fā)利用。

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