敲低PDK4改善線粒體?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)延緩D?半乳糖誘導的心肌細胞衰老

摘要 "目的：探究敲低丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）對D-半乳糖（D-gal）誘導的心肌細胞衰老的影響及對線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)（MAMs）的調(diào)節(jié)作用。方法：通過將si-PDK4重組質(zhì)粒及陰性對照si-NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心肌細胞H9c2中以敲低PDK4表達，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）測定轉(zhuǎn)染效果。將H9c2細胞分為對照組、D-gal組、si-NC＋D-gal組、si-PDK4＋D-gal組。對照組正常培養(yǎng)，D-gal組給予10 g/L D-gal誘導48 h，si-NC＋D-gal組與si-PDK4＋D-gal組分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-PDK4后再給予10 g/L D-gal誘導48 h，結(jié)束后收集各組H9c2細胞，細胞活性檢測（CCK-8）法檢測各組細胞活性，β-半乳糖苷酶活性（SAβ-gal）染色判定各組細胞衰老狀態(tài)，2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針法檢測各組細胞活性氧（ROS）水平，細胞熒光染色檢測各組細胞MAMs，Western Blot測定各組細胞中線粒體融合蛋白-2（MFN2）蛋白表達水平，F(xiàn)luo-3 AM熒光探針法檢測各組細胞鈣離子（Ca2＋）水平。結(jié)果：轉(zhuǎn)染si-PDK4的H9c2細胞中PDK4 mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均低于轉(zhuǎn)染si-NC的H9c2細胞與正常H9c2細胞（P＜0.05），提示成功敲低PDK4表達。與對照組比較，D-gal組H9c2細胞存活率下降，SAβ-gal標記的衰老細胞比例增加，ROS水平升高，MAMs共定位減少，MFN2蛋白相對表達量下調(diào)，細胞內(nèi)Ca2＋水平增加（P＜0.05）。與D-gal組和si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞存活率升高，SAβ-gal標記的衰老細胞比例減少，ROS水平下降，MAMs共定位增加，MFN2蛋白相對表達量上調(diào)，細胞內(nèi)Ca2＋水平減少（P＜0.05）。結(jié)論：敲低PDK4能夠延緩D-gal誘導的心肌細胞衰老，其作用機制可能與增加MAMs形成以促進細胞內(nèi)Ca2＋運轉(zhuǎn)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 "心肌細胞；衰老；丙酮酸脫氫酶激酶4；線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)；D-半乳糖

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.01.009

The Effect of PDK4 Knockdown Delayed on D-gal Induced Cardiomyocyte Senescence by Improving Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum Membranes

ZHENG Yang， HUANG Yubing， HUANG Wenxia， LI Haitao

Hainan General Hospital， Haikou 570311， Hainan， China

Corresponding Author " "LI Haitao，E-mail： 478854958@qq.com

Abstract Objective：To explore the effect of knockdown pyruvate dehydrogenase kinase 4（PDK4） on D-galactose（D-gal）-induced cardiomyocyte senescence and its regulatory effect on mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes（MAMs）.Methods：si-PDK4 recombinant plasmid and negative control si-NC recombinant plasmid were transfected into rat cardiomyocytes H9c2 to knock down the expression of PDK4.Real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot were used to determine the transfection effect.H9c2 cells were divided into control group，D-gal group，si-NC＋D-gal group，and si-PDK4＋D-gal group.The control group was cultured normally，the D-gal group was given 10 g/L D-gal induction for 48 h，and the si-NC＋D-gal group and the si-PDK4＋D-gal group were transfected with si-NC and si-PDK4 respectively，and then given 10 g/L D-gal for 48 h.H9c2 cells were collected from each group after completion.Cell activity assay（CCK-8） was used to detect cell activity in each group.Cell senescence status was determined by β-galactosidase activity（SAβ-gal） staining.The levels of reactive oxygen species（ROS） were detected by 2′，7′-dichlorofluorescein yellow diacetate（DCFH-DA） fluorescence probe.Cell fluorescence staining was used to detect MAMs in each group.The expression level of mitochondrial fusion protein-2（MFN2） protein in each group was determined by Western Blot.Fluo-3 AM fluorescence probe was used to detect calcium ion（Ca2＋） levels in each group.Results：The relative expression of PDK4 mRNA and protein in H9c2 cells transfected with si-PDK4 was significantly lower than that in H9c2 cells transfected with si-NC and normal H9c2 cells（P＜0.05），indicating that PDK4 expression was successfully knocked down.Compared with the control group，the survival rate of H9c2 cells in D-gal group "significantly decreased，the proportion of SAβ-gal labeled senile cells "significantly increased，ROS level significantly increased，and MAMs "co-localization "significantly decreased，the relative expression of MFN2 protein "significantly down-regulated，and the intracellular Ca2＋ level "significantly increased（P＜0.05）.Compared with D-gal group and si-NC＋D-gal group，the survival rate of H9c2 cells in si-PDK4＋D-gal group "significantly increased，the proportion of senile cells labeled with SA β-gal "significantly decreased，and the ROS level "significantly decreased，MAMs colocalization significantly increased，MFN2 protein relative expression "significantly up-regulated，and intracellular Ca2＋ level "significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion：Knockdown of PDK4 can delay D-gal induced cardiomyocyte senescence，and its mechanism may be related to increasing the formation of MAMs to promote intracellular Ca2＋ operation.

Keywords "cardiomyocyte; aging; pyruvate dehydrogenase kinase 4; mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes； D-galactose

細胞衰老與發(fā)育期間和損傷后組織重塑的增加、再生潛力的降低以及促進炎癥發(fā)生進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［1］。衰老生物體的主要特征是衰老細胞的積累，生理完整性的逐漸喪失以及組織功能受損，分子生物學特征包括基因組不穩(wěn)定、端?？s短、表觀遺傳、蛋白質(zhì)平衡和營養(yǎng)變化、線粒體功能障礙、干細胞衰竭和細胞間通信的改變等［2］。衰老被認為是心血管疾病的獨立危險因素，衰老的心臟發(fā)生顯著病理生理變化，這些變化主要包括間質(zhì)纖維化和心肌細胞肥大，導致心室僵硬度增加與舒張壓功能降低，從而損害正常心肌組織及功能［3］。因此，探索心肌衰老的潛在機制以及改善衰老誘導心肌損傷的治療方案對于老年人身體健康至關(guān)重要。

線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶聯(lián)結(jié)構(gòu)（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAMs）是連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的物理結(jié)構(gòu)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞結(jié)構(gòu)域、線粒體外膜和一些相關(guān)蛋白組成，主要功能為介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的信號傳導、調(diào)節(jié)線粒體動力學、參與脂質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運以及作為Ca2＋通道［4-5］。研究表明，在心臟衰老期間MAMs完整性破壞，線粒體Ca2＋攝取減少及對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的緩沖能力降低，導致新陳代謝受損，使心臟對壓力刺激的敏感性增加，進而引起心臟功能受損［6］。由此可見，維持MAMs正常結(jié)構(gòu)和功能對于預防衰老心肌細胞受損至關(guān)重要。

丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復合物活性的關(guān)鍵酶，也是丙酮酸氧化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，敲低PDK4增加心肌缺血再灌注后心肌細胞對葡萄糖的攝取，從而有效促進心功能恢復［8］，此外，敲低PDK4能夠改善糖尿病大鼠的心臟功能，并減少心肌細胞凋亡［9］。基于此，本研究采用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導的心肌細胞建立心肌衰老體外模型，觀察敲低PDK4對心肌細胞衰老的影響，并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鼠心肌細胞H9c2購自上海優(yōu)利科生命科學公司，胎牛血清、青霉素-鏈霉素、杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，Lipofectamine?2000試劑盒購自上海研謹生物科技公司，Trizol試劑盒購自日本Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物公司，RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒及SAβ-gal染色試劑盒均購自上海碧云天生物研究所，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜均購自武漢伊萊瑞特生物科技公司，D-gal與細胞活性檢測（CCK-8）試劑盒購自北京索萊寶生物公司，ROS熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）購自北京康瑞納生物科技公司，線粒體熒光探針Mito-tracker Green與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針ER-tracker Red購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，鈣離子熒光探針Fluo-3 AM購自美國MedChemExpress公司，兔抗PDK4、線粒體融合蛋白-2（MFN2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體等一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司。si-PDK4重組質(zhì)粒與si-NC陰性對照重組質(zhì)粒由上海生工生物工程公司設計構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將凍存的H9c2細胞放入37 ℃水浴鍋中，輕輕晃動使其溶解，移入含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞密度達80%以上時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期H9c2細胞植入6孔板，每孔2×105個，過夜培養(yǎng)后，分別將si-PDK4重組質(zhì)粒、si-NC陰性對照重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9c2細胞，具體根據(jù)Lipofectamine?2000說明書操作，以正常培養(yǎng)的H9c2細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）法測定心肌細胞中PDK4 mRNA表達水平

Trizol法提取轉(zhuǎn)染si-PDK4、si-NC的H9c2細胞及正常H9c2細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。取OD260/OD280值范圍在1.8～2.0的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過qRT-PCR法測定各組細胞內(nèi)PDK4 mRNA表達水平，根據(jù)熒光定量檢測試劑盒操作，無菌離心管中配制反應體系，置于Bio-Rad CFX96儀中，反應程序設置為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸60 s，循環(huán)45次；72 ℃延伸1 min。擴增結(jié)束后，分析溶解曲線，以GAPDH作為內(nèi)參基因，2－ΔΔCt法分析計算PDK4的mRNA相對表達量。引物序列如下：PDK4，正向引物5′-CAGACAGAGGAGGTGGTGTT-3′，反向引物5′-CGAGAAATTGGCAAGCCGTA-3′；GAPDH，正向引物 5′-GAGTCAACGGATTTGGTGGT-3′，反向引物5′-TTGATTGGAGGGATCTCG-3′。

1.2.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）測定心肌細胞PDK4蛋白表達水平

在收集的各處理組心肌細胞中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法進行定量。將蛋白煮沸變性，制備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠，待其凝固后，取等量30 μg蛋白加至泳道內(nèi)，電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。浸入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，再將膜與稀釋后的一抗（1∶1 000）共置于4 ℃下孵育過夜。次日，棄一抗液，Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）洗膜，室溫下與稀釋后的對應二抗（1∶5 000）共孵育1 h。TBST再次洗膜，使用增強化學發(fā)光法（ECL）顯影將蛋白可視化，凝膠成像顯影儀中成像，Image-Pro Plus軟件分析目的條帶灰度值，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值來表示目的蛋白相對表達量。

1.2.4 實驗分組與處理

實驗分為對照組、D-gal組、si-NC＋D-gal組、si-PDK4＋D-gal組。對照組H9c2細胞正常培養(yǎng)；D-gal組H9c2細胞用10 g/L D-gal誘導48 h；si-NC＋D-gal組轉(zhuǎn)染si-NC至H9c2細胞再給予10 g/L D-gal誘導48 h；si-PDK4＋D-gal組轉(zhuǎn)染si-PDK4至H9c2細胞再給予10 g/L D-gal誘導48 h。處理結(jié)束后，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測心肌細胞活性

將各處理組H9c2細胞植入96孔板中，每孔3×103個，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，各孔內(nèi)添加10 μL CCK-8溶液，再置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞存活率（%）＝（實驗孔吸光度－空白孔吸光度）/（對照孔吸光度－空白孔吸光度）×100%。

1.2.6 SAβ-gal染色判定心肌細胞衰老狀態(tài)

吸除各處理組H9c2細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞，加入1 mL SAβ-gal染色固定液，室溫固定細胞15 min。吸除細胞固定液，PBS洗滌后，加入預先配制好的SAβ-gal染色工作液，保鮮膜封住6孔板，置于37 ℃恒溫箱孵育過夜，PBS洗滌干凈，普通光學顯微鏡觀察細胞染色情況并拍照，隨機選擇6個視野計數(shù)SAβ-gal標記的陽性細胞數(shù)目與總細胞數(shù)目，計算SAβ-gal細胞比例（%）＝SAβ-gal陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.2.7 DCFH-DA熒光探針法檢測心肌細胞ROS水平

使用無血清培養(yǎng)液將DCFH-DA熒光探針稀釋為10 μmol/L工作液，去除各處理組H9c2細胞培養(yǎng)液后，加入1 mL稀釋好的DCFH-DA工作液，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞，去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA熒光探針，通過流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)ROS水平。

1.2.8 細胞熒光染色檢測心肌細胞MAMs

使用HBSS將Mito-tracker儲存液稀釋為0.5 μmol/L工作液，再將ER-tracker儲存液稀釋為2.5 μmol/L工作液，在各處理組H9c2細胞中加入Mito-tracker工作液，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱孵育10 min，棄掉Mito-tracker工作液，接著加入含ER-tracker工作液后置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱孵育10 min，HBSS洗滌細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞染色情況并拍照，使用Image J軟件計算Pearson相關(guān)系數(shù)，以反映MAMs共定位情況。

1.2.9 Fluo-3 AM熒光探針法檢測心肌細胞Ca2＋水平

在各處理組H9c2細胞中加入5 μmol/L Fluo-3AM，混合均勻，置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱避光孵育40 min后，PBS洗滌細胞，靜置15 min以完全洗脫細胞表面探針，再以PBS重懸細胞，使用流式細胞分析儀檢測各組細胞內(nèi)Ca2＋水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.30軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染效果

H9c2細胞轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示，si-PDK4組細胞中PDK4 mRNA和蛋白相對表達量低于si-NC組和對照組（P＜0.05）。詳見圖1、圖2。

2.2 敲低PDK4對D-gal誘導的心肌細胞活性的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，D-gal組H9c2細胞存活率下降（P＜0.05）；與D-gal組、si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞存活率升高（P＜0.05）；而D-gal組與si-NC＋D-gal組細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖3。

2.3 "敲低PDK4對D-gal誘導的心肌細胞衰老狀態(tài)的影響

SAβ-gal染色結(jié)果顯示，與對照組比較，D-gal組H9c2細胞SAβ-gal陽性細胞比例增加（P＜0.05）；與D-gal組、si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞SAβ-gal陽性細胞比例減少（P＜0.05）；D-gal組與si-NC＋D-gal組H9c2細胞SAβ-gal陽性細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖4、圖5。

2.4 敲低PDK4對D-gal誘導的心肌細胞ROS水平的影響

經(jīng)DCFH-DA熒光探針法染色后，流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，D-gal組H9c2細胞ROS水平高于對照組（P＜0.05）；與D-gal組、si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞ROS水平降低（P＜0.05）；D-gal組與si-NC＋D-gal組H9c2細胞ROS水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖6、圖7。

2.5 敲低PDK4對D-gal誘導的心肌細胞MAMs的影響

激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察，Mito-tracker標記線粒體顯示綠色熒光，ER-tracker標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯示紅色熒光，重疊部分即為MAMs，分析結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組H9c2細胞MAMs共定位減少（P＜0.05）；與D-gal組、si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞MAMs共定位增加（P＜0.05）；而D-gal組與si-NC＋D-gal組MAMs共定位情況比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖8、圖9。

Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，D-gal組H9c2細胞中MFN2蛋白相對表達量下調(diào)（P＜0.05）；與D-gal組、si-NC＋D-gal組比較，si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞中MFN2蛋白相對表達量上調(diào)（P＜0.05）；此外，D-gal組與si-NC＋D-gal組H9c2細胞中MFN2蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖10、圖11。

2.6 敲低PDK4對D-gal誘導的心肌細胞內(nèi)Ca2＋水平的影響

激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，F(xiàn)luo-3 AM熒光探針標記細胞內(nèi)Ca2＋顯示為綠色熒光，分析結(jié)果顯示，模型組H9c2細胞內(nèi)Ca2＋水平較對照組顯著增加（P＜0.05）；si-PDK4＋D-gal組H9c2細胞內(nèi)Ca2＋水平顯著低于D-gal組、si-NC＋D-gal組H9c2細胞內(nèi)Ca2＋水平（P＜0.05）；D-gal組與si-NC＋D-gal組的H9c2細胞內(nèi)Ca2＋水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖12、圖13。

3 討論

細胞衰老是一種不可逆的細胞周期停滯的穩(wěn)定狀態(tài)，其特征是各種基因表達的顯著改變和衰老相關(guān)的SAβ-gal活性增加［10］。此外，衰老細胞分泌由各種促炎細胞因子和生長因子組成的衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）。雖然心肌細胞屬于終末分化細胞，但在包括心肌梗死在內(nèi)的多種心血管疾病中均觀察到衰老型心肌細胞。衰老型心肌細胞表現(xiàn)線粒體功能障礙、收縮功能障礙和肥厚生長，導致心功能不全和心臟衰竭。另外，衰老型心肌細胞通過分泌的SASP損害非心肌細胞（包括內(nèi)皮細胞和成纖維細胞）的功能，從而加速心臟損傷［11］。因此，抑制或延緩心肌細胞衰老可能是治療老年人心血管疾病的重要策略。

心肌能量供應主要來自脂肪酸，而衰老的心肌細胞中能量代謝發(fā)生了異常變化，表現(xiàn)為脂肪酸氧化酶活性降低，脂肪酸氧化水平降低，葡萄糖氧化及糖酵解水平增加，或者由于胰島素抵抗出現(xiàn)糖代謝障礙，脂肪代謝水平升高，這種脂肪酸和葡萄糖氧化供能障礙導致衰老心肌細胞線粒體的形態(tài)異常、數(shù)量減少以及功能減退等［12］。PDK4作為葡萄糖氧化過程中的關(guān)鍵酶，不僅調(diào)控葡萄糖氧化水平，還能在脂肪酸存在情況下抑制丙酮酸脫氫酶，增加心臟對脂肪酸氧化產(chǎn)生能量的依賴［13］。通過促進線粒體攝取葡萄糖或活性丙酮酸脫氫酶，從而調(diào)節(jié)糖代謝及脂肪酸代謝，改善心肌能量代謝過程，是改善心肌細胞衰老的潛在治療方案。已有研究發(fā)現(xiàn)，在特異性敲除PDK4的小鼠模型中丙酮酸脫氫酶活性增加，心肌細胞DNA損傷和激活DNA損傷反應標志物表達減少以及心肌細胞增殖水平增加，此外，心肌梗死后誘導PDK4表達缺失可改善左心室功能并減少組織重塑［14］。提示PDK4可能是心肌細胞出現(xiàn)代謝異常的關(guān)鍵酶，也是改善心肌細胞衰老的潛在靶點。本研究檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-PDK4的心肌細胞H9c2中PDK4表達受到抑制，說明成功構(gòu)建敲低PDK4表達的H9c2細胞株；相較于D-gal直接誘導的H9c2細胞，敲低PDK4再經(jīng)D-gal誘導的H9c2細胞存活率升高，SAβ-gal標記的衰老細胞比例減少，該結(jié)果說明敲低PDK4能夠延緩D-gal誘導的H9c2細胞衰老，對H9c2細胞起到保護作用。

MAMs作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的膜性關(guān)聯(lián)物，促進了這兩種細胞器之間的信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)換，與細胞氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、Ca2＋穩(wěn)態(tài)、炎癥、自噬及凋亡密切相關(guān)，可以維持正常的機體功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠?qū)Ω鞣N生理或病理生理刺激做出反應，將離子、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)信號轉(zhuǎn)移到線粒體中，從而微調(diào)線粒體生理學功能；另一方面，線粒體也能夠向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞離子、脂質(zhì)或蛋白質(zhì)信號等［15-16］。當MAMs結(jié)構(gòu)破壞時可能會引起一系列病理變化，這在心血管疾病的發(fā)病機制中至關(guān)重要。此外，已在衰老心臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)MAMs數(shù)量及結(jié)構(gòu)改變，而MAMs破壞會減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的Ca2＋轉(zhuǎn)移，加速線粒體功能障礙，引發(fā)ROS累積，從而誘導細胞凋亡［17］。本研究實驗結(jié)果顯示，D-gal誘導的H9c2細胞MAMs共定位減少，ROS水平升高，細胞內(nèi)Ca2＋水平也明顯增加，說明D-gal誘導H9c2細胞致使MAMs結(jié)構(gòu)破壞或形成受阻；而敲低PDK4再經(jīng)D-gal誘導的H9c2細胞MAMs共定位增加，ROS水平降低，細胞內(nèi)Ca2＋水平也明顯下降，由此推測，敲低PDK4能夠抑制D-gal誘導的H9c2細胞MAMs破壞，促進Ca2＋運轉(zhuǎn)并降低ROS水平。

MFN2是一種GTP酶，通過形成同源或異源二聚體將兩個相鄰的線粒體與MFN1連接起來介導線粒體外膜融合。MFN2表達異?；蚬δ軉适@著降低線粒體融合效率并誘導線粒體碎裂［18］。MFN2在MAMs中高度表達，并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能，例如Ca2＋平衡、蛋白質(zhì)合成、線粒體融合和裂變、線粒體自噬和炎癥反應等［19］，因此，MFN2對于維持MAMs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與功能至關(guān)重要。本研究檢測結(jié)果顯示，D-gal誘導的H9c2細胞中MFN2蛋白表達水平明顯下調(diào)，而敲低PDK4再經(jīng)D-gal誘導的H9c2細胞中MFN2蛋白表達水平明顯上調(diào)，該結(jié)果表明，敲低PDK4可能通過上調(diào)MFN2表達改善H9c2細胞中MAMs，通過調(diào)節(jié)衰老狀態(tài)下MAMs可能是抑制心肌細胞衰老的重要途徑。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，敲低PDK4能夠提高D-gal誘導下的H9c2細胞活性，改善MAMs結(jié)構(gòu)與功能，從而促進Ca2＋運轉(zhuǎn)以及降低ROS水平，延緩心肌細胞衰老。本研究為治療心肌衰老及損傷提供新的理論依據(jù)和治療靶點，具有一定的臨床意義。但僅從體外細胞實驗進行了初步研究，后續(xù)需通過動物實驗進一步驗證，并明確詳細作用機制。

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（收稿日期：2023-05-16）

（本文編輯 鄒麗）