麝香通心滴丸對晚期糖基化產(chǎn)物誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

摘要 "目的：探討麝香通心滴丸對晚期糖基化產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）氧化應(yīng)激的影響CMEG。方法：分離和培養(yǎng)小鼠CMECs，用AGEs模擬糖尿病高糖毒性對CMECs的損害，以麝香通心滴丸作為干預(yù)藥物，將細(xì)胞分為對照組、AGEs組、AGEs＋麝香通心滴丸組。采用亞甲基藍(lán)法檢測各組細(xì)胞中硫化氫（H2S）濃度，二氯熒光素（DCF）法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)改變，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中mRNA相對表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）法測定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：麝香通心滴丸干預(yù)增加了CMECs中H2S的生成，并抑制細(xì)胞中ROS水平（P＜0.05）；麝香通心滴丸干預(yù)上調(diào)CMECs中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）表達(dá)，Nrf2下游抗氧化基因血紅素氧合酶-1（HO1）、醌氧化還原酶1（NQO1）的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)（P＜0.05）；麝香通心滴丸增加了細(xì)胞中GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶的含量（P＜0.05）。結(jié)論：麝香通心滴丸可通過增加H2S的生成顯著上調(diào)Nrf2的表達(dá)，從而增加抗氧化酶的生成來抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，改善微循環(huán)。

關(guān)鍵詞 "心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞；麝香通心滴丸；晚期糖基化產(chǎn)物；氧化應(yīng)激

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.01.007

Effect of Shexiang Tongxin Dropping Pill on Oxidative Stress of Cardiac Microvascular Endothelial Cells Induced by Advanced Glycation End Products

ZHAO Jian

Second Affiliated Hospital of Naval Medical University， Shanghai 200003， China， E-mail： drzhaojiansmmu@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of Shexiang Tongxin Dropping Pill on oxidative stress in cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） induced by advanced glycation end products（AGEs）.Methods：CMECs were isolated and cultured from mice，AGEs were used to simulate the damage of high glucose toxicity in CMECs，while Shexiang Tongxin Dropping Pill was used as an intervention drug.Cells were divided into control group，AGEs group，and AGEs＋Shexiang Tongxin Dropping Pill group.The concentration of H2S in each group of cells was detected by Methylene Blue method，the level of intracellular reactive oxygen species（ROS） was determined by DCF method.Western Blot was used to detect the relative expression changes of proteins in cells.Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect mRNA relative expression in cells.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the oxidative stress related indexes such as glutathione reductase（GSH-Px），superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT） in cells.Results：Shexiang Tongxin Dropping Pill increased H2S production in CMECs and inhibited ROS levels in cells（P＜0.05）.Shexiang Tongxin Dropping Pill up-regulated the expression of nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2） in CMECs，and the expression of Nrf2 downstream antioxidant genes HO1 and NQO1 were also up-regulated（P＜0.05）.The contents of GSH-Px，SOD，CAT and other antioxidant enzymes in cells were increased by Shexiang Tongxin Dropping Pill（P＜0.05）.Conclusion：Shexiang Tongxin Dropping Pill can significantly up-regulate the expression of Nrf2 by increasing the production of H2S，thereby increasing the generation of antioxidant enzymes to inhibit cellular oxidative stress and improve microcirculation.

Keywords " "article type：cardiac microvascular endothelial cells; Shexiang Tongxin Dropping Pill; advanced glycation end products; oxidative stress

微循環(huán)障礙是糖尿病的主要心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，而冠狀動脈微循環(huán)障礙（coronary microvascular dysfunction，CMD）則是糖尿病在心臟中的主要微血管問題。糖尿病人群的CMD發(fā)生率高達(dá)64%，無論其是否合并冠狀動脈狹窄都可能有不同程度的CMD［1］。CMD嚴(yán)重影響糖尿病病人預(yù)后，顯著增加其心肌梗死等主要不良心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［2］。目前，增加冠狀動脈微血管血流灌注的西藥主要包括尼可地爾和鈣離子拮抗劑等，但療效均不盡如人意，并不能帶來明顯的臨床獲益［3］。因此，仍缺乏公認(rèn)的經(jīng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)可有效針對糖尿病CMD的藥物。

CMD病理生理上表現(xiàn)為冠狀動脈前小動脈和小動脈的結(jié)構(gòu)和（或）功能異常所致的心肌缺血，主要是內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張異常。前期動物模型研究發(fā)現(xiàn)，麝香通心滴丸這一傳統(tǒng)中藥可以激活小鼠心肌組織硫化氫合成酶的表達(dá)，繼而增加氣體信號分子硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）的含量，從而改善小鼠的冠狀動脈微循環(huán)，加快血流速度［4］。但對于麝香通心滴丸增加H2S生成后是如何發(fā)揮作用改善冠狀動脈微循環(huán)的機(jī)制，目前尚不清楚。既往研究顯示，H2S可激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid factor 2-related factor 2，Nrf2）的表達(dá)增加抗氧化酶的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，對于維持正常血管內(nèi)皮功能具有重要的生理意義［5］。而氧化應(yīng)激正是糖尿病CMD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）具有多種危害，抑制氧化應(yīng)激將能減少ROS從而改善CMD［6-7］。本研究擬采用晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）誘導(dǎo)CMECs建立糖尿病高糖毒性對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，并應(yīng)用麝香通心滴丸進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)，探究麝香通心滴丸對細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

參考文獻(xiàn)［8］實(shí)驗(yàn)方法分離、培養(yǎng)CMECs。簡要步驟為：無菌剪取新生雄性小鼠［1～3 d，購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心，無特定病原體（SPF）級］心臟，去除血凝塊，剪碎至1 mm3大小的組織塊，放入50 mL離心管中，再加入2 g/L的Ⅱ型膠原酶消化，同時(shí)加入胎牛血清（FBS）1滴，37 ℃、80 r/min水浴搖床消化40 min后，吸管輕輕吹打組織塊2 min分散細(xì)胞。用吸管吸取細(xì)胞懸液放入15 mL離心管中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖/Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）終止消化，收獲細(xì)胞，所有的細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾。1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀中加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖/DMEM 8 mL，吹打均勻后接種至2個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4 h后用DMEM沖洗去除未貼壁細(xì)胞。貼壁的細(xì)胞于DMEM完全培養(yǎng)基中，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。免疫熒光染色CD31/血管性血友病因子（vWF）抗原陽性，鑒定為所需的CMECs。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（No.2016LS038）。

1.1.2 主要試劑及儀器

麝香通心滴丸購自內(nèi)蒙古康恩貝藥業(yè)有限公司，AGEs購自美國BioVision生物科技有限公司，ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗Nrf2多克隆抗體購自美國CST生物公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（MA-6000）購自蘇州雅睿公司；蛋白凝膠電泳儀（TY-80）購自南京普陽公司；凝膠成像儀（GenoSens 2000 Touch）購自上海勤翔公司；SYBR PremixEx TaqTM試劑盒購自日本Takara生物公司；Nanodrop 2000c購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 分組

取CMECs細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分為對照組、AGEs組、AGEs＋麝香通心滴丸組，AGEs組給予AGEs 0.3 mg/mL；AGEs＋麝香通心滴丸組給予AGEs 0.3 mg/mL＋麝香通心滴丸100 μg/mL；對照給予等劑量細(xì)胞培養(yǎng)液。處理24 h。

1.2.2 H2S含量檢測

收集各組細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解30 min。首先配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。管中依次加入0.5 mL 1%醋酸鋅、10 mmol/L 硫氫化鈉（NaHS）、0.5 mL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸、0.5 mL 30 mmol/L 氯化鐵（FeCl3）、3.5 mL去離子水，避光反應(yīng)20 min。取200 μL放入酶標(biāo)儀中在670 nm處檢測吸光度值。吸取430 μL勻漿上清液，加入20 μL 10 mmol/L的L-半胱氨酸、20 μL 2 mmol/L的5磷酸吡多醛及30 μL PBS共500 μL于玻璃離心管中，震蕩混合均勻。將玻璃離心管封口，37 ℃水浴孵育30 min。加入250 μL 1%的醋酸鋅。加入250 μL 10%的三氯醋酸。加入133 μL 20 mmol/L對苯二胺鹽酸，133 μL 30 mmol/L FeCl3。避光20 min后取200 μL終反應(yīng)液，于670 nm測量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2S的含量。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

采用二氯熒光素（DCF）法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，吸掉舊培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞1次。加入多聚甲醛固定15 min，PBS洗掉多余溶液。配置探針孵育工作液：避光操作，用培養(yǎng)基稀釋探針（1∶1 000），終濃度10 μmol/L。避光操作，每孔加入250 μL探針工作液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育10～20 min。棄掉探針孵育工作液，PBS溫和洗2～3次，然后各孔加入250 μL 4′，6′-二脒基-2-苯咪基吲哚（DAPI）進(jìn)行復(fù)染細(xì)胞核。PBS溫和洗2次或3次。利用熒光顯微鏡觀察。采用ELISA試劑盒測定細(xì)胞中谷胱甘肽還原酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的含量。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中mRNA相對表達(dá)情況

收集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol提取細(xì)胞中RNA，Nanodrop 2000c測定每個(gè)標(biāo)本RNA濃度，用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)測定的RNA濃度，加入500 ng RNA至10 μL體系，然后加入2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)齊至10 μL反應(yīng)體系。根據(jù)反轉(zhuǎn)說明書設(shè)置反轉(zhuǎn)儀，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR PremixEx TaqTM試劑盒配制10 μL反應(yīng)體系，即將獲得的cDNA用Easy Dillution稀釋10倍。然后每孔加入1 μL稀釋后的底物、1 μL混合引物、4 μL酶預(yù)混物和4 μL RNase Free dH2O，設(shè)置3個(gè)副孔，進(jìn)行qRT-PCR，采用內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。相關(guān)引物序列見表1。

1.2.5 蛋白免疫印記法（Western Blot）檢測細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)改變

收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液（RIPA裂解液），冰上裂解細(xì)胞30 min。裂解液于12 000 r/min離心15 min。收集上清液，于－20 ℃保存?zhèn)溆?，并利用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度。完成定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，并用1×蛋白上樣緩沖液稀釋待測標(biāo)本至2.5 mg/mL。上樣時(shí)，吸取10 μL加至上樣孔。恒壓110 V，電泳至溴酚藍(lán)跑至分離膠最下方。根據(jù)分離膠上目的條帶尺寸，剪下適宜的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。將PVDF膜用甲醇浸泡約5 min，激活。然后按照濾紙、膠、膜、濾紙的順序夾好，膠對著負(fù)極。加入轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜液周圍用冰袋保持低溫，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜90 min。然后用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST液）將膜沖洗兩次，用TBST配備的5%BSA溶液于搖床上室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后用TBST沖洗1次，然后依次進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育。最后，顯色前取適量增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光液A液和B液等體積混合。然后取適量滴于PVDF膜上，于凝膠成像系統(tǒng)顯色并保存。將獲取的圖像用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和繪圖分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 麝香通心滴丸增加CMECs中H2S的生成

AGEs組CMECs中H2S含量相比對照組顯著降低（Plt;0.01），而AGEs＋麝香通心滴丸組H2S含量高于AGEs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2 麝香通心滴丸抑制CMECs中ROS水平

熒光顯微鏡觀察，AGEs組ROS水平相比對照組升高，而AGEs＋麝香通心滴丸組ROS水平低于AGEs組。詳見圖2。

2.3 麝香通心滴丸上調(diào)CMECs中Nrf2和下游抗氧化基因HO1、NQO1表達(dá)

AGEs組CMECs中Nrf2蛋白表達(dá)相比對照組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸組Nrf2蛋白表達(dá)高于AGEs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AGEs組Nrf2的下游抗氧化基因HO1、NQO1 mRNA表達(dá)相比對照組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸組HO1、NQO1 mRNA表達(dá)高于AGEs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3～圖6。

2.4 麝香通心滴丸增加CMECs細(xì)胞中GSH-Px、SOD和CAT氧化酶含量

AGEs組GSH-Px、SOD和CAT含量相比對照

組降低，而AGEs＋麝香通心滴丸GSH-Px、SOD和CAT含量高于AGEs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖7～圖9。

3 討 論

CMD在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為糖尿病病人的冠狀動脈血流儲備較非糖尿病對照顯著降低，微循環(huán)阻力升高［9］。CMD是糖尿病病人心血管死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但嚴(yán)格的血糖控制并不能有效改善冠狀動脈微循環(huán)和延緩糖尿病心肌纖維化進(jìn)展［10］。氣虛血瘀是CMD在內(nèi)的心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，治療上應(yīng)首先益氣，兼以活血化瘀祛痰［11-12］。麝香通心滴丸兼具益氣活血雙重功效，是治療“胸痹”的良方，可促進(jìn)微小血管的血運(yùn)及灌注，活血化瘀輔助改善大動脈血管的狹窄與阻塞［13-14］。動物研究證實(shí)，麝香通心滴丸可通過抗氧化、抗凋亡、促進(jìn)血管新生等多種機(jī)制減輕心肌缺血［15-16］，減少微血栓的形成［17］，增加心肌血流灌注，改善缺血再灌注后冠脈微循環(huán)障礙和心功能不全［18］；研究發(fā)現(xiàn)，舌下含服麝香通心滴丸可即時(shí)加快冠狀動脈慢血流病人的冠狀動脈血流速度，而冠狀動脈慢血流與CMD高度相關(guān)［19］。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病CMD的主要機(jī)制。正常情況下，ROS處于低水平，病理?xiàng)l件下，ROS代謝產(chǎn)物增加，可直接引起血管內(nèi)皮功能障礙。ROS是多種信號通路的中心分子，參與了血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等誘導(dǎo)微血管重構(gòu)的病理過程［20］。糖尿病條件下，ROS生成增多，影響心肌微血管系統(tǒng)和心肌代謝，是造成糖尿病病人心肌缺血的重要因素［6］。本研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病組ROS生成顯著增加，抗氧化酶表達(dá)下降，證實(shí)了高糖情況下氧化應(yīng)激損害，影響內(nèi)皮細(xì)胞活力。因此，抑制氧化應(yīng)激減少ROS的生成是CMD重要的干預(yù)靶點(diǎn)。H2S是繼一氧化氮之后另一重要的氣體信號分子，可通過多種通路發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、抗炎和促進(jìn)血管新生等心臟保護(hù)作用。本研究中，糖尿病組H2S生成減少，Nrf2表達(dá)受到抑制，而應(yīng)用麝香通心滴丸干預(yù)后，內(nèi)皮細(xì)胞的H2S生成得到很大程度的提高，繼而激活Nrf2，增加抗氧化酶基因的表達(dá)和下游抗氧化酶的生成，繼而抑制ROS的生成，減少氧化應(yīng)激。既往研究也顯示，H2S能誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)并使其進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化元件結(jié)合，啟動下游編碼CAT、SOD、GSH-Px等多種抗氧化酶基因的表達(dá)，從而清除ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、保護(hù)心血管的作用［21-22］。

從中醫(yī)的角度分析，糖尿病中氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS等氧化物質(zhì)增多，可類比于“痹癥”中心脈的血瘀痰濁，H2S生成缺乏則可類比于“氣虛”。本研究發(fā)現(xiàn)麝香通心滴丸可顯著增加H2S的合成，減少ROS，減輕心肌微血管內(nèi)皮的損傷。該結(jié)果證實(shí)了麝香通心滴丸在中醫(yī)理論中“益氣通脈”的功效與增加氣體信號分子H2S產(chǎn)生的關(guān)系，中西醫(yī)理論和實(shí)踐相互呼應(yīng)，異曲同工印證了本研究設(shè)想的合理性。

綜上所述，麝香通心滴丸可有效降低糖尿病狀態(tài)下的晚期糖基化產(chǎn)物誘導(dǎo)的CMECs的氧化應(yīng)激，是一種潛在的可有效改善糖尿病心臟微循環(huán)的藥物，可為糖尿病冠狀動脈微循環(huán)障礙的防治提供重要的理論基礎(chǔ)。深入研究不但有助于揭示益氣通脈方藥防治冠狀動脈微循環(huán)障礙的新機(jī)制，還為進(jìn)一步深入挖掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療冠狀動脈微循環(huán)障礙奠定相關(guān)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2023-05-18）

（本文編輯 鄒麗）