米曲霉滬釀3.042菌株產(chǎn)脫氨酶發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：該研究初步探索了米曲霉在搖瓶條件下發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸（AMP）脫氨酶的發(fā)酵工藝，并對米曲霉產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過單因素（碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和表面活性劑）實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得到米曲霉在搖瓶條件下產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的最佳條件為250 mL的錐形瓶裝40 mL培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)62 h。最優(yōu)培養(yǎng)基成分含量為麩皮0.4%、蔗糖2.5%、魚粉2%、（NH₄）₂SO₄"0.075%、吐溫-80 0.175%、檸檬酸鈉0.2%、MgSO₄"0.03%、ZnSO₄"0.01%、CaCl₂"0.01%、KH₂PO₄"0.02%。在此條件下，酶活可達(dá)到205.63 U/mL。

關(guān)鍵詞：米曲霉；脫氨酶；發(fā)酵優(yōu)化；腺苷酸（AMP）

中圖分類號：TS201.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0127-06

Optimization of Fermentation Conditions for Deaminase Production by

Aspergillus oryzae 3.042 Strain

WANG Ze-jian^1，2， LIU Jian-bin¹， WAN Pei-yao¹， XING Li-min¹， XU Xin-yue²，

WANG Shao-jie³， LIANG Jian-guang^3*

（1.Huzhou Laohenghe Brewing Co.， Ltd.， Huzhou 313000， China; 2.School of Bioengineering，

East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China； 3.School of

Pharmacy amp; School of Biological and Food Engineering， Changzhou University，

Changzhou 213164， China）

Abstract： In this study， the preliminary exploration is conducted on the fermentation process of Aspergillus oryzae producing adenylate （AMP） deaminase by fermentation under shaking flask conditions， and the fermentation conditions of Aspergillus oryzae producing AMP deaminase are optimized.Through single factor （carbon source， organic nitrogen source， inorganic nitrogen source and surfactant） experiment and orthogonal experiment， the optimal conditions for producing AMP deaminase by Aspergillus oryzae under shaking flask conditions are 40 mL culture medium in 250 mL conical flask， being cultured at 28 ℃ for 62 h. The optimal composition content of the culture medium is bran 0.4%， sucrose 2.5%， fish meal "2%， （NH₄）₂SO₄"0.075%， Tween-80 0.175%， sodium citrate 0.2%， MgSO₄"0.03%， ZnSO₄"0.01%， CaCl₂"0.01% and KH₂PO₄"0.02%. Under these conditions， the enzyme activity could reach 205.63 U/mL.

Key words： Aspergillus oryzae; deaminase; optimization of fermentation; adenylate （AMP）

米曲霉（Aspergillus oryzae）屬于半知菌亞門，從梗孢科，在曲霉屬中比較常見，屬于好氧性真菌。米曲霉廣泛分布在不同地方，在糧食、發(fā)酵食物、腐敗有機(jī)物和土壤等中都能生長。Hashimoto等^[1]報道米曲霉的菌絲是由多細(xì)胞構(gòu)成的，因此米曲霉的酶系統(tǒng)也比較龐大，如蛋白酶、淀粉酶、氨基?；浮⒗w維素酶、脂肪酶、核酸酶等。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已經(jīng)認(rèn)可米曲霉為安全菌種，可以使用^[2]，世界衛(wèi)生組織也公布了米曲霉是絕對安全且可以投入食品行業(yè)生產(chǎn)使用的菌株^[3]。近年來，盡管人們在工業(yè)生產(chǎn)中用米曲霉菌種產(chǎn)酶系數(shù)量較多，擁有較廣泛的酶系^[4]，但是，國內(nèi)米曲霉相關(guān)的工藝研究卻比較少，在工業(yè)應(yīng)用方面，國內(nèi)也限制了這一傳統(tǒng)的食用菌株的進(jìn)一步拓展。

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase）是一種氨基水解酶，最初人們發(fā)現(xiàn)其由鼠骨骼肌產(chǎn)生，隨后人們發(fā)現(xiàn)也能從人血紅細(xì)胞中制備得到。當(dāng)前產(chǎn)業(yè)中通過培養(yǎng)酵母、青霉、曲霉和毛霉發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶^[5]。AMP脫氨酶是組成嘌呤核苷酸代謝循環(huán)的3種重要的酶類之一，在維持體內(nèi)腺苷酸能荷^[6]和機(jī)體免疫力方面起著重要作用^[7]。腺苷酸嘌呤堿基上的氨基能夠被定量脫去，得到NH₃和IMP^[8]。在食品添加劑領(lǐng)域，AMP脫氨酶可酶解腺苷酸生成IMP，IMP被用來生產(chǎn)強(qiáng)力味精，是核酸酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸的重要酶之一^[9-11]。最早Smiley等^[12]從兔骨骼肌肉中制備腺苷酸脫氨酶，Ikasari等^[13]在制備高溫淀粉酶時發(fā)現(xiàn)微生物也能分泌腺苷酸脫氨酶。在工業(yè)生產(chǎn)中通常使用酵母、青霉、曲霉和毛霉等微生物來發(fā)酵生產(chǎn)此酶，而涉及這類酶生產(chǎn)工藝的報道卻比較少^[14]。本文對滬釀3.042米曲霉菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脫氨酶，對產(chǎn)酶培養(yǎng)條件和液態(tài)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，以提高米曲霉在搖瓶條件下液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶水平，為脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

1"材料和方法

1.1"材料

1.1.1"菌株

米曲霉菌株：滬釀3.042，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2"試劑

蔗糖、魚粉、ZnSO₄、吐溫-80、NaHCO₃、瓊脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MgSO₄、（NH₄）₂SO₄、高氯酸：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；KH₂PO₄：宜興市輝煌化學(xué)試劑廠；檸檬酸鈉：昆山金城試劑有限公司；丁二酸：上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司。

1.2"主要儀器與設(shè)備

FA2004B精密電子天平"上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；LHP-100霉菌培養(yǎng)箱"上海申賢恒溫設(shè)備廠；Master-JX 2021R大容量恒溫培養(yǎng)搖床"上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WDZX-300KC立式壓力蒸汽滅菌器"上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9035A電熱鼓風(fēng)干燥箱"上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SYC-A水浴鍋"上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZH-2漩渦混合器"天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠；UV-4800紫外可見分光光度計(jì)"尤尼柯（上海）儀器有限公司；JB-CJ-1500FX超凈工作臺"蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；PH-2601臺式酸度計(jì)"廣州市新英電器有限公司。

1.3"方法

1.3.1"培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g，蔗糖 20 g，瓊脂 20 g，加水至1 000 mL，自然pH。

種子培養(yǎng)基：蔗糖30 g，酵母粉1.5 g，K₂HPO₄""0.1 g，魚粉 20 g，加水至1 000 mL，pH 6.5。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 4 g，蔗糖 50 g，魚粉 20 g，（NH₄）₂SO₄"1 g，檸檬酸鈉 2 g，MgSO₄"0.3 g，ZnSO₄"0.1 g，CaCl₂"0.1 g，KH₂PO₄"0.2 g，吐溫-80 1.5 g，加水至1 000 mL，pH 6.5。

1.3.2"菌株活化

將配好的PDA培養(yǎng)基滅菌后在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作，趁熱倒入茄子瓶固體斜面，待茄子瓶和斜面凝集后進(jìn)行接種工作，從母種中挑取一環(huán)生長良好的菌株接種到每個茄子瓶中和斜面表面（茄子瓶用棉花塞，外面用一層紗布包裹；斜面用硅膠塞），接種后將斜面和茄子瓶放入28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5 d后取出，放入冰箱冷藏室保存，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3"培養(yǎng)方法

用接種環(huán)在茄子瓶中完整的斜面上取一環(huán)生長完好的菌株，接入種子培養(yǎng)基中配制成懸浮液（孢子濃度約10¹⁰個/mL），于恒溫培養(yǎng)搖床上200 r/min、29 ℃培養(yǎng)24 h，移取2 mL菌懸液至裝有40 mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于恒溫?fù)u床上200 r/min、29 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.4"酶液制備

用濾紙過濾發(fā)酵液，移取1 mL濾液至潔凈的試管中，加入4 mL蒸餾水，將發(fā)酵液稀釋5倍，待用。

1.3.5"腺苷酸脫氨酶活力測定

原理：5′-AMP+H₂O→5′-IMP+NH₃。

當(dāng)AMP轉(zhuǎn)化為IMP時，會使265 nm處的吸光度值減少60%，因此在265 nm處IMP的分子消光系數(shù)僅為AMP的40%^[14]。依照這一原理，只要測定反應(yīng)液的ΔA_{265 nm}，即能確定AMP脫氨酶酶活。為使酶反應(yīng)能一直保持初速度，并能最大化地避免儀器誤差，實(shí)驗(yàn)條件如下：底物過量，反應(yīng)液的吸光度值保持在0.6～0.8之間；反應(yīng)前后吸光度值的改變量在0.1左右，減小操作誤差且保證消耗的底物在20%以內(nèi)。

步驟：取10 mL 0.08 mol/L的NaHCO₃溶液于燒杯中，用分析天平精確稱取139 mg腺苷酸溶解其中作為原始底物，然后用0.1 mol/L pH 5.9的琥珀酸緩沖液將其稀釋400倍，得到終濃度為0.1×10^-3 mol/L的反應(yīng)底物。移取3 mL反應(yīng)底物在35 ℃恒溫水浴鍋中保溫5 min，用移液槍準(zhǔn)確加入預(yù)稀釋的AMP脫氨酶液0.1 mL立刻計(jì)時反應(yīng)，15 min后加入3 mL 10%的高氯酸溶液終止反應(yīng)。對照實(shí)驗(yàn)方法同上，反應(yīng)底物應(yīng)先保溫，然后立即冰水預(yù)冷，高氯酸溶液先于酶液加入反應(yīng)液中。反應(yīng)結(jié)束后，在265 nm處用光程10 mm的石英比色皿以蒸餾水為參比測量吸光度值。

酶活定義：在上述條件下每分鐘吸光度值改變0.001定義為一個酶活力單位。

酶活（U/mL）=ΔA_{265 nm}×10×K/（0.001×T）。

式中：ΔA_{265 nm}為反應(yīng)液與對照吸光度值的差值；K為酶液稀釋倍數(shù)；T為酶反應(yīng)時間，min。

1.3.6"單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基裝液量兩個因素，其中培養(yǎng)時間設(shè)5個水平，即36，48，58，62，66，70 h；裝液量設(shè)4個水平，即20，30，40，50 mL。各因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以AMP脫氨酶的酶活作為指標(biāo)。

1.3.7"正交實(shí)驗(yàn)

以AMP脫氨酶的酶活為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

1.3.8"糖和氮含量的測定

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，在最優(yōu)水平下，按照對應(yīng)因素條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定pH，用DNS法測定發(fā)酵液中還原糖和總糖的含量^[15]，用甲醛滴定法測定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量。

2"結(jié)果與分析

2.1"培養(yǎng)條件對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶的影響

2.1.1"培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

將在茄子瓶中培養(yǎng)4～5 d的米曲霉無菌操作接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為28 ℃，分別在36，48，58，62，66，70 h測定酶活，測定結(jié)果見圖1。

由圖1可知，培養(yǎng)62 h時，米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶酶活最高，而36 h時酶活較低。培養(yǎng)36 h時，菌體處于延遲期，生長較緩慢，產(chǎn)酶能力較弱；而36～62 h時，菌體處于快速生長期，隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活也逐漸增加；培養(yǎng)62 h時，產(chǎn)AMP脫氨酶酶活出現(xiàn)了一個最高峰；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，酶活急劇下降；培養(yǎng)70 h時，酶活下降了37%左右，因此選取培養(yǎng)時間為62 h。

2.1.2"裝液量對產(chǎn)酶的影響

米曲霉是好氧性真菌，所以含氧量將直接影響其生長和產(chǎn)酶。當(dāng)氧氣含量較低時，米曲霉的生長會受到抑制。在生長和發(fā)酵過程中，細(xì)胞呼吸作用會產(chǎn)生CO₂，如果發(fā)酵液中CO₂的含量較高，對米曲霉的生長和產(chǎn)酶會有較大影響。但是，如果為了保證足夠的含氧量而過多地減少發(fā)酵液的裝液量，發(fā)酵期間米曲霉所需的碳、氮源等不足，也會影響其生長和產(chǎn)酶。所以必須統(tǒng)籌兼顧好這兩個因素，以獲得較高的酶活。實(shí)驗(yàn)中選用250 mL錐形瓶，主要考察了裝液量對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，當(dāng)250 mL錐形瓶裝液量為40 mL時，米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶的酶活較高。當(dāng)裝液量為20～30 mL時，雖然有足夠的含氧量，但隨著發(fā)酵時間的延長，碳源和氮源等必要的養(yǎng)分被米曲霉消耗殆盡，不足以發(fā)酵產(chǎn)酶，所以酶活較低；當(dāng)裝液量為40 mL時，酶活在一個較高的水平，比較適合米曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶；當(dāng)裝液量達(dá)到50 mL時，養(yǎng)分足以生長和產(chǎn)酶，但是由于裝液量的增加，搖床轉(zhuǎn)速不足以提供足夠的氧氣于發(fā)酵液中，米曲霉的產(chǎn)酶受到了一定的抑制，酶活有所降低。因此選取250 mL錐形瓶的培養(yǎng)基裝液量為40 mL。

2.2"培養(yǎng)基成分對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶的影響

2.2.1"碳源對產(chǎn)酶的影響

麩皮中含有淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素和豐富的礦物質(zhì)等，而麩皮中約55%的粗淀粉不能被微生物迅速吸收利用。本實(shí)驗(yàn)主要研究液態(tài)培養(yǎng)基成分對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，所以加入較少的麩皮，以保證能為微生物提供一定的微量成分，而其余主要的碳源、氮源和金屬離子等用化學(xué)試劑來替代，因此選取了兩種實(shí)驗(yàn)室中比較常見的糖類：蔗糖和葡萄糖，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，添加蔗糖時液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶酶活較高，尤其是當(dāng)蔗糖添加量增加到5%時，酶活達(dá)到122 U/mL；而添加葡萄糖時酶活相對較低。隨著碳源添加量的增加，米曲霉產(chǎn)酶酶活都相應(yīng)增加，但是加入蔗糖的酶活增幅明顯比加入葡萄糖的高，葡萄糖的增幅不是很明顯。因此，當(dāng)添加5%的蔗糖作為主要碳源時，能得到最高的酶活。

2.2.2"氮源對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基中的氮源必不可少，對于微生物的生長和產(chǎn)酶也有一定的影響。由于麩皮含量較少，不能提供米曲霉在整個發(fā)酵過程中所需的氮量。所以，有機(jī)氮源用魚粉來代替，而無機(jī)氮源用（NH₄）₂SO₄來代替。

2.2.2.1"魚粉添加量對產(chǎn)酶的影響

在研究過程中嘗試用玉米粉或酵母膏作為主要的有機(jī)氮源，結(jié)果并不理想，得到的產(chǎn)酶酶活幾乎為0 U/mL。玉米粉水煮過濾后得到的發(fā)酵液仍然比較渾濁，將種子瓶中的菌球接種至發(fā)酵瓶中發(fā)酵一定時間后，菌球并未生長，并且散發(fā)出一種臭味，幾乎沒有酶活；而用酵母膏的發(fā)酵液相對澄清，但是菌球仍不生長，測不到酶活，可能是由于這些有機(jī)氮源并不適合米曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶。

相對而言，用魚粉作為有機(jī)氮源，能得到一定的酶活。魚粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、維生素、生長因子等微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。所以，實(shí)驗(yàn)中研究了發(fā)酵液中魚粉添加量對米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶酶活的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)魚粉添加量為2%時，米曲霉發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶酶活最高。當(dāng)魚粉添加量為0.5%時，酶活僅為30 U/mL左右，魚粉的量不足以提供足夠的氮源用于菌體生長和發(fā)酵，繁殖量少，所以酶活較低；魚粉添加量從0.5%增加到2%時，酶活明顯上升；魚粉添加量達(dá)到2%時，酶活約為110 U/mL，是產(chǎn)酶的最佳濃度；當(dāng)魚粉添加量達(dá)到3%時，酶活呈下降趨勢，這是由于氮源過多會使菌體生長旺盛，pH過高不利于代謝產(chǎn)物的積累。因此，最適于米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶的魚粉添加量為2%。

2.2.2.2"（NH₄）₂SO₄添加量對產(chǎn)酶的影響

在微生物發(fā)酵中，較有機(jī)氮源來說，微生物吸收利用無機(jī)氮源相對比較迅速，發(fā)酵液中pH變化通常是無機(jī)氮源被微生物消耗引起的。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的無機(jī)氮源，對調(diào)整和穩(wěn)定菌體發(fā)酵過程中的pH有積極作用。（NH₄）₂SO₄是微生物發(fā)酵中一種常用的無機(jī)氮源，加入（NH₄）₂SO₄對米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶酶活的影響見圖4。

由圖4可知，（NH₄）₂SO₄添加量為0.05%時酶活較高，超過150 U/mL；隨著（NH₄）₂SO₄添加量由0.05%增加到0.3%時，產(chǎn)酶酶活呈線性減少趨勢；當(dāng)（NH₄）₂SO₄添加量為0.3%時，米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶的能力較弱，酶活僅為25 U/mL左右。過多的（NH₄）₂SO₄參與到發(fā)酵過程反應(yīng)中，產(chǎn)生較多的NH₃，不僅影響了發(fā)酵液的pH，而且使米曲霉菌體在發(fā)酵過程中繁殖過于旺盛，產(chǎn)酶量大大減少，不利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。所以，最適于菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的（NH₄）₂SO₄添加量為0.05%。

2.2.3"表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

表面活性劑能夠提高菌體細(xì)胞的滲透作用，在微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，可以適量添加表面活性劑。吐溫-80是經(jīng)常用來促進(jìn)產(chǎn)酶的表面活性劑。因此，考察加入吐溫-80對米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶酶活的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，液體培養(yǎng)基中添加0.15%吐溫-80時，菌體產(chǎn)酶酶活較高。不添加吐溫-80，酶活僅為50 U/mL左右；吐溫-80添加量過大，酶活下降較多，與不添加時酶活相當(dāng)，原因可能是過量的表面活性劑對細(xì)胞有毒害作用，抑制了細(xì)胞表面的通透性，影響微生物的正常代謝活動和產(chǎn)酶。所以，最佳的吐溫-80添加量為0.15%，此時酶活能達(dá)到約160 U/mL。

2.3"正交實(shí)驗(yàn)

由表3可知，正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)方案是A₁B₂C₃D₃，即米曲霉發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的液態(tài)培養(yǎng)基主要成分含量為蔗糖2.5%、魚粉2%、（NH₄）₂SO₄"0.075%、吐溫-80 0.175%。即1.3.1中的蔗糖、魚粉、（NH₄）₂SO₄和吐溫-80等主要成分添加量調(diào)整為最優(yōu)方案，其余保持原有的濃度。由極差分析可知，各因素對酶活影響的主次順序?yàn)锳gt;Cgt;Bgt;D，蔗糖添加量對液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶酶活的影響極大，其次是（NH₄）₂SO₄添加量，而魚粉添加量和吐溫-80添加量對AMP脫氨酶酶活的影響較小。

2.4"發(fā)酵過程中pH、糖和氮含量變化

經(jīng)過上述正交實(shí)驗(yàn)后得到最優(yōu)方案，按照其調(diào)整的配方重新培養(yǎng)一批產(chǎn)AMP脫氨酶酶活較高的組，在發(fā)酵過程中，對不同發(fā)酵時間段的發(fā)酵液進(jìn)行一系列的測定，包括發(fā)酵液的pH、總糖、還原糖和氨基酸態(tài)氮含量的測定。

2.4.1"pH的變化

液態(tài)發(fā)酵期間發(fā)酵液的pH測定結(jié)果見圖6。

發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5，當(dāng)接入米曲霉的菌球后，pH開始下降，0～50 h，pH隨著時間的推移呈線性減少趨勢；當(dāng)接近米曲霉產(chǎn)酶酶活最高的時刻，即62 h時，pH又開始上升，此時菌體的產(chǎn)酶酶活即將降低，各種碳源和氮源等營養(yǎng)也即將消耗殆盡，菌體不再生長和產(chǎn)酶。

2.4.2"總糖和還原糖含量的變化

液態(tài)發(fā)酵期間總糖和還原糖含量的測定結(jié)果見圖7。

由圖7可知，總糖和還原糖的含量都隨著發(fā)酵時間的增加而減少，當(dāng)達(dá)到產(chǎn)酶酶活最高的時刻，即62 h時，總糖和還原糖的含量接近于0%，代表發(fā)酵即將結(jié)束，菌體對碳源充分利用。

2.4.3"氨基酸態(tài)氮含量的變化

液態(tài)發(fā)酵期間氨基酸態(tài)氮含量的測定結(jié)果見圖8。

由圖8可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的增加呈平穩(wěn)下降趨勢，62 h還未出現(xiàn)上升，說明菌株活力較強(qiáng)，沒有出現(xiàn)菌株自溶現(xiàn)象。

3"結(jié)論與討論

對米曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行了初步研究，通過實(shí)驗(yàn)將米曲霉產(chǎn)AMP脫氨酶的培養(yǎng)條件初步調(diào)整為250 mL錐形瓶裝40 mL液態(tài)培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)62 h。最佳液態(tài)培養(yǎng)基為蔗糖2.5%、魚粉2%、（NH₄）₂SO₄"0.075%、吐溫-80 0.175%、檸檬酸鈉0.2%、MgSO₄"0.03%、ZnSO₄"0.01%、CaCl₂"0.01%、KH₂PO₄"0.02%、pH 6.5。

米曲霉在工業(yè)應(yīng)用中具有食源性，安全性高，是一種釀造過程中常用的菌株^[16-18]。作為具有遺傳誘變活性的關(guān)鍵酶類，脫氨酶在機(jī)體中參與多種生理過程的調(diào)控，同時也在基因編輯工具的開發(fā)中大放異彩^[19-22]。從細(xì)菌到人類，目前已知的所有核酸脫氨酶都有著相近的核心催化結(jié)構(gòu)以及高度保守的HxE-PCxxC基因序列，相關(guān)研究表明，高等生物中用于編輯DNA和RNA以調(diào)控諸多生理機(jī)能的核酸脫氨酶起源于細(xì)菌中用于誘導(dǎo)其他細(xì)菌基因組突變的一類毒素蛋白^[23-25]，因此今后脫氨酶研究主要集中在分子和生理機(jī)制方面。

目前我國對于米曲霉發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶尚未進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)初步研究了米曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)AMP脫氨酶的工藝，操作簡便，生產(chǎn)成本低，可直接用于呈味核苷酸的生產(chǎn)。將來，在此基礎(chǔ)上改進(jìn)其發(fā)酵方式或條件，或許可使其產(chǎn)酶量更高。隨著對核苷酸認(rèn)識的深入，研究米曲霉發(fā)酵產(chǎn)核酸脫氨酶的特性等，可以大大提高核苷酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展動力，具有廣闊的發(fā)展前景。

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