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    深綠木霉1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶基因的克隆及表達(dá)1)

    2016-08-08 00:56:55刁桂萍李松陽(yáng)王志英
    關(guān)鍵詞:脫氨酶

    刁桂萍 李松陽(yáng) 王志英

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

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    深綠木霉1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶基因的克隆及表達(dá)1)

    刁桂萍李松陽(yáng)王志英

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

    摘要以深綠木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153為試材,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆獲得1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶ACCD基因的cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明:此基因的cDNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1 083 bp,編碼區(qū)可編碼360個(gè)氨基酸。經(jīng)BlastP相似性分析,其屬于Try-synth-beta-Ⅱ家族,與里氏木霉(T. reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高,達(dá)到91%。在5種不同誘導(dǎo)條件下,ACCD基因的表達(dá)量均有明顯變化。在C、N饑餓培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)8 h與16 h時(shí),ACCD基因表達(dá)量達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的22.7倍與22.4倍;在山新楊葉粉與莖粉的誘導(dǎo)下,ACCD的表達(dá)量分別在培養(yǎng)的24 h與2 h達(dá)到最大,為未誘導(dǎo)的22.6倍與27.3倍。

    關(guān)鍵詞深綠木霉;脫氨酶;誘導(dǎo)表達(dá)

    1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACC脫氨酶)廣泛存在于多種微生物中,它能催化乙烯前體分解來(lái)降低植物體內(nèi)乙烯的合成,從而減少過(guò)量乙烯對(duì)植物自身生長(zhǎng)造成的不良影響[1]。大量研究發(fā)現(xiàn),土壤中微生物產(chǎn)生的ACC脫氨酶能促進(jìn)植物根部的生長(zhǎng)發(fā)育[2-4];而近年來(lái)研究也發(fā)現(xiàn),ACC脫氨酶能減輕非生物因素(如干旱、重金屬、鹽堿等)對(duì)植物的危害[5-7]。此外,部分研究證明,含有ACC脫氨酶的細(xì)菌能減輕植物病害[8-9],但ACC脫氨酶與病原菌的作用機(jī)制還不清楚。

    木霉菌(Trichodermaspp.)是一種極具應(yīng)用價(jià)值的生防菌,不僅能抑制多種病原真菌,還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其免疫能力,更是具有降解土壤中鹽類化合物、農(nóng)藥殘留物及重金屬離子等的功能[10]。然而,對(duì)于木霉菌中ACC脫氨酶生防功能的研究尚不多見(jiàn)。僅有的研究表明,深綠木霉(T. atroviride)通過(guò)產(chǎn)生ACC脫氨酶降解植物根部的乙烯前體,減少植物根部乙烯的合成來(lái)促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)[11];棘孢木霉(T. asperellum)T203中的ACC脫氨酶也被證明在促進(jìn)植物根部生長(zhǎng)中起重要作用[12]。本研究通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得了深綠木霉ACCC30153中ACC脫氨酶基因的cDNA全長(zhǎng),并研究了不同誘導(dǎo)條件下ACC脫氨酶的表達(dá),為今后進(jìn)一步研究深綠木霉ACC脫氨酶的生防功能提供參考。

    1材料與方法

    深綠木霉ACCC30153菌株,購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

    根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的ACCD基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物,以深綠木霉ACCC30153菌株菌絲體總mRNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆獲得ACCD基因的全長(zhǎng)cDNA和DNA序列。

    使用ORF查找器尋找ACCD基因的開(kāi)放讀碼框;用ExPASy-ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量等信息;通過(guò)BlastP預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū),尋找相似性序列;依據(jù)ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

    誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為15g/LNaH2PO4、453mg/LCaCl2、600mg/LMgSO4·7H2O、9.0mg/LFeSO4·7H2O、3.7mg/LCoCl2·7H2O、1.8mg/LMnSO4·H2O、2.5mg/LZnSO4·7H2O,并且含有5g/L(NH4)2SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的葡萄糖;C饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖);N饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含硫酸銨);山新楊葉粉培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖)+1%山新楊葉粉;山新楊莖粉培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖)+1%山新楊莖粉。

    菌絲體的培養(yǎng)與收集:將106個(gè)/mL木霉孢子接種于180mL1/4PD培養(yǎng)基中,于28 ℃、200r/min培養(yǎng)36h。然后,將菌絲體收集轉(zhuǎn)接到上述5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、24.0h收集菌絲體,保存到冰箱中(-80 ℃)備用(重復(fù)3次)。

    采用Trizol方法提取木霉菌絲體RNA,用DNA酶消化RNA中的DNA。參照TaKaRaPrimeScriptTMRT試劑盒(大連寶生物公司Code:DRR037S),以消化后的RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將稀釋10倍后的cDNA用作RT-qPCR模板。

    RT-qPCR反應(yīng)試劑盒為SYBRGreenRealtimePCRMastermix(ToyoboCo.,Ltd,Osaka,Japan)。反應(yīng)體系為2×SYBRGreenRealtimePCRMastermix10μL、引物(10μmol/L)各0.5μL、去離子水6μL、cDNA模板3μL。RT-qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30s;95 ℃ 5s、59 ℃ 15s、72 ℃ 10s;81 ℃讀板1s,45個(gè)循環(huán)(引物序列見(jiàn)表1)。

    表1 RT-qPCR引物

    2結(jié)果與分析

    2.1深綠木霉ACCD基因的克隆與生物信息學(xué)分析

    深綠木霉ACCD基因的cDNA全長(zhǎng)為1 083bp,共編碼360個(gè)氨基酸。ProtParam預(yù)測(cè)表明,該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為38140,理論等電點(diǎn)為6.13。通過(guò)BlastP進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)(見(jiàn)圖1),該蛋白基因?qū)儆赥ry-synth-beta-Ⅱ家族,具有Try-synth-beta-Ⅱ家族的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域。

    圖1 ACCD保守區(qū)預(yù)測(cè)

    通過(guò)NCBI的BlastP對(duì)ACCD基因進(jìn)行同源性搜索,在GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)中與深綠木霉ACCD基因氨基酸序列匹配的序列共有100個(gè),相似性為65%~91%。隨機(jī)選取14個(gè)ACCD基因進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果表明:深綠木霉ACCD基因氨基酸序列與里氏木霉(XP-006967764)氨基酸序列的同源性最高為91%。含有2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域,其中氨基酸序列的第295位和322位分別為Glu(E)和Leu(L),證明該蛋白質(zhì)具ACC脫氨酶活性(見(jiàn)圖2)。

    2.2深綠木霉ACCD基因在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)

    采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了5種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的深綠木霉ACCD基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。RT-qPCR分析結(jié)果顯示(見(jiàn)表2):在MM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,深綠木霉ACCD基因在24h內(nèi)呈連續(xù)上調(diào)表達(dá),在16h時(shí)達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的23.5倍。在C、N饑餓培養(yǎng)條件下,該基因在培養(yǎng)的24h內(nèi)均呈先上調(diào)后下降又大幅上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。在C饑餓培養(yǎng)中培養(yǎng)8h時(shí),ACCD基因表達(dá)量達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的22.7倍;在N饑餓培養(yǎng)條件下,ACCD基因表達(dá)量在培養(yǎng)16h時(shí)達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的22.4倍。在山新楊葉粉培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,ACCD基因在24h內(nèi)呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì),誘導(dǎo)僅1h表達(dá)量開(kāi)始急劇上升,在24h時(shí)達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的22.8倍。經(jīng)山新楊莖粉誘導(dǎo)后的ACCD基因表達(dá)量急劇上升,在第2h達(dá)到最大值,為未誘導(dǎo)時(shí)的27.3倍;此后,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),該基因表達(dá)量急劇下降。

    XP_006967764為里氏木霉(Trichoderma reesei);XP_013951488為綠色木霉(Trichoderma virens);KKO97124為哈茨木霉(Trichoderma harzianum);ACX94231為棘孢木霉(Trichoderma asperellum);XP_013945914為深綠木霉(Trichoderma atroviride);KUE98859為蓋姆斯木霉(Trichoderma gamsii);XP_007816500為綠疆菌(Metarhizium robertsii);KID86421為綠疆菌(Metarhizium guizhouense);XP_008597946為白僵菌(Beauveria bassiana);KPM40848為杓蘭菌根菌(Neonectria ditissima);CCT63766為鐮刀菌(Fusarium fujikuroi);KPA39012為鐮刀菌(Fusarium langsethiae);KLP01246為鐮刀菌(Fusarium fujikuroi);KIL92883為鐮刀菌(Fusarium avenaceum)。

    圖2 ACCD氨基酸序列多序列比對(duì)

    注:表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

    3結(jié)論與討論

    1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACCD)是一種能抑制植物體內(nèi)乙烯合成的胞內(nèi)聚合酶,能切斷植物激素乙烯合成前體,從而降低了環(huán)境與病原菌誘導(dǎo)對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制[3]。本研究克隆了深綠木霉ACCC30153中ACCD基因的全長(zhǎng)cDNA序列,該基因的cDNA全長(zhǎng)為1083bp,編碼區(qū)可編碼360個(gè)氨基酸。通過(guò)預(yù)測(cè)得知該蛋白屬于Try-synth-beta-Ⅱ家族,且蛋白不含信號(hào)肽,是一種胞內(nèi)酶。有研究表明,土壤中的天然細(xì)菌產(chǎn)生的ACC脫氨酶可將植物細(xì)胞中的乙烯前體分解,并利用其分解物做C源和N源,供自身利用[13]。本研究發(fā)現(xiàn),在C、N饑餓條件下,深綠木霉中的ACCD基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明該基因在木霉應(yīng)對(duì)缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件過(guò)程中起到一定作用。而通過(guò)模擬深綠木霉與植物互作的研究發(fā)現(xiàn),在與植物莖的互作過(guò)程中,ACCD基因會(huì)在互作的前期上調(diào)表達(dá),表明當(dāng)木霉受到山新楊莖中的ACC誘導(dǎo)后,導(dǎo)致其ACC脫氨酶轉(zhuǎn)錄水平提高,而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增強(qiáng),植物莖所含ACC被分解,ACCD基因的表達(dá)也會(huì)隨之下降[14]。ACCD最早是從土壤細(xì)菌中分離出來(lái)的。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),ACCD不僅存在于細(xì)菌中,在真菌中也檢測(cè)到了它的活性。但是,具體作用還沒(méi)有進(jìn)行深入研究,本研究結(jié)果可為今后進(jìn)一步研究深綠木霉ACCD基因的功能提供參考。

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    第一作者簡(jiǎn)介:刁桂萍,女,1981年11月生,東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,副教授。E-mail:dgp2003@126.com。 通信作者:王志英,東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,教授。E-mail:zyw0451@sohu.com。

    收稿日期:2016年4月13日。

    分類號(hào)Q933

    CloningandDifferentialExpressionofAnACCDeaminaseGenefromTrichoderma atrovirideACCC30153//

    DiaoGuiping,LiSongyang,WangZhiying

    (NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity,2016,44(8):104-107.

    ThecDNAofACCdeaminase(ACCD)genewasisolatedfromTrichoderma atrovirideACCC30153byusingPCR.ThecDNAsequenceofACCDwas1 083bpinlength,encoding360aminoacids.BlastPsearchindicatedthatACCDbelongedtoTry-synth-beta-Ⅱfamilyanditshownthehighestsimilarity91%withaproteinofT. reesei (XP-006967764). ACCDwasproventobedifferentiallytranscribedunderfivedifferenttreatments. ACCDtranscriptswereup-regulatedundernutritionalstressconditionswithpeaktranscriptionlevelsof22.7and22.4times,at8hand16h,respectively. ACCDtranscriptionwasalsoup-regulatedby1%leafandstempowderofPopulus davidiana×P. albavar. pyramidalis,withpeaktranscriptionlevelsof22.6and27.3times,at24hand2h,respectively.

    KeywordsTrichoderma atroviride; ACC deaminase; Differential expression

    1)中央高?;A(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014BA08);中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20110491014);黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)。

    責(zé)任編輯:張玉。

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