香樟CcCBFs基因的克隆及表達模式1)

李勇鵬　張力維　張佳佳　陳慧茹　曹玥華　杜麗

(南陽師范學(xué)院，南陽，47300)

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香樟CcCBFs基因的克隆及表達模式1)

李勇鵬張力維張佳佳陳慧茹曹玥華杜麗

(南陽師范學(xué)院，南陽，47300)

摘要CBF轉(zhuǎn)錄因子又稱為DREB1，在增強植物抵御非生物脅迫(低溫、干旱和鹽脅迫)方面具有重要的作用。利用同源克隆的方法結(jié)合RACE PCR技術(shù)，從香樟中獲得2個CBF類似基因的cDNA全長序列，命名為CcCBFa和CcCBFb，其cDNA序列全長分別為909和941 bp，分別包含一個714和729 bp的開放閱讀框，編碼237和242個氨基酸；gNDA序列分析結(jié)果顯示，CcCBFa和CcCBFb基因均不含有內(nèi)含子。一系列生物信息學(xué)分析表明，CcCBFa和CcCBFb基因?qū)儆贒REB家族的CBF/DREB1亞家族，將所獲得香樟CBF基因cDNA全長序列提交到NCBI(登錄號：KJ958932和KJ958933)。此外，實時定量PCR結(jié)果表明，CcCBFa和CcCBFb基因在香樟不同器官中的表達量存在一定差異，并且均能被低溫、干旱、鹽以及ABA強烈誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，CcCBFa和CcCBFb可能在香樟應(yīng)對低溫、干旱和鹽等非生物脅迫時發(fā)揮重要作用，并且可能與ABA信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞香樟；CcCBF基因；非生物脅迫；RACE PCR；基因表達

植物由于不能像動物一樣自由移動，它們不得不應(yīng)對來自生長環(huán)境一系列不利因素的傷害，這些不利因素包括生物脅迫和非生物脅迫。非生物脅迫，主要包括低溫、干旱和高鹽脅迫，是影響植物生長、發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素，并且決定了植物的地理分布，其中低溫對植物的限制性影響最為深遠[1-2]。為了應(yīng)對各種各樣的脅迫，植物經(jīng)過漫長的進化，在形態(tài)、生理、生化和分子等方面做出了一系列適應(yīng)性改變，使自身得以生存和繁殖[3]。植物在經(jīng)過一段低溫非冷凍處理后，抗寒性會顯著增強，這就是植物的冷馴化(coldacclimation)，植物的冷馴化是一個多基因參與的復(fù)雜過程。研究表明，當(dāng)植物處于逆境時植物會激活或抑制大量具有不同功能的基因的表達，這些基因被分為兩類，第一類基因主要是功能蛋白基因，表達一些可以減少逆境對植物傷害的保護蛋白，如胚胎晚期發(fā)育豐富蛋白、抗凍蛋白、分子伴侶，水通道蛋白膜轉(zhuǎn)運蛋白以及合成有機滲透調(diào)節(jié)劑如脯氨酸、糖、糖醇和甜菜堿等的關(guān)鍵酶等；另一類基因主要是調(diào)節(jié)基因，通過調(diào)節(jié)多個下游基因的表達來抵御不良環(huán)境，如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶和光合作用相關(guān)的酶類[3-4]。

CBF(C-repeatBindingFactor)又稱為DREB1(DehydrationResponsiveElementBindingFactor1)作為一種與冷馴化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，成為近年來植物抗寒研究的熱點。CBF/DREB1蛋白可以特異地結(jié)合在COR(coldregulated)基因啟動子的CRT/DRE(c-repeat/dehydration-responsiveelement)區(qū)域，從而調(diào)控多個低溫相關(guān)基因的表達[5-8]。在擬南芥中DREB亞家族的蛋白又被分為6個小組，命名為A-1至A-6，A-1和A-2構(gòu)成DREB亞家族中最大的兩個組，其中CBF基因?qū)儆贒REBA-1(DREB1)組主要與植物應(yīng)對低溫脅迫相關(guān)[9-10]。自從Stockingeretal[6]從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離并鑒定了AtCBF1，研究者們已經(jīng)從許多植物中克隆到了CBF/DREB1基因，包括大豆(Glycine max)、香瓜(Cucumis melo)、河北楊(Populus hopeiensis)、短柄草(Brachypodium distachyon)，萵苣(Lactuca sativa)、楊樹(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis)和鹽地堿蓬(Suaeda salsa)等[11-18]。與CBF/DREB基因相關(guān)的大量研究表明，CBF/DREB1可能與一種逆境相關(guān)，也可能同時與多種逆境相關(guān)，并且當(dāng)組成型表達該家族基因時，可以增強轉(zhuǎn)基因植物對一種或多種脅迫的抵御能力[19-20]。可見,通過轉(zhuǎn)化CBF/DREB1調(diào)節(jié)下游抗寒相關(guān)基因的表達，從而增強作物的抗寒性是可行的，這一發(fā)現(xiàn)為利用基因工程手段改良植物抗寒性提供了一條新思路。

香樟(Cinnamomum camphora)是亞熱帶常綠闊葉樹種，因其樹形優(yōu)美，冠大蔭濃經(jīng)常作為行道樹、庭蔭樹、孤植樹等應(yīng)用于城市的園林綠化中。成功地往北方地區(qū)引種香樟，不但可以豐富當(dāng)?shù)貓@林常綠樹種種類，還可以改善北方城市的冬季園林景觀。但是，香樟抗寒性差這一不良性狀，使其地理分布和在園林綠化中的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制[21]。而通過選育或基因工程手段獲得抗寒性增強的香樟新品種是解決這一問題的關(guān)鍵。本研究通過對香樟CBF基因進行克隆和表達模式分析，將有助于了解香樟抵御低溫脅迫的分子機制，為進一步研究其功能和作為候選基因應(yīng)用于香樟的遺傳改良奠定基礎(chǔ)，至今香樟CBF基因的相關(guān)研究尚未見報道。

1材料與方法

1.1試驗材料

用于脅迫處理的試驗材料為6月齡的生長在自然條件下的香樟實生幼苗，約30cm高，種植于直徑約19cm的花盆中。進行脅迫處理試驗前，先將幼苗置于培養(yǎng)箱適應(yīng)1周，其培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照強度3 000lx，光照時間16h/d，相對濕度75%。干旱、鹽和ABA處理前，幼苗置于培養(yǎng)箱中利用液體培養(yǎng)1周。根、莖和葉取材于本實驗室溫保存的香樟無性系組培苗，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照強度2 500lx，光照時間16h/d。

1.2香樟CcCBF基因的克隆

采用EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒提取香樟葉片(4 ℃處理4h)總RNA，并用DNaseI(ThermoFisherScientific,USA)去除樣品可能污染的基因組DNA(gDNA)。RNA樣品的濃度和質(zhì)量通過瓊脂凝膠電泳和NanoDrop2000(ThermoFisherScientific,USA)檢測，合格的樣品取2μg使用PrimeScriptII1ststrandcDNASynthesisKit(TaKaRa,大連，中國)試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)已公布的CBF基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物CcCBF-F和CcCBF-R(表1)，利用該對引物以上述cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收連接到pMD19-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，將陽性克隆送往上海生工測序。

根據(jù)所獲得中間片段設(shè)計兩對引物5′CBFGSP1、5′CBFGSP2和3′CBFGSP1、5′CBFGSP,2(表1)按照RACE試劑盒SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit說明書分進行基因的5′/3′區(qū)域的擴增。第一輪PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30s，62 ℃退火30s；72 ℃延伸1min30s，5個循環(huán)；94 ℃變性30s，65 ℃退火30s；72 ℃延伸1min30s，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10min。擴增產(chǎn)物用去離子水1∶50稀釋用于下一步nestedPCR的反應(yīng)模板。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30s，65 ℃退火30s；72 ℃延伸1min，32個循環(huán)；72 ℃總延伸10min。嵌套式PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測和回收連接到克隆載體上并測序。

表1　實驗中所用引物

注：簡并堿基K(GT),Y(CT),M(AC),R(AG),D(GAT),B(GTC),H(ATC)。

1.3香樟CcCBF基因核苷酸序列、編碼蛋白的氨基酸序列分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將測序獲得的香樟CBF基因的核苷酸序列以及推導(dǎo)的相應(yīng)氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站利用BLAST在線分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性分析，下載其他物種的CBF/DREB1氨基酸序列與所獲得基因氨基酸序列進行多序列比對，利用Clustax2.0和MEGA5.0進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.4低溫脅迫處理

在人工氣候箱25 ℃條件適應(yīng)1周的香樟幼苗，置于同樣規(guī)格的培養(yǎng)箱內(nèi)4 ℃(除溫度外其他條件保持一致)進行低溫處理，分別于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72h取葉片。

1.5干旱、鹽和ABA處理

利用20%的PEG(polyethyleneglycol)6000溶液和250mmol/LNaCl溶液分別模擬干旱和鹽脅迫環(huán)境，ABA是一種跟逆境相關(guān)的植物激素，處理濃度為100μmol/L，將在蒸餾水培養(yǎng)一周的幼苗分別置于相應(yīng)溶液中進行處理，于0、0.5、1、2、4、6、12和24h取葉片。每個處理3株幼苗，每株幼苗，每個時間點取3個葉片用于試驗重復(fù)，所有材料收獲后立即用液氮速凍，并于冰箱-80 ℃保存用于RNA提取和qPCR分析。

1.6定量實時PCR(qPCR)分析及數(shù)據(jù)處理

cDNA樣品用去離子水稀釋后用于qPCR反應(yīng)的模板，qPCR采用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Roche，Germany)熒光定量試劑盒在CFX96TM103實時PCR檢測系統(tǒng)上(Bio-Rad，USA)進行，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性15s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共40次循環(huán)；溶解曲線在65～95 ℃，每0.05s升高0.5 ℃。試驗所用內(nèi)參基因為香樟延伸因子基因CcEF1α[22]，利用CFX96自帶的Bio-RadCFXmanager2.0軟件計算基因的相對表達量，每個樣品重復(fù)3次。qPCR所用引物(表1)在用于定量PCR分析試驗之前均將其擴增產(chǎn)物進行測序確保引物特異性。

1.7香樟CcCBF基因在不同器官中的表達差異

采用半定量RT-PCR技術(shù)，以根、莖和葉的cDNA樣品為模板檢測香樟CcCBF基因在不同器官中的差異性表達，香樟延伸因子基因CcEF1α作為內(nèi)參。

2結(jié)果與分析

2.1香樟CcCBF基因的克隆和序列分析

簡并引物CcCBF-F和CcCBF-R的擴增產(chǎn)物經(jīng)測序獲得一個147bp的基因片段，通過NCBI的BLAST工具分析該片段與DREB家族的基因有較高的同源性。將該片段與RACE所獲得的5’/3’cDNA片段進行拼接，獲得2個核苷酸序列高度相似的cDNA序列全長，分別為909和941bp，命名為CcCBFa和CcCBFb，并將2個香樟CBF基因cDNA序列全長提交到NCBI，登錄號分別為KJ958932和KJ958933。為確保序列片段的拼接結(jié)果來自同一基因并驗證基因內(nèi)部是否含有內(nèi)含子，研究設(shè)計了兩對特異引物(表1)，分別以cDNA和gDNA為模板利用PCR技術(shù)進行2基因開放閱讀框ORF(openreadframes)區(qū)域的擴增(圖1)。將擴增產(chǎn)物進行測序，CcCBFa和CcCBFb基因的ORF區(qū)域為714和729bp，分別編碼237和242個氨基酸，由此可知，實驗獲得的2個序列確實來自不同的基因，并且均不含有內(nèi)含子。在線分析軟件Expasy(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測其所編碼蛋白的分子量為26.2和26.5ku，等電點為5.01和5.11。

M.DNAmarker(DL2000);1、2.CcCBFa編碼區(qū)擴增產(chǎn)物;3、4.CcCBFb編碼區(qū)擴增產(chǎn)物;1、3以cDNA為模板,2、4以gDNA為模板。

圖1CcCBFa和CcCBFb基因編碼區(qū)PCR擴增電泳圖譜

2.2香樟CcCBF與其他物種CBF/DREB1蛋白的同源性分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對香樟CcCBF基因推導(dǎo)的氨基酸序列和其他物種的DREB蛋白進行多序列比對(圖2)，結(jié)果表明，CcCBF與其他DREB蛋白有較高的同源性，CcCBFa和CcCBFb均含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，并且它們的AP2結(jié)構(gòu)域只有一個氨基酸的差異。在其AP2結(jié)構(gòu)域的兩端含有CBF家族的典型的保守氨基酸序列：PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAW，并且CcCBF蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域中含有兩個保守的分別位于第14位的纈氨酸殘基V14和位于第19位谷氨酸殘基E19。利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)對他們的AP2結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，其AP2結(jié)構(gòu)域中含有3個β折疊和一個α螺旋。本研究所克隆的香樟CcCBFa和CcCBFb基因與擬南芥4個DREB1基因中的AtDREB1D(CBF4)基因的AP2結(jié)構(gòu)域氨基酸序列最為相似，有3個氨基酸位點的差異，其中2個在AP2結(jié)構(gòu)域的α螺旋位點，氨基酸位點的差異不影響其二級結(jié)構(gòu)的形成。

為了進一步了解所克隆香樟CBF基因與其他物種CBF/DREB基因的進化關(guān)系，從NCBI下載了20個來自不同單子葉和雙子葉植物的DREB1和DREB2蛋白的氨基酸序列，利用ClustalX2.0軟件進行多序列比對，比對結(jié)果利用MEGA5.0軟件建立系統(tǒng)進化樹(圖3)，結(jié)果顯示，DREB1和DREB2家族分為兩支，并且同一家族中單子葉植物和雙子葉植物也明顯地各聚為一支，香樟CBF與DREB1與來自雙子葉植物的DREB1基因親緣關(guān)系較近，說明本研究所克隆的2個基因可能屬于CBF/DREB1家族，可能跟其他DREB1基因有相似的功能，在香樟抵御脅迫的過程發(fā)揮一定的作用。

擬南芥AtDREB1A(NP_567720.1),AtDREB1B(NP_567721.1),AtDREB1C(NP_567719.1)和AtDREB1D(NP_200012.1);月季RhDREB1B(ACI42860.1);大麥HvCBF2(AAM13419.1);木薯MeCBF1(AAY43213.1);水稻OsDREB1B(AAN02488.1)。AP2結(jié)構(gòu)域用黑色實線表示，黑色方框內(nèi)為CBF蛋白標(biāo)志性序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR，箭頭指出的是DREB家族的兩個保守氨基酸殘基V14和E19，星狀代表β折疊，三角狀代表α螺旋。

圖2香樟CBF蛋白與來自其他物種DREB蛋白的氨基酸序列比對

2.3香樟CcCBF基因在低溫脅迫處理下的表達模式

利用qPCR技術(shù)研究了香樟CcCBF基因在低溫脅迫下的表達模式，表達分析結(jié)果(表2)表明，低溫(4 ℃)處理下，CcCBFa和CcCBFb的表達量均顯著增加，并且2個基因具有相似的表達模式：在低溫處理30min后，2個基因的表達即被誘導(dǎo)，表達量分別是對照(25 ℃)的7.9倍和3.1倍，隨著低溫處理時間的延長，2個基因的表達量呈逐漸增高的趨勢，并且在低溫處理6h的時候表達量達到最大值，表達量分別是對照的3808倍和1688倍，之后表達量開始降低，但在低溫處理72h，2個基因的表達量仍為對照的17.2倍和9.8倍。表達分析結(jié)果表明，CcCBFa基因相對于CcCBFb基因，對低溫誘導(dǎo)的響應(yīng)更加顯著，由此可知，CcCBFa基因在香樟抵御低溫脅迫中可能發(fā)揮更重要的功能。

2.4香樟CcCBF基因在干旱、鹽和ABA處理下的表達模式

干旱對CcCBFa和CcCBFb表達的誘導(dǎo)速度較為迅速(表3)，在20%PEG溶液處理香樟幼苗30min時，這2個基因的表達量就有顯著的提高，分別為對照(蒸餾水)的119倍和113倍，并且在脅迫進行1h即達到峰值，表達量分別為對照的152倍和150倍，而后隨脅迫時間延長表達量開始下降，但在脅迫進行24h時，兩基因的表達量有一個回升。CcCBFa和CcCBFb對鹽脅迫的響應(yīng)更為迅速，其表達量在脅迫處理30min就達到最大值，分別為對照(蒸餾水)的458倍和264倍，之后表達量開始下降(表4)。CcCBFa和CcCBFb對ABA的響應(yīng)模式與干旱類似(表5)，其表達量在處理1h達到峰值分別為對照的914倍和1183倍。以上結(jié)果表明，干旱、鹽和ABA均可以誘導(dǎo)CcCBFa和CcCBFb基因的表達，并且這2個基因?qū)BA的反應(yīng)較干旱和鹽脅迫顯著，上述研究結(jié)果意味著這2個基因可能與多種脅迫密切相關(guān)，參與到香樟抵御各種脅迫的過程中，并且可能與ABA介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。

擬南芥AtDREB1A(NP_567720.1),AtDREB1B(NP_567721.1),AtDREB1C(NP_567719.1),AtDREB1D(NP_200012.1)和AtDREB2A(NP_001031837.1);月季RhDREB1B(ACI42860.1);木薯MeCBF1(AAY43213.1);水稻OsDREB1B(AAN02488.1)和OsDREB2(A2WL19.2);大麥HvCBF2(AAM13419.1)和HvCBF3(ABE02630.1)；玉米ZmDREB1A(NP_001105651.1)和ZmDREB2A(BAE96012);新疆野蘋果MsDREB2(AFS60111.1);大葉楊PtDREB2(ABO48361);萵苣LsDREB2A(BAO00821.1);甘蔗SoDREB2(AFV52020.1);野牛草BdDREB2(ABP52086.1)。

圖3部分來自雙子葉和單子葉植物的DREB1和DREB2蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.5香樟CcCBF基因的器官特異性表達分析

半定量RT-PCR分析結(jié)果(圖4)表明，正常溫度條件下，香樟CcCBFa和CcCBFb基因在根、莖和葉中均有一定程度的表達，但其在莖中的表達量相對較高。

表2　CcCBFa和CcCBFb基因在低溫處理下相對表達量

表3　CcCBFa和CcCBFb基因在干旱處理下相對表達量

表4　CcCBFa和CcCBFb基因在鹽處理下相對表達量

表5　CcCBFa和CcCBFb基因在ABA處理下相對表達量

圖4　CcCBFa和CcCBFb基因在香樟根、莖、葉中的表達

3結(jié)論與討論

DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對非生物脅迫時發(fā)揮重要的作用，本研究成功克隆了2個香樟CBF基因，CcCBFa和CcCBFb；氨基酸序列分析表明，2個香樟CBF基因1個AP2結(jié)構(gòu)域，并且在AP2結(jié)構(gòu)域的上下游含有CBF蛋白標(biāo)志性序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAW，該序列被認(rèn)為是CBF蛋白的特征序列[23]。而PKK/RPAGRxKFxETRHP被認(rèn)為是CBF蛋白的核定位信號序列(NLS)[2，24]，預(yù)示著香樟CBF基因可能作為一種轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中發(fā)揮作用。另外，其AP2結(jié)構(gòu)域中包含的V14和E19氨基酸殘基在其識別和調(diào)節(jié)下游逆境相關(guān)基因的表達過程中起關(guān)鍵作用[9，25]。序列比對分析表明，CcCBFa和CcCBFb基因核苷酸序列與其編碼蛋白的氨基酸序列相似度分別為84.49%和86.64%，說明了CBF基因家族的高度保守性，這也是為什么我們用同樣的引物獲得了2個不同的基因。

早先的研究曾指出，DREB1基因的表達主要被低溫誘導(dǎo)，而不被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)，而DREB2基因主要被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)而不被低溫誘導(dǎo)[10]。如來自黑麥草(Lolium perenne)的DREB1基因LpCBF3的表達只被低溫誘導(dǎo)，而不被干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)[26]；來自萵苣(L. sativa)的DREB2家族基因LsDREB2A可以被干旱和鹽誘導(dǎo)，卻不被低溫、高溫和ABA誘導(dǎo)[15]。近年來，隨著科研工作者們對DREB家族基因研究的深入進行，發(fā)現(xiàn)DREB基因在不同植物中抵御脅迫時可能發(fā)揮不同的作用，如來自葡萄(Vitis amurensis)的DREB1家族基因VaCBF1基因不僅被低溫誘導(dǎo)，而且可以被干旱和鹽誘導(dǎo)[27]；來自西紅柿(Solanum lycopersicum)的DREB2基因LeDREB2不僅可以被干旱誘導(dǎo)，還可以被低溫誘導(dǎo)[28]。ABA是一種與植物抵御逆境相關(guān)的植物激素，大量研究報道了ABA可以誘導(dǎo)DREB基因的表達[27，29]。因此，本研究探討了所獲得的2個CcCBF基因與ABA和多個脅迫因子包括低溫、干旱和鹽脅迫的相關(guān)性，結(jié)果表明該2個基因均能被上述4個影響因子所誘導(dǎo)，同樣的結(jié)果可以在葡萄、巨桉等研究中發(fā)現(xiàn)[17，27]。并且2個基因的表達模式較為相似，從表達分析數(shù)據(jù)來看，CcCBFa在各個脅迫下的表達量與對照相比增加更為顯著，可能在香樟應(yīng)對脅迫過程中發(fā)揮更重要的作用。并且，正常條件下，2個基因在香樟根、莖和葉片中均有一定量的表達，并且莖中的表達量相對較高。以上結(jié)果表明，盡管CBF家族的基因在序列和結(jié)構(gòu)上有較高的保守性，他們在不同物種應(yīng)對脅迫時可能具有不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

本研究從香樟中成功分離到2個CBF基因，CcCBFa和CcCBFb，這2個基因均屬于DREB家族的DREB1組，基于qPCR的表達分析顯示，CcCBFa和CcCBFb基因均有響應(yīng)低溫脅迫的特征，并且與干旱、鹽脅迫和ABA相關(guān)。此外，CcCBFa和CcCBFb基因在香樟不同器官中的表達量存在一定差異。研究結(jié)果有助于揭示香樟在冷馴化過程中的分子機制，并且為進一步創(chuàng)制抗寒性增強的香樟新種質(zhì)提供一定的研究基礎(chǔ)。香樟CBF基因下游基因的鑒定以及其在轉(zhuǎn)基因水平上的應(yīng)用將成為下一步研究的重點。

參考文獻

[1]AKHTARM,JAISWALA,JAISWALJP,etal.Cloningandcharacterizationofcold,saltanddroughtinducibleC-repeatbindingfactorgenefromahighlycoldadaptedecotypeofLepidium latifoliumL[J].PhysiolMolBiolPlants,2013,19(2):221-230.

[2]AKHTARM,JAISWALA,TAJG,etal. DREB1/CBFtranscriptionfactors:theirstructure,functionandroleinabioticstresstoleranceinplants[J].JournalofGenetics,2012,91(3):385-395.

[3]GUOC,ZHANGJQ,PENGT,etal.StructuralandexpressionanalysesofthreePmCBFsfromPrunus mume[J].BiologiaPlantarum,2014,58(2):247-255.

[4]SANCHITA,DHAWANSS,SHARMAA.Analysisofdifferentiallyexpressedgenesinabioticstressresponseandtheirroleinsignaltransductionpathways[J].Protoplasma,2014,251(1):81-91.

[5]BAKERSS,WILHELMKS,THOMASHOWMF.The5′-regionofArabidopsisthalianacor15ahascis-actingelementsthatconfercold-,drought-,andABA-regulatedgeneexpression[J].PlantMolecularBiology,1994,24(5):701-713.

[6]STOCKINGEREJ,GILMOURSJ,THOMASHOWMF. Arabidopsis CBF1encodesanAP2domain-containingtranscriptionactivatorthatbindstotheC-repeat/DRE，acis-actingDNAregulatoryelementthatstimulatestranscriptioninresponsetolowtemperatureandwaterdeficit[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1997,94(3):1035-1040.

[7]THOMASHOWMF.MolecularBasisofPlantColdAcclimation:InsightsGainedfromStudyingtheCBFColdResponsePathway[J].PlantPhysiology,2010,154(2):571-577.

[8]YANGW,LIUXD,CHIXJ,etal.DwarfappleMbDREB1enhancesplanttolerancetolowtemperature,drought,andsaltstressviabothABA-dependentandABA-independentpathways[J].Planta,2011,233(2):219-229.

[9]SAKUMAY,LIUQ,DUBOUZETJG,etal.DNA-BindingspecificityoftheERF/AP2domainofArabidopsisDREBs,transcriptionfactorsinvolvedindehydration-andcold-induciblegeneexpression[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2002,290(3):998-1009.

[10]LIUQ,KASUGAM,SAKUMAY,etal.Twotranscriptionfactors, DREB1andDREB2,withanEREBP/AP2DNAbindingdomainseparatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression,respectively,inArabidopsis[J].PlantCell,1998,10(8):1391-1406.

[11]LIXP,TIANAG,LUOGZ,etal.SoybeanDRE-bindingtranscriptionfactorsthatareresponsivetoabioticstresses[J].TheorApplGenet,2005,110(8):1355-1362.

[12]MIZUNOS,HIRASAWAAY,SONODAAM,etal.IsolationandcharacterizationofthreeDREB/ERF-typetranscriptionfactorsfrommelon(Cucumis melo)[J].PlantScience,2006,170(6):1156-1163.

[13]王澤亮,秦鵬飛,郭洪英,等.河北楊CBF類基因的克隆及其進化[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,41(10):75-81.

[14]RYUJY,HONGSY,JOSH,etal.Molecularandfunctionalcharacterizationofcold-responsiveC-repeatbindingfactorsfromBrachypodium distachyon[J].BMCPlantBiology,2014,14(1):1-15.

[15]KUDOK,OIT,UNOY.FunctionalcharacterizationandexpressionprofilingofaDREB2-typegenefromlettuce(Lactuca sativaL.)[J].PlantCellTissOrganCult,2014,116(1):97-109.

[16]趙金玲,姚文靜,王升級,等.楊樹AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,43(10):21-29.

[17]魏曉玲,程龍軍,竇錦青,等.巨桉EgrDREB2A基因結(jié)構(gòu)及表達特性分析[J].林業(yè)科學(xué),2015,51(2):80-89.

[18]SUNXB,MAHX,JIAXP,etal.MolecularcloningandcharacterizationoftwonovelDREBgenesencodingdehydration-responsiveelementbindingproteinsinhalophyteSuaeda salsa[J].Genes&Genomics,2015,37(2):199-212.

[19]TANGMJ,LIUXF,DENGHP,etal.Over-expressionofJcDREB,aputativeAP2/EREBPdomain-containingtranscriptionfactorgeneinwoodybiodieselplantJatropha curcas,enhancessaltandfreezingtoleranceintransgenicArabidopsis thaliana[J].PlantScience,2011,181(6):623-631.

[20]XUEY,WANGYY,PENGRH,etal.TranscriptionfactorMdCBF1geneincreasesfreezingstresstoleranceintransgenicArabidopsis thaliana[J].BiologiaPlantarum,2014,58(3):499-506.

[21]DUL,LIYP,YAOY,etal.Anefficientprotocolforplantletregenerationviadirectorganogenesisbyusingnodalsegmentsfromembryo-culturedseedlingsofCinnamomum camphoraL.[J].PLoSONE,2015,10(5):e0127215.

[22]張力維,李勇鵬,姚瑤,等.香樟延伸因子EF1α基因片段的克隆和表達分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2015,35(5):122-128.

[23]CarlosFC,RaquelR,IreneR,etal.UnravelingtherolesofCBF1,CBF4anddehydrin1genesintheresponseoftablegrapestohighCO2levelsandlowtemperature[J].JPlantPhyisiol,2013,169(7):744-748.

[24]PENGXJ,MAXY,FANWH,etal.ImproveddroughtandsalttoleranceofArabidopsis thalianabytransgenicexpressionofanovelDREBgenefromLeymus chinensis[J].PlantCellRep,2011,30(8):1493-1502.

[25]GUTTERSONN,REUBERTL.RegulationofdiseaseresistancepathwaysbyAP2/ERFtranscriptionfactors[J].CurrOpinPlantBiol,2004,7(4):465-471.

[26]XIONGYW,FEISZ.FunctionalandphylogeneticanalysisofaDREB/CBF-likegeneinperennialryegrass(Lolium perenneL.)[J].Planta,2006,224:878-888.

[27]DONGC,ZHANGZ,QINY,etal. VaCBF1fromVitis amurensisassociatedwithcoldacclimationandcoldtolerance[J].ActaPhysiolPlant,2013,35(10):2975-2984.

[28]GUOJ,WANGMH.ExpressionprofilingoftheDREB2typegenefromtomato(Solanum lycopersicumL.)undervariousabioticstresses[J].HorticultureEnvironmentandBiotechnology,2011,52(1):105-111.

[29]LIULQ,ZHUK,YANGYF,etal.Molecularcloning,expressionprofilingandtrans-activationpropertystudiesofaDREB2-likegenefromchrysanthemum(Dendranthema vestitum)[J].JPlantRes,2008,121(2):215-226.

第一作者簡介：李勇鵬，男，1991年11月生，南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，碩士研究生。E-mail：daniel_lee1217@yeah.net。 通信作者：杜麗，南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，教授。E-mail：dldldlucky@163.com。

收稿日期：2015年12月22日。

分類號S943.2

CloningandExpressionProfilingofCcCBFGenesinCinnamomum camphora//

LiYongpeng,ZhangLiwei,ZhangJiajia,ChenHuiru,CaoYuehua,DuLi

(NangyangNormalUniversity,Nanyang473000,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：34-40.

Asanimportanttranscriptionfactor,C-repeatbindingfactor(CBF),alsocalleddehydration-responsiveelementbindingfactor1(DREB1),playsakeyroleinenhancingplanttolerancetoaboticenvironmentalstressessuchaslowtemperature,droughtandsalinity.TwonovelCBF-likegenesdesignatedasCcCBFaandCcCBFbweresuccessfullyisolatedfromCinnamomum camphora,andthefulllengthcDNAsequenceswere909and941bp,respectively.Theiropenreadingframes(ORF)were714and729bp,respectively,encoding237and242aminoacids.Therewasnointroninthecodingregionsofthetwogenes.Byanarrayofbioinformaticsanalysis,twogeneswereclassifiedintotheCBF/DREB1subfamily,andtheirfull-lengthcDNAsequencesweresubmittedtotheNCBIwithaccessionnumbersofKJ958932andKJ958933.ByqPCR, CcCBFaandCcCBFbcouldbedramaticallyinducedbylowtemperature,droughtandsalinity,aswellasABA,andtheexpressionlevelofthetwogeneshadspecificexpressiondifferencesindifferentorgansofC. camphora.Therefore, CcCBFaandCcCBFbwereinvolvedinresponsetocold,drought,salinity,andABA-responsivesignalingpathway.

KeywordsCinnamomum camphora； CcCBF； Abiotic stress； RACE； Gene expression

1)國家自然科學(xué)基金項目(31100511)。

責(zé)任編輯：潘華。