肝細(xì)胞癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員的表達(dá)觀察

陳清梅，陳睿，鄧陽

(1 山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033；2 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所；3 泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院)

原發(fā)性肝癌居我國常見惡性腫瘤的第4位和腫瘤死亡原因的第2位，2015年我國肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別約為46.6萬和42.2萬[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要組織類型，占70%～85%，而我國85%以上的HCC主要由HBV慢性感染所致[2]。HBV慢性感染導(dǎo)致慢性活動性炎癥，促使炎癥因子激活載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3，APOBEC3s)類胞苷脫氨酶。APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族有7位成員，包括APOBEC3A(簡寫為A3A，下同)、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G和A3H。APOBEC3s類胞苷脫氨酶具有脫氨基活性，機(jī)體感染HBV后，APOBEC3s類胞苷脫氨酶通過誘導(dǎo)大量胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶啟動不同的抗病毒機(jī)制，包括抑制HBV表面蛋白編碼區(qū)啟動子表達(dá)、降解前基因組RNA以及阻礙病毒基因組核衣殼化等多個步驟，可有效抑制HBV復(fù)制[3]。但是，APOBEC3s類胞苷脫氨酶的編輯作用也促進(jìn)了病毒和宿主基因組變異，造成HBV基因變異/缺失頻率增加，尤其是HBV-C基因型的X基因(HBx)變異，促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。本研究觀察了HCC患者癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA及蛋白的表達(dá)情況，分析APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008～2014年在泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受根治性肝切除術(shù)的HBV感染HCC患者155例，男121例、女34例，年齡(55.14±11.62)歲。手術(shù)中留取患者癌組織和癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm)，癌組織經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實為HCC，且切緣未見癌細(xì)胞。所有患者在術(shù)前未接受化療、放療等其他治療。本研究獲得患者或患者家屬知情同意，并經(jīng)過泰山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意和批準(zhǔn)。

1.2 受檢組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA的檢測 TRIzol試劑抽提癌組織和癌旁組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參，SYBR Green I法進(jìn)行實時定量PCR檢測。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，40個循環(huán)(95 ℃變性15 s、按各基因退火溫度退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct表示受檢組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶家族成員mRNA的相對表達(dá)量。A3A正、反向引物分別為5′-ATAGAATTCATGGAAGCCAGCCCAGC-3′和5′-ATATCTCGAGTCAGTTCCCTGATTCT-3′，A3B正、反向引物分別為5′-CGCCAGACCTACTTGTGCTAT-3′和5′-CATTTGCAGCGCCTCCTTAT-3′，A3C正、反向引物分別為5′-TCCTAACACAAAGTACCAGGTC-3′和5′-GATACTGGAAGTAGTAGAGGCG-3′，A3D正、反向引物分別為5′-ACGTCAGTCGAATCACAGGCAG-3′和5′-CTGGTCTCCTGGCTGTCAGTTG-3′，A3F正、反向引物分別為5′-CACGCTAAAGGAGATTCTCAGA-3′和5′-CATAGGCTTTGCGTAGGTTTTT-3′，A3G正、反向引物分別為5′-ATTCTCAGACACTCGATGGATC-3′和5′-CCACCTCATAACACAGGTAAGT-3′，A3H正、反向引物分別為5′-GGGGCAAGTCTGCTAAGGAA-3′和5′-CGGCGCTTGTTGTTAAACTG-3′，GAPDH基因正、反向引物分別為5′-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′和5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′。以癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA相對表達(dá)量的中位數(shù)為界，將155例HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族各成員mRNA相對表達(dá)量與HCC預(yù)后的關(guān)系。

1.3 受檢組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員蛋白的檢測 受檢組織石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片、脫蠟、水化，3% H2O2溶液室溫孵育10 min，微波15 min修復(fù)抗原。加入鼠抗人APOBEC3s單克隆抗體(Abnova公司)，調(diào)整濃度至10 μg/mL，37 ℃孵育過夜。加入生物素標(biāo)記的二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個高倍鏡(×400)視野計算陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率。陽性細(xì)胞百分率低于25%計0分，26%～50%計1分，51%～75%計2分，75%以上計3分。根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度評分：無顯色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。上述兩者得分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)，陽性表達(dá)率=(+～+++)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者癌組織和癌旁組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA相對表達(dá)量比較 HCC患者癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H mRNA相對表達(dá)量分別為4.08±0.11、6.61±0.17、6.42±0.10、5.29±0.12、6.64±0.12、7.49±0.07、4.32±0.08，HCC患者癌旁組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H mRNA相對表達(dá)量分別為2.93±0.11、4.60±0.11、5.48±0.11、5.22±0.08、6.97±0.08、5.91±0.12、4.21±0.10，癌組織與癌旁組織中A3A、A3B、A3C、A3G mRNA相對表達(dá)量相比，P均<0.05。

2.2 HCC患者癌組織和癌旁組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員蛋白陽性表達(dá)率比較 HCC患者癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白陽性表達(dá)率分別為92.3%、96.8%、89.0%、58.1%、69.7%、85.9%、52.9%，HCC患者癌旁組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白陽性表達(dá)率分別為61.3%、63.2%、57.4%、61.9%、74.8%、47.7%、47.7%，癌組織與癌旁組織中A3A、A3B、A3C、A3G蛋白陽性表達(dá)率相比，P均<0.05。

2.3 HCC患者癌組織中APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員mRNA相對表達(dá)量與HCC患者預(yù)后的關(guān)系 155例HCC患者通過門診復(fù)查和電話訪問進(jìn)行術(shù)后隨訪，以患者出院日期作為觀察起點(diǎn)，以因HCC死亡日期作為觀察終點(diǎn)，隨訪結(jié)束時間為2017年12月31日。隨訪內(nèi)容為患者生存狀況、復(fù)發(fā)狀況以及肝功能檢查。155例HCC患者中，A3A mRNA低表達(dá)者103例、高表達(dá)者52例，其5年生存率分別為27.3%、17.7%，兩者相比，P<0.05；A3B mRNA低表達(dá)者108例、高表達(dá)者47例，其5 年生存率分別為30.0%、17.1%，兩者相比，P<0.05；A3C mRNA低表達(dá)者64例、高表達(dá)者91例，其5 年生存率分別為31.5%、32.4%，兩者相比，P>0.05；A3G mRNA低表達(dá)者58例、高表達(dá)者97例，其5 年生存率分別為33.6%、13.7%，兩者相比，P<0.05。

3 討論

APOBEC3s類胞苷脫氨酶在正常肝組織中只有微量表達(dá)，但在HBV感染后，其表達(dá)水平顯著升高[4]。文獻(xiàn)[5]報道，APOBEC3s類胞苷脫氨酶的核酸編輯作用是目前已知分布最廣的促癌基因組變異機(jī)制。HBV變異和體細(xì)胞變異是HCC發(fā)生的標(biāo)志性分子事件，而炎癥通過誘導(dǎo)APOBEC3s類胞苷脫氨酶表達(dá)，促進(jìn)病毒和宿主基因組變異，因此可認(rèn)為APOBEC3s類胞苷脫氨酶是HBV促進(jìn)HCC發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子[3, 6]。APOBEC3s類胞苷脫氨酶在清除HBV的同時，其基因家族成員如A3B、A3C可顯著促進(jìn)HBV病毒變異，特別是羧基端截短型HBx(Carboxyl-Terminal Truncated HBx，Ct-HBx)變異可更加顯著地促進(jìn)HCC發(fā)生[7]。APOBEC3s類胞苷脫氨酶誘導(dǎo)人基因組發(fā)生特征性變異(在TCA或TCT序列中用T或G替代C)是癌癥中的常見現(xiàn)象。APOBEC3s類胞苷脫氨酶的脫氨基作用通常以單鏈DNA為底物，但Mussil等[8]發(fā)現(xiàn)A3A可在細(xì)胞核內(nèi)造成以胞苷高度突變和DNA雙鏈斷裂為主要形式的DNA損傷。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，A3A、A3B、A3C、A3G mRNA和蛋白表達(dá)水平在HCC癌組織中顯著上調(diào)，提示APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族部分成員的異常表達(dá)可能是乙肝惡性轉(zhuǎn)化的原因之一，屬于HCC發(fā)生過程中的重要事件。

APOBEC3s類胞苷脫氨酶過表達(dá)可通過脫氨酶依賴性方式激活損傷反應(yīng)從而誘導(dǎo)DNA斷裂和致癌蛋白突變體產(chǎn)生。APOBEC3s類胞苷脫氨酶編輯的單堿基替換變異的數(shù)量與癌組織和癌細(xì)胞中A3A和A3B mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，可見A3A和A3B是APOBEC3s類胞苷脫氨酶家族中負(fù)責(zé)編輯APOBECs特征性變異的主要成員[9]。研究[10]顯示，乳腺癌組織中A3A和A3B表達(dá)水平顯著高于正常組織，且與乳腺癌中胞嘧啶突變的程度相關(guān)。A3B可直接提高細(xì)胞集落形成能力并促進(jìn)肝細(xì)胞生長，HCC癌組織中A3B上調(diào)熱激轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor-1，HSF-1)表達(dá)，而HSF-1是一種由熱休克蛋白誘導(dǎo)的反式激活因子，可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[7]。A3G是APOBEC3s類胞苷脫氨酶中較為活躍的脫氨酶，對體內(nèi)的HBV DNA復(fù)制和編輯具有較強(qiáng)的抑制作用[3,11]。A3G在人體組織中廣泛表達(dá)，其中肝臟組織A3G mRNA含量最高[12]。研究[13]表明，A3G能夠促進(jìn)原位結(jié)直腸癌小鼠模型發(fā)生肝轉(zhuǎn)移在癌組織中如結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本中A3G蛋白高表達(dá)。另外，原發(fā)高級別漿液性卵巢癌組織中A3G表達(dá)和T細(xì)胞浸潤正相關(guān)[14]。與A3G相比，A3C抑制HBV復(fù)制的作用較弱，但在HepG2和Huh7細(xì)胞系中A3C可誘發(fā)高頻率的HBV DNA突變，表明A3C最有可能在肝細(xì)胞中產(chǎn)生數(shù)量最顯著的HBV突變，進(jìn)而促進(jìn)HCC發(fā)生[15]。

前期研究[16～18]發(fā)現(xiàn)APOBEC3s類胞苷脫氨酶表達(dá)異常與多種癌癥包括乳腺癌、腎癌、肝細(xì)胞癌等預(yù)后不良相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析A3A、A3B、A3C和A3G mRNA表達(dá)對患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)A3A、A3B和A3G mRNA高表達(dá)者5年生存率較低表達(dá)者低，預(yù)后差。Yang等[18]發(fā)現(xiàn)A3G與HCC患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)，這與本研究一致，可能與癌組織中A3G異常升高導(dǎo)致脈管浸潤、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和甲胎蛋白上升有關(guān)。

綜上所述，APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族成員A3A、A3B、A3C、A3G mRNA和蛋白表達(dá)水平在HCC癌組織中顯著上調(diào)，且A3A、A3B、A3G mRNA高表達(dá)的HCC患者術(shù)后生存率低。APOBEC3s類胞苷脫氨酶基因家族部分成員異常表達(dá)可能與HCC發(fā)生密切相關(guān)，觀察HCC患者癌組織中A3A、A3B、A3G mRNA的表達(dá)水平，可為預(yù)測和評估HCC術(shù)后發(fā)展及轉(zhuǎn)歸提供參考。