黑木耳菌株活力檢測及優(yōu)良菌株篩選

摘 " "要：菌種質(zhì)量優(yōu)劣直接影響產(chǎn)量甚至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景，篩選出可用于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)良菌株極其重要。通過篩選菌絲生長特性、酶活性、活性物質(zhì)成分、營養(yǎng)物質(zhì)，以及拮抗反應(yīng)和ITS分子鑒定等幾個方面，比較菌株間的差異。拮抗和分子鑒定結(jié)果表明，10個菌株間的相似性較高，篩選出H29菌株的菌絲生長速度、發(fā)酵生物量及胞內(nèi)外多糖含量、胞內(nèi)外三萜含量均較高，為優(yōu)勢菌株。相關(guān)性分析結(jié)果表明，菌絲生長速度、胞內(nèi)多糖含量和漆酶酶活與發(fā)酵生物量呈顯著正相關(guān)，并通過多元線性回歸分析，建立了一套遞進關(guān)鍵指標(biāo)的快速評價菌株優(yōu)劣的體系，其中菌絲生長速度對發(fā)酵生物量的影響最大。研究結(jié)果為優(yōu)質(zhì)黑木耳菌株的快速篩選及在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黑木耳；活力檢測；優(yōu)良菌株；活性成分

中圖分類號：S646.6 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-066-09

Strain activities evaluation and excellent strain screening of Auricularia heimuer

MAO Mingjuan1， HONG Peng1， LIU Di1， LU Yuantian1， HOU Lijuan1，2

（1. Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002， Jilin， China; 2. Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement/Institute of Vegetable， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， Jiangsu， China）

Abstract： The quality of the strains directly affects the yield and even the development prospects of their industry， and it is imperative to select good strains that can be used for large-scale production. Differences between strains were compared by screening several aspects such as mycelial growth characteristics， enzyme activity， active compound composition， nutrients， antagonism and ITS molecular identification. The antagonistic and molecular identification results showed high similarity among the 10 strains， and strain H29 was screened as the dominant strain with higher mycelial growth rate， fermentation biomass， and intra- and extracellular polysaccharide and intra- and extracellular triterpene content. The results of correlation analysis showed that mycelial growth rate， intracellular polysaccharide content and laccase enzyme activity were significantly and positively correlated with fermentation biomass， and a set of recursive key indices for rapid evaluation of strain superiority and inferiority was established by multivariate linear regression analysis， in which mycelial growth rate had the greatest influence on fermentation biomass. The results of the study provided the basis for the rapid screening of high-quality Auricularia heimuer strains and the promotion of their use in production.

Key words： Auricularia heimuer; Vitality testing; Dominant strains; Active ingredient

黑木耳（Auricularia heimuer）又名云耳[1]，隸屬擔(dān)子菌綱木耳目木耳科木耳屬，是一類大型藥食膠質(zhì)真菌[2-5]。黑木耳的栽培在中國有上千年之久，因其營養(yǎng)價值較高，素有“黑色瑰寶”之稱，常作為膳食纖維補充食物或入藥[5-6]。黑木耳富含多糖、黃酮、多酚和三萜等生物活性成分[7]，其中多糖含量最高[8]。同時，黑木耳富含的活性成分也具有抗腫瘤[9]、降低膽固醇[10-11]、抗凝血[12]、降血糖[13]，抗炎[14]等多種藥用功效。

我國是世界上黑木耳產(chǎn)量最多和食用最多的國家，有較大的市場需求[12]。近年來，食用菌產(chǎn)業(yè)面臨諸多難題，其中菌種質(zhì)量問題仍是目前限制食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大阻礙[15]，菌種的優(yōu)劣直接影響食用菌的產(chǎn)量，因此建立優(yōu)良菌種的篩選方法具有重要意義，通過生理生化指標(biāo)來評價菌種是較為簡單可行且直觀的方法之一[16]。筆者旨在建立一種快速篩選黑木耳菌株優(yōu)劣的體系，從菌株生長特性、酶活性、活性物質(zhì)成分、營養(yǎng)成分等4類生理生化指標(biāo)方面，對不同的黑木耳菌株進行綜合篩選，并進一步通過相關(guān)性分析和回歸分析，篩選并建立關(guān)鍵指標(biāo)作為黑木耳菌株優(yōu)劣的評價標(biāo)準(zhǔn)。試驗表明，對應(yīng)回歸系數(shù)越高的指標(biāo)對生物量影響越大[17]，從而優(yōu)先確定篩選黑木耳優(yōu)良菌株的方法。

1 材料與方法

1.1 試供菌株

黑木耳菌株（HS、HS1、HS2、HS3、H29、HB、HJ、GWJ、TH、XQHS），均來自延邊大學(xué)食（藥）用真菌研究所。試驗于2023年3－9月在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食藥用菌實驗室進行。

1.2 培養(yǎng)基

CPDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L。CPDA液體培養(yǎng)基：不加瓊脂的CPDA綜合培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基（POD）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，愈創(chuàng)木酚0.4 g，加水定容至1 L。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na）：CMC-Na 5 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 1 g，瓊脂15 g，水1 L。

1.3 菌絲生長特性測定方法

1.3.1 " "拮抗試驗 " "平板菌絲打孔后接種于CPDA培養(yǎng)基中，1個平板內(nèi)平均分布3個菌株，菌株間相距1～2 cm，培養(yǎng)條件為28 ℃、避光、15～20 d，其間觀察不同菌株菌絲接觸部分是否有拮抗線并記錄。

1.3.2 " "菌絲生長速度 " "取培養(yǎng)好的適齡菌塊，接種于CPDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，采用十字劃線法測量平板菌落的半徑，菌絲生長速度/（mm·d-1）=菌落半徑/培養(yǎng)總時間[17]。

1.3.3 " "菌絲發(fā)酵生物量 " "將培養(yǎng)好的平板菌絲打孔后接于搖瓶內(nèi)，置于恒溫搖床中，培養(yǎng)條件為：28 ℃、150 r·min-1、7 d，離心后取沉淀，用蒸餾水沖洗兩次后烘干稱質(zhì)量即為菌絲發(fā)酵生物量[18]。

1.4 酶活性測定

1.4.1 " "漆酶相對活性測定 " "將不同菌株的菌塊接種到POD固體培養(yǎng)基上，出現(xiàn)紅棕色圈記為“+”，無變色圈記為“-”[16]，并測定變色圈直徑，進而測定漆酶相對活性[19-20]，此方法僅為定性檢驗酶活性，與測定酶活性單位不同，漆酶相對活性/（mm·d-1）=變色圈半徑/培養(yǎng)天數(shù)。

1.4.2 " "羧甲基纖維素酶相對活性測定 " "將不同菌株分別接種于CMC‐Na平板培養(yǎng)基上，28 ℃、10 d恒溫培養(yǎng)，結(jié)束后用剛果紅（1 mg·mL-1）處理 15 min，倒去染液后用NaCl（1 mg·L-1）漂洗相同時間后倒去漂洗液，測量透明圈半徑，羧甲基纖維素酶相對活性/（mm·d-1）=透明圈半徑/培養(yǎng)天數(shù)[21]。

1.5 生物活性成分測定

采取熱水浸提法提取粗多糖[22]后，采取苯酚-硫酸法測定多糖含量[23]；采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定菌株黃酮含量[24]；采用 Folin-Ciocalten 法測定菌株多酚含量[25-26]；采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測定菌株三萜含量[27-28]。

1.6 營養(yǎng)成分測定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量[29]；采用考馬斯亮藍 G-250法測定蛋白質(zhì)含量[30]。

1.7 ITS鑒定與分析

利用新型植物DNA提取試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）提取10株黑木耳菌株基因組DNA，并利用ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3'）進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，利用DNAman10.0軟件對ITS序列進行相似性比較[31]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與處理，利用Excel 2016軟件作圖，利用DNAman10.0軟件對序列進行相似性分析，所有數(shù)值均采用平均值表示，設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長特性測定

2.1.1 " "拮抗試驗 " "對10個黑木耳菌株進行拮抗試驗，結(jié)果如表1所示，HS與GWJ菌株未產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象，與其他菌株均產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象；HS1只與HS2、HS3菌株沒有拮抗現(xiàn)象；HS2與HS1、HS3菌株不產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象；H29與HB、HJ、TH菌株均無拮抗現(xiàn)象；HB與HJ、TH菌株無拮抗現(xiàn)象，HJ與TH菌株之間無拮抗現(xiàn)象；XQHS與其他菌株均有拮抗現(xiàn)象。以上結(jié)果初步表明，10個菌株間的生長存在相互抑制作用。

2.1.2 " "菌絲生長速度測定 " "由圖1可知，10個黑木耳菌株的菌絲生長速度存在差異，H29的菌絲日均生長速度最大，為3.42 mm·d-1，與HB、TH、XQHS菌株差異不顯著，但顯著高于其他菌株；HS3菌絲生長速度最慢，為1.81 mm·d-1，顯著低于其他菌株，初步判斷該菌株菌絲活力最弱。

2.1.3 " "發(fā)酵生物量測定 " "由圖2可知，各菌株發(fā)酵生物量差異較大，菌株H29的發(fā)酵生物量最高，為1.06 g·100 mL-1，菌株HB次之，但顯著低于菌株H29；菌株HJ發(fā)酵生物量最低，為0.31 g·100 mL-1，顯著低于其他菌株，菌絲活性較低。

2.2 相對酶活性測定

羧甲基纖維素酶和漆酶都具有代表性，可反映黑木耳菌絲的生長狀況和產(chǎn)量，漆酶主要參與木質(zhì)素的降解[29]，體現(xiàn)菌絲分解基質(zhì)的能力。由圖3可知，平板上菌絲形成大小不同的菌圈即表示相對應(yīng)的酶活性高低，菌圈越大表示酶活性越高。由圖4可知，10個菌株中GWJ菌株羧甲基纖維素平板中菌絲生長速度最快，故該酶相對酶活性最高；HS次之，且二者無顯著差異；TH菌株最低。在漆酶平板中，菌絲生長速度最高的為H29菌株，故該菌株漆酶相對酶活性最高，顯著高于其他菌株，HJ菌株漆酶的相對活性最低。

2.3 生物活性成分測定

2.3.1 " "胞內(nèi)活性物質(zhì)含量測定 " "由圖5可知，黑木耳菌株發(fā)酵后4種胞內(nèi)活性物質(zhì)含量各不相同且差異明顯，各菌株胞內(nèi)多糖含量明顯高于其他活性物質(zhì)含量，可能由于搖瓶發(fā)酵存在其他因素。菌株H29的胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)三萜含量（w，后同）均最高，分別為46.46、7.90 mg·g-1，顯著高于其他菌株；HJ菌株的多糖含量為22.50 mg·g-1，顯著低于其他菌株；胞內(nèi)三萜含量最低為HS1菌株，顯著低于其他菌株。菌株TH的胞內(nèi)多酚含量最高，為5.87 mg·g-1，顯著高于其他菌株；HS菌株的胞內(nèi)多酚含量最低，為1.69 mg·g-1，顯著低于除HS3外的其他菌株。XQHS菌株的胞內(nèi)黃酮含量最高，為15.93 mg·g-1，顯著高于其他菌株；HJ菌株的胞內(nèi)黃酮含量最低，為7.24 mg·g-1，顯著低于其他菌株。

2.3.2 " "胞外活性物質(zhì)含量測定 " "由圖6可知，黑木耳10個菌株胞外活性物質(zhì)含量中，除XQHS菌株外，其他菌株的胞外黃酮含量高于其他物質(zhì)含量。H29菌株的胞外黃酮含量最高，為0.73 mg·mL-1，顯著高于其他菌株，TH菌株次之，XQHS菌株含量最低，顯著低于其他菌株。胞外多糖含量最高的是H29菌株，為0.42 mg·mL-1；其次為XQHS菌株，二者無顯著差異，但均顯著高于其他菌株；HS1菌株的胞外多糖含量最低，為0.22 mg·mL-1，顯著低于其他菌株。H29菌株的胞外多酚和胞外三萜含量均最高，分別為0.14、0.03 mg·mL-1，且均顯著高于其他菌株。由此可知，各菌株的胞外活性物質(zhì)含量各有差異，可根據(jù)生產(chǎn)需求選擇不同的菌株。

2.4 營養(yǎng)成分測定

由圖7可知，10個黑木耳菌株之間的還原糖含量均存在顯著差異。HJ菌株的還原糖含量（ρ，后同）最高，為1.92 mg·mL-1；其次是TH菌株，為1.67 mg·mL-1，二者差異顯著，且均顯著高于其他菌株；HS1菌株的還原糖含量最低，為0.83 mg·mL-1，顯著低于其他菌株，且該菌株的胞內(nèi)多糖含量也較低，可見HS1菌株與其他菌株相比發(fā)酵產(chǎn)生的多糖較少。XQHS菌株的蛋白質(zhì)含量最高，為0.13 mg·mL-1，顯著高于其他菌株?；谇懊娴姆治隹芍?，HJ菌株的漆酶相對活性、胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)黃酮含量均最低，而還原糖含量最高，可能是發(fā)酵過程所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同所致。

2.5 10個黑木耳菌株部分指標(biāo)的相關(guān)性分析

對10個菌株所測定的部分指標(biāo)進行相關(guān)性分析，由表2可知，發(fā)酵生物量與菌絲生長速度、漆酶相對活性及胞內(nèi)多糖含量均呈顯著正相關(guān)，與胞內(nèi)多酚含量呈正相關(guān)，與其余指標(biāo)均呈一定負相關(guān)。說明在一定條件下，菌株的菌絲生長速度和漆酶相對活性越高的菌株，其發(fā)酵生物量也越高。漆酶相對活性與胞內(nèi)多糖含量呈顯著正相關(guān)，但與還原糖含量呈顯著負相關(guān)，與羧甲基纖維素酶相對活性和胞內(nèi)多酚含量呈負相關(guān)，但無顯著性，與其余指標(biāo)呈一定正相關(guān)性，推測漆酶相對活性與發(fā)酵過程中糖的積累有關(guān)。此外，菌絲生長速度與胞內(nèi)黃酮和蛋白質(zhì)含量及羧甲基纖維素酶相對活性均呈負相關(guān)，與其余指標(biāo)呈一定正相關(guān)。

為了進一步了解10株黑木耳的發(fā)酵生物量與漆酶相對活性、胞內(nèi)多糖含量、菌絲生長速度三者之間的關(guān)系，利用多元線性回歸分析的方法解釋三者對發(fā)酵生物量的影響力。以發(fā)酵生物量作為因變量，其余三個指標(biāo)為自變量，建立多元線性數(shù)學(xué)模型，線性公式如（1）所示。

BYield = A0 + A1BPDA + A2BIPS + A3BLAC； " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（1）

其中：BYield是黑木耳生物量（g），BPDA為平板菌絲生長速度（mm·d-1），BIPS是胞內(nèi)多糖含量活性（mg·g-1），BLAC是漆酶相對活性（mm·d-1）。

由表3可知，菌絲生長速度對發(fā)酵生物量貢獻最大，其次是漆酶相對活性，這些變量具有統(tǒng)計學(xué)意義，得到的數(shù)學(xué)模型如（2）所示。

BYield=0.228BPDA+0.019BIPS +0.083BLAC - 0.974。 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "（2）

根據(jù)表2相關(guān)性分析及表3多元線性回歸分析的結(jié)果，建立起黑木耳優(yōu)良菌株的快速篩選方法：首先比較10株黑木耳的菌絲生長速度，篩選出菌絲生長快且生長狀況較優(yōu)的菌株；進而比較漆酶相對活性，篩選出活性較高的菌株；最后比較胞內(nèi)多糖含量，綜合篩選出產(chǎn)量高、菌株活力強的黑木耳優(yōu)良菌株。

2.6 ITS序列相似性分析

對10株黑木耳的序列進行相似性分析（圖8），可知其ITS序列長度均為580 bp，相似性為72%，其中GWJ、HJ、XQHS和TH菌株的ITS序列相似性高達98%，但拮抗反應(yīng)表明，HJ、XQHS、GWJ為不同菌株；而HJ與TH菌株無拮抗現(xiàn)象，說明二者極有可能為同種菌株；HS和HS2菌株的ITS序列相似性為97%，同時兩菌株間存在拮抗現(xiàn)象，說明二者為不同菌株。

3 討論與結(jié)論

隨著黑木耳消費需求日益增多，產(chǎn)業(yè)也在迅速發(fā)展，菌種優(yōu)劣直接影響其生產(chǎn)性能，在栽培中的影響深遠，因此，篩選優(yōu)良的黑木耳菌株極其重要[32]。通常食用菌采用出菇試驗來評價某一菌種的優(yōu)劣，但是由于出菇試驗受出菇溫度、濕度、二氧化碳濃度和種植密度等許多因素影響，可能導(dǎo)致評價結(jié)果可信度不高，同時出菇試驗還存在周期長、成本高等缺點，因此迫切需要一種高效而簡潔的菌種評價方法。張先吉等[33]對5株靈芝液體菌種進行活力評價，得出菌絲體數(shù)量與吃料速度呈顯著正相關(guān)。王天嬌等[34]通過對靈芝菌絲的生長速率、相關(guān)酶活性測定，建立了一種篩選出靈芝優(yōu)良菌種的方法，該結(jié)果與本文所篩選出的菌絲生長速度、漆酶相對活性兩個指標(biāo)結(jié)果一致，而羧甲基纖維素酶活性不一致，可能是不同菌種之間存在差異所致。Xiong等[35]通過基因編輯的方法提高蛹蟲草的GPX活性，增強清除ROS的能力，可使已經(jīng)退化的蛹蟲草恢復(fù)活力，提高子實體的結(jié)實能力。曲德輝等[17]對7個桑黃菌株進行了菌株間活力評價，建立了快速篩選高產(chǎn)的方法，與本文試驗結(jié)果基本一致。

對10株黑木耳相關(guān)指標(biāo)進行相關(guān)性分析，發(fā)酵生物量與菌絲生長速度、胞內(nèi)多糖含量和漆酶相對活性呈顯著正相關(guān)，且通過多元線性回歸分析，明確三者是影響發(fā)酵生物量的關(guān)鍵指標(biāo)，從而篩選出較優(yōu)菌株。筆者建立了一套遞進關(guān)鍵指標(biāo)的快速評價菌株優(yōu)劣體系，為其他食用菌優(yōu)良菌株的篩選提供了參考。黑木耳含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)以及多酚、黃酮等活性成分，目前，對黑木耳多糖的研究較多，而對萜類、黃酮類化合物方面的研究較少[36]，而胞外酶活性也影響菌株的生長情況，同樣可作為活力評價的重要指標(biāo)[37]。

拮抗試驗表明，部分黑木耳菌株間不存在拮抗現(xiàn)象，僅僅通過拮抗試驗和ITS序列分析很難對同物異名的菌種進行有效鑒別。在后續(xù)試驗中，首先，可采取Rbp2和LSU鑒定，綜合三種鑒定結(jié)果，明確不同菌株的種屬，并區(qū)分亞種；其次，進行出菇試驗，通過子實體表型分析和鑒定，區(qū)分和篩選較優(yōu)菌株，從而完善篩選體系，為充分研究黑木耳食用和藥用價值奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，10株黑木耳菌株的菌絲生長速度和羧甲基纖維素酶、漆酶相對活性及發(fā)酵生物量、生物活性成分、蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)間存在差異，其中H29菌株的菌絲生長速度、發(fā)酵生物量、漆酶相對活性及胞內(nèi)外多糖、胞內(nèi)外三萜、胞外多酚和胞外黃酮含量均最高，綜合評價為優(yōu)勢菌株；HS1菌株綜合指標(biāo)較低，為弱勢菌株。相關(guān)性分析結(jié)果表明，發(fā)酵生物量與菌絲生長速度、胞內(nèi)多糖含量和漆酶相對活性呈顯著正相關(guān)，且通過多元線性回歸分析，建立了一套遞進關(guān)鍵指標(biāo)的快速評價菌株優(yōu)劣的體系。

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