高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定植物藥酒中9種有毒生物堿

摘 要：本文建立植物藥酒中9種有毒生物堿的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取條件、儀器條件等參數(shù)，樣品超聲提取、離心后過濾。采用Waters BEH色譜柱分離，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，在各自范圍內(nèi)9種生物堿具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，方法的定量限為2.5～25 μg/L，總體平均回收率＞80%，總體相對偏差＜10%（n =6）。該方法對植物藥酒中9種有毒生物堿快速、準(zhǔn)確的測定十分有效。

關(guān)鍵詞：植物藥酒，有毒生物堿，HPLC-MS/MS

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-59442025.04.035

0 引 言

我國中草藥資源豐富，使用藥酒養(yǎng)生治病也有著數(shù)千年的歷史[1-2]。民間流傳許多藥酒偏方，很多人存在“中藥安全可以隨便吃”的錯(cuò)誤觀念，因此自制藥酒的現(xiàn)象比較普遍。飲用自制藥酒而導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生，經(jīng)案例分析可知，此類事件多為誤服植物藥酒中的生物堿所致[3-4]。

生物堿是許多中草藥的有效成分，其具有抗癌、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、降血壓等生理藥理活性[5]，但部分生物堿毒性大。在中藥不良反應(yīng)事件中，由生物堿導(dǎo)致中毒的事件所占比重很大，如毛莨科的烏頭含有烏頭堿，衛(wèi)矛科的雷公藤含有雷公藤甲素等。以烏頭類生物堿為例，口服0.2 mg 就可使人中毒，3～5 mg 即可致死，致死劑量與中毒劑量接近[6]。因此，民間使用含生物堿的藥草自行浸泡藥酒，有著極大的安全隱患。

目前，生物堿的測定方法主要有高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[9-11]，這些方法大多只測定某一種（如烏頭堿）或某一類中幾種生物堿（如莨菪烷類生物堿，莨菪堿、東莨菪堿等）。市場監(jiān)管總局近年來新發(fā)布了《食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法 BJS201711畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、普魯卡因和利多卡因的測定》《食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法 BJS202108蜂蜜中雷公藤甲素的測定》，說明國家對有毒生物堿非常重視。本研究在查閱文獻(xiàn)后選擇9種生物堿，這9種生物堿毒性較強(qiáng)，多具有祛濕、鎮(zhèn)痛、降血壓等功效且易為民間使用[3-4，9-10]。開發(fā)同時(shí)檢測9種生物堿的方法，既有效地應(yīng)對突發(fā)中毒事件中快速篩查引起中毒的物質(zhì)，又使民眾意識到自行浸泡藥酒的不安全性，規(guī)范植物浸泡藥酒領(lǐng)域，為人民群眾生命安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）儀器高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀129 0 -6470（美國Agilent公司）；minilab全自動(dòng)稀釋配標(biāo)儀（美國Labtech公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Vor tex-5渦旋儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；H-210 0 R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘潭湘儀儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（江蘇張家港三友超聲設(shè)備有限公司）；C18色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×10 0 mm，瑞典SVEA公司）；ACQUII Y UPLC BEH Shield R P18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；InfinitylabPoroshell 120 Ec-C18色譜柱（2.7 μm，2.1mm×100 mm，美國Agilent公司）。

（2）試劑烏頭堿對照品：含量≥97.9%（美國Chromadex）；鉤吻堿對照品：含量≥98%（加拿大TRC公司）；石蒜堿對照品：含量≥99.8%（美國IL公司）；鬼臼素酯對照品：含量≥99.6%（中檢所）；番木鱉堿對照品：含量≥99.2%（德國LGC公司）；雷公藤甲素對照品：含量≥98%（中檢院）；秋水仙堿對照品：含量≥95.4%（英國LGC公司）；東莨菪堿對照品：含量≥99.9%（英國LGC公司）；山莨菪堿對照品：含量≥98%（美國IL公司）；甲醇、乙醇色譜純（德國默克）、甲酸質(zhì)譜級（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）、甲酸銨、氟化銨色譜純（FLUKA）。

1.2 方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取適量的烏頭堿、鉤吻堿、石蒜堿、鬼臼素酯、番木鱉堿、雷公藤甲素、秋水仙堿、東莨菪堿、山莨菪堿10 mg置于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇溶液溶解并定容至刻度線，搖勻，得到質(zhì)量濃度為200mg/L的儲備液，-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用20%的乙醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2） 樣品制備 取樣前將樣品混勻。稱取藥酒2mL于離心管中，超聲，用水定容至10 mL，8000 r/min離心5 min，吸取1.0 mL上清液，過0.22 μm濾膜，濾液供HPLC-MS/MS測試。空白實(shí)驗(yàn)除不加試樣外，均按照上述操作步驟開展。

（3）色譜-質(zhì)譜條件

1）色譜條件Waters ACQUIIY UPLC BEH ShieldRP18色譜柱（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm）；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為4.5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液，B為4.5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫。

2 ）質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多反應(yīng)檢測模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：4 kV；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：6 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：11 L/min；9種有毒生物堿的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3 定量方法的確立

分別向空白基質(zhì)樣品中添加1、2、10倍定量限3個(gè)水平濃度的9種有毒生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)水平濃度設(shè)置6個(gè)平行樣品，按照前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定，外標(biāo)法定量，驗(yàn)證方法的回收率及計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)分析物外的其他組分對待測物質(zhì)的分析過程有顯著干擾、抑制或增強(qiáng)目標(biāo)分析物響應(yīng)的現(xiàn)象。采用相對響應(yīng)值法，定量測定空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液與體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液中相同質(zhì)量濃度待測物的響應(yīng)值，通過二者的相對比值來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)：

基質(zhì)效應(yīng) （%）=B/A×100%

其中，A為體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；B為空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

通過查閱文獻(xiàn)及實(shí)際應(yīng)用綜合考慮，遇到突發(fā)中毒事件時(shí)，須快速、準(zhǔn)確判斷中毒物質(zhì)，為臨床的診斷和對癥治療提供可靠依據(jù)。植物藥酒的成分為乙醇及少量草本浸出物，可經(jīng)過稀釋和過濾的方式處理樣液[12-13]。選取不同的溶液對樣品進(jìn)行稀釋，考察進(jìn)樣后的分離情況，對比后采取加水稀釋過膜進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此法能夠得到較好的色譜峰形及分離度。

2.2 質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

將9種有毒生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的單標(biāo)溶液，進(jìn)行質(zhì)譜測定參數(shù)優(yōu)化。通過對目標(biāo)物結(jié)構(gòu)式的分析，在正離子模式下更易得到一個(gè)H+形成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，因此實(shí)驗(yàn)選擇正離子模式。通過全掃描模式找到母離子，優(yōu)化碎裂電壓，得到子離子峰，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的離子作為定性、定量離子并優(yōu)化其碰撞能量。

2.3 色譜柱的選擇及分離條件的優(yōu)化

通過分析目標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)，選擇3種色譜柱：Thermo Hypercarb HT （2.1 mm×100 mm，3 μm）；Waters ACQUIIY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm）；Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），對目標(biāo)物的分離效果做了比較。結(jié)果表明，使用Ther mo色譜柱時(shí)，雷公藤甲素幾乎沒有基線分離，石蒜堿的峰型拖尾且響應(yīng)值偏低；使用Agilent色譜柱時(shí)，番木鱉堿的峰型拖尾，目標(biāo)物整體響應(yīng)值偏低；使用Waters色譜柱時(shí)，目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)基線分離，整體峰型良好，與其他色譜柱相比響應(yīng)值最高，因此選擇Waters色譜柱。

本研究分別考察了0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）混合溶液體系作為流動(dòng)相，對目標(biāo)物分離情況和離子化情況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)含甲醇混合溶液體系作為流動(dòng)相時(shí)，化合物的響應(yīng)值明顯較高，加入4.5 mmol/L甲酸銨后，化合物峰型明顯改善。因此，確定0.1%甲酸水溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）+ 0.1%甲酸甲醇溶液（含4.5 mmol/L甲酸銨）混合溶液體系作為流動(dòng)相。

2.4 方法的線性范圍和檢出限、定量限

用20%乙醇溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量子離子的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程，目標(biāo)物的相關(guān)系數(shù)R 2均高于0.99。采用加標(biāo)回收的方法確定方法的檢出限和定量限，分別以3、10倍信噪比為方法的檢出限和定量限。目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限見表3。

2.5 方法的回收率和精密度

采用空白樣品加標(biāo)的方法進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。在空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的標(biāo)樣后，然后按照方法進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平平行測定6次。同時(shí)配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在低、中、高3個(gè)添加水平的平均回收率介于85%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～9.0%。表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實(shí)際樣品的檢測要求。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)結(jié)果

9 種有毒生物堿質(zhì)量濃度為2 0 μg / L ，平行測定3次。結(jié)果顯示，除石蒜堿（43.4%）、鬼臼毒素（122.1%）基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，其余化合物的基質(zhì)效應(yīng)為89.1%～106.8%。

2.7 實(shí)際樣品的測定

使用本研究建立的方法，在天津市抽取自制藥酒30份進(jìn)行測定，目標(biāo)物均未檢出。抽檢區(qū)域分布數(shù)據(jù)表明，天津市區(qū)縣的認(rèn)可度高于市內(nèi)六區(qū)；抽檢樣品類別數(shù)據(jù)表明，天津市民眾飲用的藥酒多為滋補(bǔ)類，如人參、枸杞等，暫不涉及具有鎮(zhèn)痛、降血壓等功效的植物藥酒，因此檢出9種有毒生物堿的概率較低。

3 結(jié) 論

本研究建立的方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度高、污染小的特點(diǎn)。在遇到突發(fā)中毒事件時(shí)，該方法可快速檢測藥酒樣本、準(zhǔn)確判斷導(dǎo)致中毒的物質(zhì)，為臨床的診斷和對癥治療提供可靠檢測依據(jù)，同時(shí)也為相關(guān)監(jiān)測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支撐，有著較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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作者簡介

郭文麗，碩士，高級工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

翟雨佳，通信作者，碩士，高級工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

（責(zé)任編輯：張佩玉）