蘇云金芽孢桿菌對(duì)茶尺蠖腸道細(xì)菌多樣性的影響

摘要：茶尺蠖（Ectropis obliqua）是茶葉上的重要害蟲(chóng)，給茶葉產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）作為防治茶尺蠖的關(guān)鍵生物殺蟲(chóng)劑，在茶尺蠖的綠色防控中發(fā)揮重要作用。為明確Bt處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道菌群的影響，基于Illumina平臺(tái)，采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同水平Bt懸浮液處理的茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，使用低劑量Bt處理茶尺蠖幼蟲(chóng)后，其腸道細(xì)菌組成與對(duì)照處理相比并未發(fā)生明顯變化；但在較高劑量Bt處理下，茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的群落多樣性及豐度顯著增加，表明茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落參與了對(duì)Bt侵染的響應(yīng)。以上研究結(jié)果為深入探究Bt殺蟲(chóng)機(jī)制提供依據(jù)，并為提高Bt殺蟲(chóng)毒力提供新的思路。

關(guān)鍵詞：茶尺蠖；蘇云金芽孢桿菌；生物防治；腸道細(xì)菌；16S rDNAdoi：10.13304/j.nykjdb.2023.0794

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2025）02‐0141‐09

在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)與其腸道微生物形成了密不可分的互利共生關(guān)系[1]。寄主昆蟲(chóng)為微生物提供穩(wěn)定的生存環(huán)境和必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2‐3]，在影響微生物的群落結(jié)構(gòu)和代謝活動(dòng)的同時(shí)賦予腸道微生物種類多樣性和符合宿主特異性的特點(diǎn)[4‐5]。昆蟲(chóng)腸道微生物是調(diào)控宿主生物學(xué)性狀的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控宿主食物分解和營(yíng)養(yǎng)獲取、解毒、免疫防御功能，促進(jìn)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、生殖和發(fā)育[6-9]。研究表明，甘蔗害蟲(chóng)小蔗桿草螟（Diatraea saccharalis）腸道中的克雷伯氏桿菌具有降解甘蔗殘余廢物的作用，能夠協(xié)助宿主對(duì)甘蔗的取食和利用[10]；舞毒蛾（Lymantria dispar）腸道中的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌能夠降解山楊產(chǎn)生的酚苷類化合物，保護(hù)宿主在進(jìn)食后不受有毒物質(zhì)的影響[11]。腸道微生物群落在正常狀態(tài)下維持正常生長(zhǎng)模式，一旦腸道環(huán)境改變或受外源物質(zhì)的脅迫，腸道微生物為應(yīng)對(duì)環(huán)境變化會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致腸道微生物在種群密度、物種豐富度以及物種優(yōu)勢(shì)度等方面產(chǎn)生差異[12‐13]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）是一種自然界普遍存在的革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)鞘翅目、雙翅目、鱗翅目等500多種昆蟲(chóng)具有較好的殺蟲(chóng)活性，是目前世界范圍內(nèi)產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的生物殺蟲(chóng)劑之一[14]。Bt的殺蟲(chóng)作用是通過(guò)產(chǎn)生具有殺蟲(chóng)活性的伴孢晶體，這種晶體可與昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，造成中腸膜穿孔、細(xì)胞溶解，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡[15]。研究表明，在Bt毒蛋白Cry2Ab 蛋白的影響下，捕食性昆蟲(chóng)龜紋瓢蟲(chóng)（Propylaea japonica）體內(nèi)優(yōu)勢(shì)共生菌的基因拷貝數(shù)會(huì)發(fā)生明顯變化[16]。但是，Bt毒蛋白是否會(huì)影響害蟲(chóng)體內(nèi)腸道微生物的多樣性及其組成，目前尚不得知。

茶尺蠖（Ectropis obliqua）屬鱗翅目（Lepidoptera）尺蠖蛾科（Geometridae），是為害茶葉的毀滅性害蟲(chóng)[17]。茶尺蠖主要以幼蟲(chóng)大量取食茶樹(shù)葉片為害，嚴(yán)重時(shí)將茶園茶樹(shù)的葉片和嫩芽吃光，使茶樹(shù)僅留禿枝，致使樹(shù)勢(shì)衰弱、耐寒力差、易受凍害，嚴(yán)重制約了茶葉的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)，常年造成茶葉產(chǎn)量損失約15%[18]。目前化學(xué)農(nóng)藥仍是茶園防治尺蠖的重要手段，但其容易導(dǎo)致“3R”問(wèn)題，即抗性（resistance）、再增猖獗（resurgence）和殘留（residue），不利于茶園的可持續(xù)發(fā)展。利用病毒、真菌和細(xì)菌進(jìn)行生物防控是茶尺蠖綠色防控的關(guān)鍵[19-21]。Bt作為重要生物殺蟲(chóng)劑，在茶尺蠖的綠色防控中發(fā)揮了重要作用[22]，通常和茶尺蠖核型多角體病毒混用對(duì)茶尺蠖具有較好的防治效果。但茶尺蠖受到Bt刺激后其腸道微生物是如何進(jìn)行響應(yīng)的，目前仍不清楚。

為明確Bt處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道菌群的影響，本研究基于16S rDNA 序列的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同劑量Bt處理后的茶尺蠖腸道微生物多樣性進(jìn)行分析，為揭示昆蟲(chóng)腸道微生物對(duì)微生物殺蟲(chóng)劑的響應(yīng)模式、茶尺蠖生物防治新靶標(biāo)與新技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試蟲(chóng)飼養(yǎng)

蘇云金芽孢桿菌novonest4菌株為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心菌株資源庫(kù)保藏菌株，保藏編號(hào)為CCTCC NO： M2018443。供試茶尺蠖幼蟲(chóng)由武漢科諾生物科技股份有限公司提供，在人工氣候養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)使用茶樹(shù)嫩苗繼代飼養(yǎng)，選取3齡幼蟲(chóng)為供試蟲(chóng)源。飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度為85%±5%，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試蟲(chóng)處理及樣品采集

選取大小一致、生長(zhǎng)健康的茶尺蠖3齡幼蟲(chóng)，分別配制Bt 懸液（1×109 CFU·mL-1）及其50、100和200倍稀釋液。采用浸葉法[23]通過(guò)Bt懸液的50（Bt50）、100（Bt100）和200倍稀釋液（Bt200）浸泡茶樹(shù)嫩苗，以清水浸泡為對(duì)照（CK）；然后用浸泡后的茶樹(shù)嫩苗飼喂供試幼蟲(chóng)。

試蟲(chóng)處理24 h后收集茶尺蠖腸道組織，首先用75%乙醇對(duì)存活的茶尺蠖幼蟲(chóng)進(jìn)行表面消毒后；使用無(wú)菌水漂洗蟲(chóng)體3次；然后在無(wú)菌操作條件下將幼蟲(chóng)解剖并取出完整腸道；用無(wú)菌水緩慢清洗后取其腸道內(nèi)容物，放入已加入1 mL PBS緩沖液的離心管中。每管收集15頭幼蟲(chóng)的腸道組織，每處理3次重復(fù)。采集的茶尺蠖腸道樣品研磨均勻后冷凍保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 茶尺蠖腸道微生物DNA 提取與測(cè)序

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道微生物總DNA，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和含量后保存于-20 ℃待用。

以細(xì)菌基因組DNA 為模板，利用TransStartFastpfu DNA Polymerase （NEB， USA），使用帶Barcode的特異性引物擴(kuò)增16S rDNA基因V3～V4高變區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收；然后將回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量?jī)x器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合，采用Illumina 平臺(tái)TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用FLASH 軟件（v1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行截取和過(guò)濾，運(yùn)用QIIME 軟件（Quantitative InsightsInto Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）剔除5’端引物錯(cuò)配堿基數(shù)gt;1的序列、含有連續(xù)相同堿基數(shù)gt;8 的序列及嵌合體序列，即得到有效序列，用于后續(xù)分析。

使用QIIME 軟件，調(diào)用序列比對(duì)工具UCLUST，對(duì)獲得的有效序列按97% 的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU（operational taxonomic units）劃分，并選取每個(gè)OTU 中豐度最高的序列作為該OTU 的代表序列，OTU 豐度矩陣中需去除稀有OTU。以Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）為參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析。使用QIIME軟件分別對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，并用R軟件繪制稀釋曲線、Venn圖等，進(jìn)行各分類上的生物類群統(tǒng)計(jì)。通過(guò)LEfSe（lineardiscriminant analysis effect size）聚類分析對(duì)樣本在科和目水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同 Bt 處理下茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的OTU分析

由圖1可知，隨著各樣本測(cè)序數(shù)量增大，曲線由起初的急劇增長(zhǎng)逐步趨于平緩，表明所測(cè)序列能夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測(cè)序深度已無(wú)法檢測(cè)到大量新OTU。由此說(shuō)明，本次測(cè)序量充足，可充分反映所測(cè)茶尺蠖腸道細(xì)菌的物種廣度，可用于后續(xù)分析。

CK、Bt50、Bt100、Bt200處理茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的OTU 數(shù)量分別為153、200、137 和125，Bt50處理茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌的OTU數(shù)量高于CK和其他Bt處理，細(xì)菌的種類也較其他處理更加豐富（表1）。

由圖2可知，4個(gè)處理共有的OTU數(shù)量為31，而CK、Bt50、Bt100和Bt200處理特有的OTU數(shù)量分別為64、104、36和45。綜上表明，不同Bt處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌組成存在顯著影響。

2.2 不同Bt 處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落Alpha 多樣性的影響

Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Pielou_e 指數(shù)分別代表微生物群落的多樣性、豐富度和均勻度，使用QIIME軟件分析不同處理茶尺蠖腸道細(xì)菌群落的Alpha多樣性，結(jié)果如圖3所示。Bt50處理茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落的多樣性、豐富度和均勻度均最高。此外，Bt10和Bt200處理茶尺蠖腸道細(xì)菌群落的物種數(shù)量較CK 處理有所降低，而B(niǎo)t50處理的物種數(shù)量顯著增加。綜上表明，Bt對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落Alpha多樣性的影響因Bt劑量的不同而存在差異。

2.3 不同Bt 處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落Beta 多樣性的影響

無(wú)度量多維標(biāo)定法（non-metric multidimensionalscaling， NMDS， stresslt;0.2）統(tǒng)計(jì)是一種基于樣本距離矩陣的分析方法，通過(guò)降維處理展現(xiàn)樣本特定的距離分布，能夠有效反映不同樣本間細(xì)菌種類差異性，如圖4所示。不同Bt處理的數(shù)據(jù)散點(diǎn)獨(dú)立分開(kāi)，即不同處理間均存在顯著差異，說(shuō)明不同劑量Bt處理的茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落在種類組成上具有顯著差異。

2.4 不同Bt 處理對(duì)茶尺蠖腸道細(xì)菌種群組成和豐度的影響

不同Bt處理茶尺蠖腸道細(xì)菌群落在各分類水平上的物種組成如圖5所示。在門水平上，不同Bt處理茶尺蠖腸道的細(xì)菌群落組成與CK差異較小，優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）（圖5A）；但隨著B(niǎo)t劑量的增加，厚壁菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，而變形菌門的相對(duì)豐度表現(xiàn)為先降低后升高趨勢(shì)（圖5B）。在屬水平上，不同處理間腸道細(xì)菌群落的組成也沒(méi)有明顯差異，優(yōu)勢(shì)菌屬均為腸球菌屬（Enterococcus）和沃爾巴克氏菌屬（Wolbachia）（圖5C）；此外，腸球菌屬的豐度隨Bt劑量的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，而沃爾巴克氏菌屬的豐度表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)（圖5D）。

2.5 不同Bt 處理后茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道樣本組間物種差異顯著性分析

為尋找不同樣本間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物，采用LEfSe分析篩選出不同Bt處理茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道的特征微生物，結(jié)果如圖6所示。其中Bt50處理后茶尺蠖幼蟲(chóng)的腸道細(xì)菌類群與其他處理相比差異較大，有23個(gè)類群存在顯著差異，其中γ-變形菌綱（Gamma Proteobacter）最具鑒別性；在CK處理中，有16個(gè)類群存在顯著差異，主要集中在沃爾巴克氏菌屬（Wolbachia）、無(wú)形體科（Anaplasmataceae）、立克次氏體目（Rickettsiales）、α-變形菌綱（AlphaProteobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。

3 討論

昆蟲(chóng)體內(nèi)存在豐富的共生菌群落，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，腸道微生物與其宿主形成了共生關(guān)系，對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及免疫等生理功能具有重要作用。昆蟲(chóng)體內(nèi)的共生菌種群動(dòng)態(tài)受多種因素影響，如宿主生物型和地理種群、寄主植物種類、溫度等環(huán)境條件均能影響共生菌的感染[24]。本研究通過(guò)Illumina平臺(tái)采用16S rDNA高通量測(cè)序分析比較不同Bt處理下茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道共生菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明，高劑量Bt脅迫會(huì)顯著增加茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道共生菌的群落多樣性及豐度，暗示其腸道共生菌參與抵御蘇云金芽孢桿菌的侵染，能夠協(xié)同提高宿主對(duì)昆蟲(chóng)病原細(xì)菌的免疫作用。

本研究表明，4個(gè)處理下茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落中最主要優(yōu)勢(shì)菌屬均為腸球菌屬，而腸球菌屬也是擁有Bt蛋白抗性的棉鈴蟲(chóng)腸道共生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬[25]。腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界和昆蟲(chóng)腸道中廣泛分布，是多種鱗翅目昆蟲(chóng)如稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、菜青蟲(chóng)（Pieris rapae）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、舞毒蛾等腸道中的優(yōu)勢(shì)菌[26]。由于鱗翅目昆蟲(chóng)的腸道大多為堿性環(huán)境，腸球菌可通過(guò)乙酸鹽的生成來(lái)平衡腸道pH，從而降低外界毒素對(duì)昆蟲(chóng)的損害。研究表明，草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的食物從人工飼料轉(zhuǎn)換為寄主植物時(shí)，其通過(guò)調(diào)節(jié)腸球菌屬的相對(duì)豐度來(lái)降低食物變換帶來(lái)的不利影響[27]。大蠟螟（Galleria mellonella）幼蟲(chóng)中腸的腸球菌數(shù)量會(huì)隨著抗菌肽基因表達(dá)水平的升高而增加，從而提高宿主抗性[28]。此外，腸球菌屬能夠降低Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)舞毒蛾和煙草天蛾（Manducasexta）的殺蟲(chóng)活性[29‐30]。本研究結(jié)果表明，茶尺蠖幼蟲(chóng)受Bt脅迫后，雖然腸球菌屬的相對(duì)豐度隨Bt劑量的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，但與CK處理相比，Bt 處理下腸球菌屬的相對(duì)豐度均顯著增加，因此，腸球菌屬在茶尺蠖抵御外源細(xì)菌侵染過(guò)程中對(duì)宿主昆蟲(chóng)起到一定的保護(hù)作用。

除腸球菌屬外，沃爾巴克氏菌屬在不同處理下的相對(duì)豐度也發(fā)生了明顯變化。Bt脅迫后，茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道中沃爾巴克氏菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，一方面是由于 Bt作為昆蟲(chóng)病原微生物侵入蟲(chóng)體后激活了昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致了對(duì)沃爾巴克氏菌的消除；另一方面Bt侵染后消耗了過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致沃爾巴克氏菌的營(yíng)養(yǎng)匱乏，從而使其豐度顯著降低。研究表明，沃爾巴克氏菌屬在對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑敏感的茶尺蠖腸道菌群中的相對(duì)豐度高達(dá)36.69%，而在對(duì)聯(lián)苯菊酯抗性的茶尺蠖中僅占0.61%[31]。沃爾巴克氏菌是一種革蘭氏陰性胞內(nèi)次生共生細(xì)菌，在節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，并經(jīng)卵傳播[32‐33]，其對(duì)宿主昆蟲(chóng)的作用主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：一是改變昆蟲(chóng)適應(yīng)環(huán)境的能力；二是通過(guò)胞質(zhì)不親和、產(chǎn)雌孤雌生殖、雌性化或者殺雄作用等多種方式調(diào)控昆蟲(chóng)生殖；三是調(diào)控媒介昆蟲(chóng)對(duì)一些病毒病的復(fù)制和傳播能力[34-36]。然而昆蟲(chóng)體內(nèi)的沃爾巴克氏菌屬是否與宿主昆蟲(chóng)自身的防御及免疫體系相關(guān)以及該菌屬如何調(diào)控昆蟲(chóng)響應(yīng)異源微生物的刺激仍有待進(jìn)一步研究。

宿主腸道微生物受病原微生物感染發(fā)生改變的同時(shí)，其在病原微生物侵染過(guò)程中對(duì)殺蟲(chóng)活性也會(huì)產(chǎn)生一定作用。在清除腸道共生菌的家蠶幼蟲(chóng)中重建一種土著腸道菌后，家蠶幼蟲(chóng)對(duì)Cry毒素的敏感性顯著提高，其死亡率增加約40%，說(shuō)明該腸道菌對(duì)Bt的殺蟲(chóng)效應(yīng)具有增效作用[37]。然而對(duì)舞毒蛾研究發(fā)現(xiàn)，舞毒蛾幼蟲(chóng)接種庫(kù)斯塔克亞種Bt菌株后，其腸道菌群數(shù)量明顯增加，但腸道菌群缺失時(shí)該Bt菌株對(duì)幼蟲(chóng)仍具有致病力[38]。本研究基于16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，高劑量Bt處理對(duì)茶尺蠖幼蟲(chóng)腸道的細(xì)菌組成造成顯著影響，且顯著增加其腸道共生菌的群落多樣性及豐度，由此推斷茶尺蠖幼蟲(chóng)的腸道共生微生物可能參與抵御Bt的侵染，但Bt與腸道菌群之間的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，利用腸道微生物防治害蟲(chóng)的新理論和新策略受到廣泛關(guān)注，其中，利用昆蟲(chóng)沃爾巴克氏菌的胞質(zhì)不相容性操縱細(xì)菌導(dǎo)致害蟲(chóng)“不孕不育”，從而有效防控蚊媒疾病和農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害已有相關(guān)實(shí)例[39-41]。然而相關(guān)技術(shù)在茶葉害蟲(chóng)防治領(lǐng)域尚未展開(kāi)應(yīng)用，因此利用茶尺蠖關(guān)鍵腸道微生物、結(jié)合目前已有的生物防治手段是未來(lái)發(fā)展茶葉害蟲(chóng)綠色防控的新思路之一，相關(guān)措施和策略仍有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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