CRISPRCas 系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的研究進(jìn)展

摘要：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種食品安全級(jí)微生物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在以枯草芽孢桿菌為底盤(pán)細(xì)胞的微生物代謝工程研究中發(fā)揮了重要作用。介紹了CRISPR‐Cas系統(tǒng)的免疫應(yīng)答機(jī)制和分類以及枯草芽孢桿菌中CRISPR-Cas9基因組編輯的3種類型，重點(diǎn)總結(jié)了最新的CRISPR開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)策略，以期為優(yōu)化現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統(tǒng)提供參考，從而提高枯草芽孢桿菌的工業(yè)化應(yīng)用潛能。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；基因編輯；CRISPR-Cas9；CRISPR-Cpf1；PAM無(wú)依賴doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0260

中圖分類號(hào)：Q812 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2025）02‐0024‐09

枯草芽孢桿菌主要分布于土壤及腐敗的有機(jī)物中[1]，具有清晰的遺傳背景和成熟的基因工程操作技術(shù)，因此一直被用作模式微生物[2‐3]。它具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素等有害物質(zhì)，因此被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證為GRAS（generally recognized as safe）菌株，是食品安全級(jí)微生物[4‐5]；除此之外，由于其生長(zhǎng)速度快、蛋白分泌能力強(qiáng)、不易被噬菌體感染以及在基因操作過(guò)程中沒(méi)有明顯的密碼子偏好性，常被用于工業(yè)發(fā)酵[5-7]，特別是在淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等酶制劑的生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)等的發(fā)展，啟動(dòng)子工程、輔因子工程、基因回路、途徑酶組裝和基因編輯等多種研究策略和工具被用以枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞的構(gòu)建，進(jìn)行透明質(zhì)酸[8]、七稀甲萘醌[9]、N-乙酰氨基葡萄糖[10]、核黃素[11]和母乳寡糖[12] 等生物制品的高效合成。其中CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)被廣泛用于構(gòu)建枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞以進(jìn)行酶制劑等生物制品的高效合成。CRISPR是細(xì)菌和古菌抵御外來(lái)病毒入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)，如今已發(fā)展成為基因工程中強(qiáng)大的基因編輯工具[13]。CRISPR 基因編輯系統(tǒng)是通過(guò)sgRNA 引導(dǎo)Cas蛋白（如Cas9、Cpf1等）定位到靶基因位點(diǎn)，隨后Cas蛋白在基因組的特定位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，在同源性定向修復(fù)過(guò)程中通過(guò)同源臂將特定修飾的片段引入基因組，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或突變[14]。

枯草芽孢桿菌中建立了多種基于CRISPR‐Cas的基因編輯系統(tǒng)（CRISPR‐Cas9/Cpf1 等）。Zhang等[15]通過(guò)構(gòu)建包含靶標(biāo)特異性的sgRNA、Cas9和同源修復(fù)模板的多合一CRISPR‐Cas9編輯系統(tǒng)，敲除了枯草芽孢桿菌中與孢子形成相關(guān)的5個(gè)基因，獲得的突變株在發(fā)酵過(guò)程中，由于孢子萌發(fā)率大幅降低，重組蛋白得以穩(wěn)定生產(chǎn)，胞外分泌的β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活力達(dá)到277.8 U·mL-1，是未改造前的2.5倍。張春曉等[16]通過(guò)CRISPR/Cpf1編輯系統(tǒng)，對(duì)枯草芽孢桿菌中的d-丙氨酸消旋酶基因da1 進(jìn)行了敲除，實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶的食品級(jí)表達(dá)，酶活力達(dá)到17 601.3 U·mL-1。本文介紹了CRISPR-Cas 系統(tǒng)的機(jī)制和分類，并總結(jié)了3種基于CRISPR-Cas9的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建方法，最后展望了新興的CRISPR 系統(tǒng)開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)策略，為提高枯草芽孢桿菌的工業(yè)化應(yīng)用提供新的見(jiàn)解。

1 CRISPRCas系統(tǒng)簡(jiǎn)介

作為新一代基因組編輯工具的關(guān)鍵技術(shù)，CRISPR‐Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古生菌中發(fā)揮著適應(yīng)性免疫機(jī)制作用。CRISPR‐Cas免疫應(yīng)答包括3個(gè)主要階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾。在適應(yīng)階段，外源DNA 片段（protospacer）被識(shí)別并整合在CRISPR基因座區(qū)域中的2個(gè)相鄰重復(fù)之間，形成CRISPR陣列，protospacer 相鄰基序（protospacer adjacentmotif，PAM）是存在于protospacer近端的一小段保守核苷酸，用作獲取DNA片段的識(shí)別基序。在表達(dá)階段，CRISPR陣列被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA（pre-crRNA），再被Cas 蛋白進(jìn)一步切割成小的crRNA。crRNA包含1個(gè)部分重復(fù)序列和1個(gè)來(lái)自外源DNA片段并與之互補(bǔ)的單個(gè)間隔區(qū)。在干擾階段，Cas蛋白與crRNA‐外源DNA復(fù)合物結(jié)合并切割DNA片段，干擾病毒復(fù)制并為宿主細(xì)胞提供免疫力。

如圖1所示，根據(jù)干擾階段效應(yīng)蛋白的組成和具體的響應(yīng)模式，CRISPR‐Cas系統(tǒng)可分為2類（class），6型（type）[17]。第1類CRISPR‐Cas系統(tǒng)目前多發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌中，其特點(diǎn)是系統(tǒng)編碼的多個(gè)Cas蛋白會(huì)構(gòu)成效應(yīng)復(fù)合體與CRISPR 一起發(fā)揮作用；與其不同的是，第2類CRISPR‐Cas 系統(tǒng)中的Cas蛋白往往是具有多結(jié)構(gòu)域的單一蛋白，較第1類CRISPR系統(tǒng)的組成更簡(jiǎn)單。因此，目前基于CRISPR的基因編輯系統(tǒng)絕大部分都是由第2類CRISPR 系統(tǒng)改造而來(lái)的，其中應(yīng)用最為廣泛的是第2類的第Ⅱ型——CRISPR‐Cas9系統(tǒng)[18]。

2 基于CRISPRCas9的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建

枯草芽孢桿菌中建立了多種基于CRISPR‐Cas的基因編輯系統(tǒng)，并且都取得了較好的應(yīng)用效果。CRISPR‐Cas9系統(tǒng)為許多領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新發(fā)展[19]，Ⅱ型CRISPR‐Cas9 系統(tǒng)已被證明可以在枯草芽孢桿菌中引入點(diǎn)突變、基因缺失和插入，并被廣泛應(yīng)用于代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)CRISPR‐Cas9 系統(tǒng)中供體DNA、Cas9 和gRNA 表達(dá)的設(shè)計(jì)策略，可以將枯草芽孢桿菌CRISPR‐Cas9系統(tǒng)分為3種不同類型，分別是單質(zhì)粒系統(tǒng)、雙質(zhì)粒系統(tǒng)和基因組整合型[20]（表1）。

2.1 單質(zhì)粒CRISPRCas9基因組編輯系統(tǒng)

基于單個(gè)質(zhì)粒編碼的基因組編輯系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于各種原核生物和真核生物。Altenbuchner[21]報(bào)道了一種用于單質(zhì)?？莶菅挎邨U菌基因組的編輯系統(tǒng)，不僅可以高效地進(jìn)行基因組編輯，還克服了反向篩選方法的局限性。該系統(tǒng)通過(guò)將Cas9、gRNA、供體DNA和其他元件共同連接到同一載體骨架，構(gòu)建了單質(zhì)粒體系，其中Cas9和gRNA分別由1個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和1個(gè)強(qiáng)組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

單質(zhì)粒基因編輯系統(tǒng)具有較高的基因編輯效率，因此可以應(yīng)用于工業(yè)枯草芽孢桿菌的改造。Zou等[31]構(gòu)建了一個(gè)“多合一”的CRISPR‐Cas9單質(zhì)粒系統(tǒng)，縮短了枯草芽孢桿菌一輪編輯周期。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)100%的單基因缺失和點(diǎn)突變效率以及96%的基因插入效率。由于所有元件均整合在1個(gè)質(zhì)粒載體上，載體太大導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低，研究人員將質(zhì)粒消化成片段，使用分子凝結(jié)劑PEG4000輔助連接質(zhì)粒片段后轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌，轉(zhuǎn)化效率較直接轉(zhuǎn)化提升了2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)。單質(zhì)粒介導(dǎo)的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中的應(yīng)用結(jié)果表明，該系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌的基因組改造中具有巨大的潛力。

單質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌基因組的高效編輯，更重要的是，可以降低宿主菌株的適應(yīng)性負(fù)擔(dān)，從而提高工程菌株的存活率。但是使用單質(zhì)粒系統(tǒng)需要多步、多次構(gòu)建質(zhì)粒，大大降低了基因編輯系統(tǒng)的內(nèi)在效率，而且單質(zhì)粒系統(tǒng)的同源重組效率在很大程度上取決于同源修復(fù)模板的長(zhǎng)度。綜上所述，單質(zhì)粒介導(dǎo)的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌的基因工程改造中仍存在一定的局限性。

2.2 雙質(zhì)粒CRISPRCas9基因組編輯系統(tǒng)

雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)是一種基于CRISPRCas9的、更靈活的基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于枯草芽孢菌的基因組編輯，在該系統(tǒng)中，Cas9、gRNA 和供體DNA 被分別構(gòu)建到2 個(gè)不同的載體質(zhì)粒中，最后在宿主菌株體內(nèi)結(jié)合進(jìn)行基因組編輯，其中第1個(gè)質(zhì)粒用于產(chǎn)生Cas9蛋白，第2 個(gè)質(zhì)粒用于傳遞gRNA 轉(zhuǎn)錄模板和供體DNA模板。

Lim 等[28]開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR‐Cas9的高效雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)，并對(duì)枯草芽孢桿菌基因組中8 個(gè)胞外蛋白酶基因進(jìn)行了精準(zhǔn)的基因缺失。在這個(gè)雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，Cas9 基因被連接到pHCas9載體中以產(chǎn)生Cas9蛋白，2個(gè)sgRNA——靶基因sgRNA （sgRNAct）、自靶向sgRNA （sgRNAst）及用于同源定點(diǎn)修復(fù)的供體DNA 被連接到pG2載體中，以對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)操作。將pHCas9載體和pG2載體先后轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌后發(fā)現(xiàn)，在多輪的枯草芽孢基因組編輯中，8個(gè)胞外蛋白酶基因的敲除效率都達(dá)到了90% 以上，其中bpr、nprB、wprA 的敲除效率達(dá)到了100%。由此表明，該系統(tǒng)可以在枯草芽孢桿菌基因組的連續(xù)編輯中對(duì)靶基因?qū)崿F(xiàn)高效率刪除。

雙質(zhì)粒介導(dǎo)的CRISPR‐Cas9基因組編輯系統(tǒng)極大地促進(jìn)了枯草芽孢桿菌基因組編輯研究的發(fā)展，然而雙質(zhì)粒系統(tǒng)也存在諸多局限性，如在基因工程操作過(guò)程中存在不穩(wěn)定性，可能會(huì)增加宿主菌株的適應(yīng)性負(fù)擔(dān)，并且在迭代基因組編輯中需要耗費(fèi)大量時(shí)間來(lái)消除質(zhì)粒。

2.3 基于CRISPRCas9的基因組整合

為了克服潛在的質(zhì)粒不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率低和在宿主菌株上引入代謝負(fù)擔(dān)等問(wèn)題，Westbrook等[30]構(gòu)建了一個(gè)基于CRISPR‐Cas9的基因組整合工具箱來(lái)編輯枯草芽孢桿菌基因組，結(jié)果表明，該基因組整合工具箱可以對(duì)枯草芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)單基因的插入與敲除以及連續(xù)基因組的編輯和靶向轉(zhuǎn)錄抑制，是一種連續(xù)有效的綜合基因組編輯工具箱。在這個(gè)基因組整合工具箱中，擴(kuò)增出了thrC 5’端與3’端間的同源長(zhǎng)度，并插入到相應(yīng)的bpr 同源長(zhǎng)度中，構(gòu)建了gRNA 傳遞載體PAW002-2[32]；為了提高轉(zhuǎn)化效率，并使質(zhì)粒易于在大腸桿菌中復(fù)制繁殖，利用枯草芽孢桿菌的araE/R 啟動(dòng)子系統(tǒng)[33] 構(gòu)建了載體PAW004-2，以驅(qū)動(dòng)gRNA 的轉(zhuǎn)錄；選擇lacA 位點(diǎn)進(jìn)行Cas9 的基因組整合[34]。此外，將每個(gè)gRNA分別構(gòu)建了單gRNA傳遞載體和多gRNA傳遞載體，最后，將這些gRNA傳遞載體線性化后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，結(jié)果顯示，單基因敲除效率為100%，雙基因敲除效率為85%，單基因插入效率為69%（插入片段長(zhǎng)度為2.9 kb）[30]。該方法是CRISPR‐Cas9系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中同時(shí)敲除2個(gè)基因的首次報(bào)道。

與其他CRISPR‐Cas9系統(tǒng)相比，該基因組整合工具箱提高了轉(zhuǎn)化效率和編輯效率。然而，盡管基于CRISPR‐Cas9的基因組整合在枯草芽孢桿菌基因組編輯中展現(xiàn)了較高的編輯效率，但該工具箱需要1個(gè)酶切連接步驟將新的gRNA序列插入gRNA傳遞載體，并需要一輪重疊延伸PCR生成編輯模板，其操作過(guò)程非常繁瑣，因此，基于CRISPR‐Cas9的基因組整合在操作便利性方面仍有改進(jìn)和優(yōu)化的余地。

3 枯草芽孢桿菌CRISPR 開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)策略

不同遺傳操作方法的應(yīng)用提高了對(duì)枯草芽孢桿菌基因組的認(rèn)識(shí)和利用，其中CRISPR‐Cas9系統(tǒng)是最實(shí)用、最高效的基因組編輯方法，為點(diǎn)突變、基因敲除、基因插入提供了有效的解決辦法[28，30]。然而，利用CRISPR‐Cas9系統(tǒng)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行基因組編輯仍處于初步階段，由Cas9-gRNA 復(fù)合物引起的DNA 雙鏈斷裂修復(fù)可能很慢，以至于影響宿主細(xì)胞在被CRISPR‐Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后的存活。此外，有些系統(tǒng)構(gòu)建了多個(gè)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)基因組編輯，需要額外的操作來(lái)減少這些質(zhì)粒對(duì)宿主菌株的代謝負(fù)擔(dān)，同時(shí)確保工程菌的安全性。因此，完善和拓展CRISPR 系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的應(yīng)用還有以下幾個(gè)方面的工作要做。

3.1 開(kāi)發(fā)用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的不同CRISPR 核酸酶

Cas9 蛋白與crRNA/tracrRNA 雙鏈結(jié)合成復(fù)合物，以介導(dǎo)侵入性雙鏈DNA 的序列特異性切割，其中crRNA指導(dǎo)切割特異性，而Cas9蛋白中的2個(gè)核酸酶活性位點(diǎn)介導(dǎo)切割以產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂[18，35]。大量對(duì)Cas9蛋白結(jié)構(gòu)特征的研究促進(jìn)了切割特異性更高的Cas9編輯變體的發(fā)展[36-39]。Hirano等[36]對(duì)來(lái)自新兇手弗朗西斯菌（Francisellanovicida）的FnCas9進(jìn)行了特征分析，并開(kāi)發(fā)了一個(gè)能夠識(shí)別5’-YG’PAM 而不是原來(lái)的5’-NGGPAM的變體，增加了基因組編輯可用目標(biāo)空間，即任何CG或TG后面的目標(biāo)序列都容易被gRNA：FnCas9復(fù)合物靶向。此外，還可以使用其他具有不同PAM偏好的CRISPR核酸酶來(lái)增加基因組編輯的可用目標(biāo)空間。

與Cas9 蛋白類似，Cpf1 蛋白是2 類CRISPR‐Cas系統(tǒng)中由單鏈RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶，它起源于普氏菌屬（Prevotella）或弗朗西斯菌屬（Francisella）。與Cas9蛋白不同的是，Cpf1蛋白特異性識(shí)別前間隔序列5’端的TTTN PAM[40-42]，且Cpf1：crRNA 復(fù)合物的形成只需要1個(gè)crRNA，并在目標(biāo)DNA上切割產(chǎn)生5個(gè)核苷酸突出的黏性末端[42‐43]，但Cas9：crRNA/tracrRNA 復(fù)合物的形成不僅需要crRNA，還需要1 個(gè)tracrRNA，并在目標(biāo)DNA上切割產(chǎn)生平末端[18]。此外，Ran等[43]發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cpf1 的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA 由Cpf1蛋白自身加工成熟，不需要RNase Ⅲ的參與，因此使用Cpf1 核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因組編輯可以是Cas9核酸內(nèi)切酶之外的另一種選擇。Wu等[27]對(duì)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，構(gòu)建了一種功能強(qiáng)大的枯草芽孢桿菌多基因編輯和調(diào)控系統(tǒng)（CAMERS-B），該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)雙基因框內(nèi)敲除、多點(diǎn)突變或單基因一次插入，效率可達(dá)100%。同時(shí)，Ran 等[43]還發(fā)現(xiàn)Cas9 中的1 個(gè)核酸酶活性位點(diǎn)（RuvCD10A或HNHH840A）發(fā)生突變，會(huì)得到不能切割DNA 的dCas9或者只能切割一條DNA 的nCas9，導(dǎo)致不能產(chǎn)生原來(lái)的平末端，該特性可以減少脫靶效應(yīng)，并增強(qiáng)某些生物的同源重組修復(fù)。為了完善CRISPR系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌基因組編輯中的應(yīng)用，應(yīng)針對(duì)不同的、可相互替代的CRISPR核酸酶進(jìn)行全面優(yōu)化，提高編輯效率并彌補(bǔ)現(xiàn)有基因操作方法的不足。

3.2 開(kāi)發(fā)用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的自靶向CRISPRCas系統(tǒng)

盡管CRISPR‐Cas免疫系統(tǒng)能嚴(yán)格區(qū)分自身DNA與外源DNA，但仍能夠在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)自靶向間隔子（self-targeting spacers）[44]。一般情況下，宿主細(xì)胞的命運(yùn)是死亡或嚴(yán)重生長(zhǎng)遲緩、或去除自身靶點(diǎn)以保證繼續(xù)存活[44-46]，然而，Hale等[47]報(bào)道，自靶向CRISPR‐Cas系統(tǒng)及其宿主生物在某些條件下可共同存在。在這種特殊情況下，RNA 切割CRISPR‐Cas系統(tǒng)的crRNA引導(dǎo)其crRNA靶向并切割crRNA轉(zhuǎn)錄所在位點(diǎn)的短逆轉(zhuǎn)錄本。Zou等[31]構(gòu)建的枯草芽胞桿菌CRISPR‐Cas9“多合一”單質(zhì)粒系統(tǒng)，結(jié)合自靶向sgRNA 進(jìn)行迭代編輯，一輪編輯周期僅2.5 d，是單質(zhì)粒系統(tǒng)中最快的迭代編輯系統(tǒng)，在質(zhì)粒上設(shè)計(jì)了Pspo0A嚴(yán)格控制下的自靶向sgRNA 用于清除質(zhì)粒，效率可達(dá)90%，加速了枯草芽胞桿菌的工程細(xì)胞構(gòu)建。Lim等[28]利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建了一種高效、連續(xù)的枯草芽孢桿菌基因組編輯方法，該方法在pG2載體上連接了2個(gè)sgRNA—— 靶基因sgRNA （sgRNAct）和自靶向sgRNA （sgRNAst），其中sgRNAct 在生長(zhǎng)階段引導(dǎo)Cas9切割靶基因，sgRNAst在孢子體階段引導(dǎo)Cas9切割sgRNA以清除質(zhì)粒，由此產(chǎn)生的無(wú)sgRNA細(xì)胞進(jìn)入下一輪編輯。該系統(tǒng)成功地在多輪編輯中刪除掉8 個(gè)胞外蛋白酶基因，表明自靶向的CRISPR‐Cas系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌基因組編輯中有巨大的應(yīng)用潛力。此外，Zhang等[48]報(bào)道了一種基于內(nèi)源性I-B型CRISPR‐Cas系統(tǒng)的高效酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）基因組編輯工具，該工具顯著降低了CRISPR‐Cas的毒性，并提高了轉(zhuǎn)化效率。雖然這種調(diào)控機(jī)制和自靶向系統(tǒng)的作用原理尚不清楚，但這些結(jié)果揭示了利用內(nèi)源性CRISPR‐Cas系統(tǒng)調(diào)控枯草芽孢桿菌基因表達(dá)的可能性。內(nèi)源性CRISPR‐Cas系統(tǒng)是一種理想的基因組編輯工具，它可以減弱經(jīng)典CRISPR 系統(tǒng)（如Ⅱ型CRISPR‐Cas9 系統(tǒng)）的潛在脫靶效應(yīng)和毒性。

3.3 開(kāi)發(fā)不限于PAM 的枯草芽孢桿菌CRISPRCas9系統(tǒng)

CRISPR激活（CRISPR activation， CRISPRa）和CRISPR 抑制（CRISPR interference， CRISPRi）為基因表達(dá)調(diào)控提供了基礎(chǔ)，但主要應(yīng)用于真核生物，特別是缺乏原核CRISPRa研究[49]，這可能是由于細(xì)菌激活元件需要精確的空間定位和與目標(biāo)啟動(dòng)子的距離才能起作用，但基于Cas9的CRISPR工具只與NGG PAM序列相鄰的位點(diǎn)結(jié)合。這些情況阻礙了Cas9引導(dǎo)的激活元件精確介導(dǎo)細(xì)菌中內(nèi)源基因表達(dá)的上調(diào)。

Walton等[50]構(gòu)建了首個(gè)幾乎可以識(shí)別整個(gè)基因組序列的spCas9突變體——SpRY，它不再需要特定的PAM 序列。Klanschnig 等[51]用不依賴于PAM 的Cas9 變體SpRY 和噬菌體蛋白MCP 融合轉(zhuǎn)錄激活因子SoxS組合成CRISPRa，克服了PAM的限制，該工具被稱為SMS；與之前報(bào)道的CRISPRa比較，SMS可以不依賴PAM上調(diào)大腸桿菌的報(bào)告基因質(zhì)粒庫(kù)；用scRNA（細(xì)胞質(zhì)小RNA）替換gRNA 破壞MCP 與SoxS 的相互作用，實(shí)現(xiàn)SMS 在非NGG PAM 位點(diǎn)上的下調(diào)；同時(shí)使用scRNA和gRNA實(shí)現(xiàn)多基因表達(dá)控制；此外，還成功地利用SMS上調(diào)了內(nèi)源基因和整合在大腸桿菌基因組上的gfp 基因。這項(xiàng)研究是CRISPRa在原核生物基因表達(dá)調(diào)控研究中的重要進(jìn)展，為枯草芽孢桿菌等原核生物的基因組編輯研究提供了新的方向。

3.4 枯草芽孢桿菌高通量基因組修飾系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)

目前，在各種宿主細(xì)胞中構(gòu)建的多種CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有高效的基因組編輯能力，是適合開(kāi)發(fā)和優(yōu)化微生物細(xì)胞工廠的高通量技術(shù)。最近，Ronda等[52]將CRISPR‐Cas9和MAGE（multiplexautomated genome engineering）技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)造了一種高效、快速的大腸桿菌基因組工程方法CRMAGE（CRISPR‐Cas9 and λ Red recombineeringbased MAGE technology），使用CRMAGE 對(duì)大腸桿菌中3個(gè)基因組靶標(biāo)進(jìn)行基因重組，重組效率為96.5%～99.7%。Garst等[53]報(bào)道了CRISPR‐Cas9結(jié)合大量平行寡聚體的合成可以在全基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)跟蹤編輯，并基于此創(chuàng)造了CREATE（CRISPR enabled trackable genome engineering）基因組編輯方法，這是一種高效的基因組編輯策略，其通過(guò)大量平行寡聚體的合成構(gòu)建CREATE 文庫(kù)，可以在大腸桿菌的基因組中進(jìn)行大規(guī)模的精準(zhǔn)編輯。Liang 等[54]在大腸桿菌中使用CREATE策略生成640個(gè)單獨(dú)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)變體，然后利用這些單獨(dú)的變體構(gòu)建了組合文庫(kù)用來(lái)選擇生產(chǎn)異丙醇的最佳變體，與常規(guī)方法相比，CREATE策略可在較短時(shí)間內(nèi)完成近1 000株大腸桿菌變體的合理構(gòu)建和試驗(yàn)，并通過(guò)組合修飾提高異丙醇產(chǎn)量。此外，Bao 等[55] 開(kāi)發(fā)了一種CRISPR‐Cas9和同源定向修復(fù)輔助的基因組規(guī)模工程方法（CHAnGE），該方法可以在酵母中快速輸出數(shù)萬(wàn)個(gè)特定的遺傳變異。在CHAnGE系統(tǒng)中，98% 以上的目標(biāo)序列被有效編輯，平均頻率為82%。由此表明，CRISPR‐Cas9 系統(tǒng)在高通量技術(shù)的發(fā)展中具有廣闊的前景，為合理設(shè)計(jì)的枯草芽孢桿菌菌株的構(gòu)建和測(cè)試以及生產(chǎn)改良提供了技術(shù)支持。此外，還應(yīng)基于高通量技術(shù)開(kāi)發(fā)更強(qiáng)大的多基因修飾系統(tǒng)，以增強(qiáng)枯草芽孢桿菌基因組編輯的全域性。

3.5 系統(tǒng)弱化CRISPR-Cas 編輯低重組效率細(xì)菌

細(xì)菌基因組編輯通常依賴于Cas核酸酶切割未編輯的細(xì)胞染色體DNA來(lái)反篩出發(fā)生編輯的細(xì)胞。然而，編輯通常需要高重組和轉(zhuǎn)化效率，這在大多數(shù)菌株中是不具備的。即使是在模式菌中，有時(shí)也難以實(shí)現(xiàn)更大的插入、多重編輯或建庫(kù)。

近期，Collias等[56]發(fā)現(xiàn)CRISPR驅(qū)動(dòng)的同源重組可以通過(guò)降低DNA靶向活性提升轉(zhuǎn)化子數(shù)量和編輯效率，從而在不同細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)編輯。降低DNA 靶向活性可以通過(guò)改變gRNA 的序列結(jié)構(gòu)（ 使用CRISPR 陣列加工得到crRNA，再與tracrRNA相互作用，而非直接使用sgRNA）或表達(dá)強(qiáng)度；使用切割活性降低的核酸酶或設(shè)計(jì)減毒gRNAs（attenuated gRNAs，atgRNAs）擾動(dòng)核酸酶結(jié)合支架、非典型PAMs或錯(cuò)配等來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些修飾極大地增加了存活細(xì)胞數(shù)量，甚至提高了不同類型的Cas9和Cas12a在大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌中的編輯效率。其中，最有效的方法是atgRNA，這種方法不需要重組酶，并且在不犧牲編輯效率的情況下增加了存活細(xì)胞數(shù)量。因此，減弱DNA 靶向提供了一種不同的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)CRISPR驅(qū)動(dòng)的細(xì)菌基因編輯，為枯草芽孢桿菌基因組編輯提供了新思路。

3.6 CreLoxP位點(diǎn)重組系統(tǒng)與CRISPRCas9基因編輯系統(tǒng)聯(lián)用

Cre‐LoxP系統(tǒng)是源于P1噬茵體的DNA重組體系，由Cre重組酶和相應(yīng)的LoxP位點(diǎn)組成，它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處（LoxP位點(diǎn)），該系統(tǒng)可以將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除[57]，因此在枯草芽孢桿菌基因組的連續(xù)編輯中被廣泛應(yīng)用于微生物菌株的代謝改造。

為了提高枯草芽孢桿菌基因組編輯的穩(wěn)定性，并擴(kuò)大其應(yīng)用，Cai等[58]提出了Cre‐Cas系統(tǒng)的新概念，該系統(tǒng)將Cre‐LoxP 和CRISPR‐Cas9結(jié)合為一種簡(jiǎn)便有效的方法。攜帶表達(dá)盒的整合載體通過(guò)單交叉同源重組整合到枯草芽孢桿菌染色體上，然后pHT-Cre質(zhì)粒表達(dá)Cre重組酶去除lox66和lox71位點(diǎn)兩側(cè)的選擇標(biāo)記，并將lox66和lox71位點(diǎn)之間的復(fù)制子重組為單個(gè)lox72位點(diǎn)。當(dāng)不再需要外源基因表達(dá)盒時(shí)，使用輔助質(zhì)粒pHPGCas9-gRNA，通過(guò)CRISPR‐Cas9 系統(tǒng)將表達(dá)盒移除并自我修復(fù)至其原始狀態(tài)。為了驗(yàn)證該系統(tǒng)，使用T7和角蛋白酶表達(dá)盒，依據(jù)抗性基因的丟失或維持來(lái)評(píng)估自我修復(fù)效率，結(jié)果顯示自我修復(fù)效率都在97%以上[58]。這一系統(tǒng)為枯草芽孢桿菌基因組編輯提供了新思路。

4 結(jié)語(yǔ)

枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌的重要模式菌種，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和生物材料等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，如疫苗、酶制劑、飼料添加劑及其他生物化學(xué)品的生產(chǎn)。基于CRISPR 基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建高效的枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞是提高其工業(yè)化應(yīng)用的有效策略之一。然而，盡管枯草芽孢桿菌在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用，但是與大腸桿菌的工業(yè)化應(yīng)用相比，在基因工程改造方法層面還存在不少差距，其中，在對(duì)枯草芽孢桿菌基因組編輯的應(yīng)用中，枯草芽孢桿菌質(zhì)粒構(gòu)建效率低，是目前新方法應(yīng)用需要突破的瓶頸之一。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)及其他相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，多學(xué)科的交叉結(jié)合應(yīng)用將成為枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞設(shè)計(jì)與構(gòu)建的重要方向。未來(lái)的研究應(yīng)著眼于通過(guò)不同輔助技術(shù)的創(chuàng)造性和靈活性使用來(lái)解決枯草芽孢桿菌基因組編輯目前存在的問(wèn)題，在保證遺傳操作中枯草芽孢桿菌高重組率的同時(shí)，提高載體構(gòu)建效率，并采用創(chuàng)新的方法和策略，使現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌基因組編輯系統(tǒng)全面優(yōu)化，這將大大提升枯草芽孢桿菌的工業(yè)應(yīng)用潛能和范圍。

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