蛇床子素對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合和血管生成的影響及機制

關鍵詞蛇床子素；超音刺猬信號通路；創(chuàng)面愈合；皮膚；血管生成

皮膚創(chuàng)面愈合是由多種細胞因子、生長因子及多種細胞參與的一種病理生理進程，需要經(jīng)過止血、血管生成、炎癥反應、肉芽組織形成、纖維增殖或基質形成、再上皮化等過程[1]。皮膚創(chuàng)面愈合能夠使皮膚保持完整性，然而在感染、過度炎癥、嚴重缺血甚至部分疾病的影響下，創(chuàng)面愈合的過程受到干擾，使得愈合時間明顯延長，嚴重影響了患者的身心健康[2]。研究發(fā)現(xiàn)，促進傷口的血管生成是加速皮膚創(chuàng)面愈合的有效策略之一[3]。常見的促進傷口血管生成的藥物有血管內(nèi)皮生長因子類藥物（如貝伐珠單抗、阿柏西普等）、血管生成素類藥物（如馬西替坦、利奧西呱）、前列環(huán)素類藥物（如前列地爾、依前列醇）等，但這些藥物會導致高血壓、出血、血栓等副作用。因此，開發(fā)新的安全有效的藥物以促進皮膚創(chuàng)面愈合和血管生成，已成為臨床研究的熱點和重點。

蛇床子素（osthole，OST）是提取自中藥蛇床子的一種天然化合物，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、保護肝臟、保護神經(jīng)、保護骨關節(jié)、改善骨質、改善免疫功能等作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，OST能減輕皮膚炎癥、修復皮膚屏障，在組胺誘導的人角質形成細胞和成纖維細胞炎癥過程中，改善了細胞遷移和細胞屏障功能[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，OST可促進血管生成，且其衍生物能夠加快皮膚傷口愈合[6―7]。超音刺猬（sonichedgehog，SHH）信號通路與胚胎發(fā)育、細胞自我更新和干細胞群維持密切相關，其被激活能夠促進皮膚創(chuàng)面愈合和血管形成[8]?；诖耍狙芯繑M建立全層皮膚缺損傷口模型大鼠，從SHH信號通路角度出發(fā)，研究OST對模型大鼠皮膚血管生成和創(chuàng)面愈合的影響及機制，以期為OST的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括RX50型光學顯微鏡[舜宇光學科技（集團）有限公司]，AMR-100型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司），CFXDuet型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR）儀（美國Bio-Rad公司），500-151-30型游標卡尺（蘇州天音騰達機電工程有限公司），Tanon5200型凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

OST對照品（批號S2337，純度99.99%）購自美國SelleckChemical公司；SHH抑制劑環(huán)巴胺對照品（批號C4116，純度≥98%）購自美國Sigma公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒（批號分別為D006-1-4、D026-1-1）均購自南京建成生物科技有限公司；血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號SEKR-0055）購自北京索萊寶科技有限公司；堿性成纖維細胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）ELISA試劑盒（批號D731030-0096）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、Trizol試劑（批號分別為FD2001、FD8872）均購自杭州弗德生物科技有限公司；兔源血管內(nèi)皮生長因子A（vascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA）、SHH、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2，VEGFR-2）、神經(jīng)膠質瘤相關癌基因同源蛋白1（glioma-associatedoncogenehomolog-1，GLI1）、GAPDH一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（批號分別為ab214424、ab308225、ab11939、ab273018、ab181602、ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，共72只，體重200～250g，雄性，7～8周齡，由湖北貝恩特生物科技有限公司提供[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（鄂）2021-0027]。實驗前所有大鼠在溫度23～25℃、相對濕度40%～60%的動物房中分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，適應性飼養(yǎng)7d后用于實驗。本研究的動物實驗方案已通過武漢華聯(lián)科生物技術有限公司動物倫理委員會的審核（倫理號為HLK-20220719）。

2 方法

2.1 大鼠全層皮膚缺損傷口模型的構建

參考文獻方法，構建大鼠全層皮膚缺損傷口模型[9―10]。將60只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉，背部脫毛、消毒，備皮面積為2cm2。大鼠固定后在背部脊柱一側標記一個圓形切口，切口平行于脊柱，沿標記線切除全層皮膚，深至筋膜層，形成創(chuàng)面。次日，肉眼可見創(chuàng)面少許滲血，且無感染，則表明造模成功。

2.2 動物分組與給藥

本研究共造模成功60只大鼠，采用隨機數(shù)字表法將其分為模型組（即Model組），低、中、高劑量OST組（即OST-L、OST-M、OST-H組，20、30、40mg/kgOST[11]）和高劑量OST+SHH抑制劑環(huán)巴胺組（即OST-H+環(huán)巴胺組，40mg/kgOST+10mg/kg環(huán)巴胺[12]），每組12只；另選取12只大鼠為對照組（僅剃除皮膚毛發(fā)，不造模）。OST-L組、OST-M組、OST-H組大鼠分別腹腔注射20、30、40mg/kgOST；OST-H+環(huán)巴胺組在腹腔注射40mg/kgOST前30min，腹腔注射10mg/kg環(huán)巴胺；每天給藥1次，給藥體積均為10mL/kg，連續(xù)14d。Model組和對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

2.3 大鼠創(chuàng)面愈合率的計算

在給藥第1、7、14天時觀察大鼠創(chuàng)面愈合情況，用游標卡尺測量創(chuàng)面直徑，并進行拍照；采用ImageJ軟件計算大鼠的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率＝（用藥前創(chuàng)面面積－用藥后創(chuàng)面面積）/用藥前創(chuàng)面面積×100%。

2.4 大鼠創(chuàng)面組織的病理學形態(tài)觀察

采用HE染色法觀察。末次給藥后，所有大鼠脫頸處死，每組隨機選取6只大鼠，切除創(chuàng)面組織，固定于多聚甲醛中，組織脫水后制成石蠟切片，一部分切片行HE染色，另一部分備用。取HE染色的切片，于光學顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織的病理學變化。

2.5 大鼠創(chuàng)面組織膠原蛋白沉積情況觀察

采用Masson染色法觀察。取“2.4”項下剩余的創(chuàng)面組織切片，根據(jù)Masson染色試劑盒說明書方法進行染色，于光學顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織形態(tài)并拍照。采用ImageJ軟件計算膠原蛋白相對表達量，膠原蛋白相對表達量＝（藍染的膠原纖維面積/視野總面積）×100%。

2.6 大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平檢測

采用ELISA法檢測。將每組剩余6只大鼠處死，剖取創(chuàng)面組織，一部分置于冰上加入裂解液進行裂解，另一部分凍存于－80℃條件下，待用。將制備的創(chuàng)面組織勻漿，根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法操作，檢測大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平。

2.7 大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量檢測

采用RT-qPCR法檢測。取“2.6”項下凍存的創(chuàng)面組織適量，用Trizol試劑提取總RNA，并反轉錄為cDNA進行擴增。擴增體系為：4μLcDNA，25μLSYBRGreenPCRMasterMix，正反向引物對各1μL，ddH2O19μL，總體積為50μL。擴增條件為：聚合酶活化10min，94℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，45次循環(huán)。本研究所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，序列信息如表1所示。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算VEGFA、VEGFR-2mRNA的相對表達量。

2.8 大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.6”項下凍存的創(chuàng)面組織適量，用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后，進行變性處理。取變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，以5%牛血清蛋白溶液封閉2h，加入VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1000）于4℃過夜孵育；加入相應二抗（稀釋比例為1∶5000）于室溫孵育2h，采用ECL試劑顯色，經(jīng)凝膠成像后，采用ImageJ軟件進行分析，以GAPDH為內(nèi)參進行歸一化。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPadPrism7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 OST對大鼠創(chuàng)面愈合率的影響

與Model組比較，OST-M組、OST-H組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組比較，OST-M組、OST-H組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組比較，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠給藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1和圖2。

3.2 OST對大鼠創(chuàng)面組織病理學變化的影響

對照組大鼠皮膚組織表皮完整。Model組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化不明顯，新生血管數(shù)較少，肉芽組織出現(xiàn)水腫，炎癥細胞浸潤嚴重。與Model組相比，OST-L組、OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化明顯，炎癥細胞浸潤和肉芽組織水腫減輕，新生血管數(shù)增多，其中OST-H組大鼠的創(chuàng)面組織損傷明顯減輕。與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織再上皮化不明顯，炎癥細胞浸潤加重，新生血管數(shù)減少。結果見圖3。

3.3 OST對大鼠創(chuàng)面組織膠原蛋白沉積的影響

對照組大鼠皮膚組織膠原纖維和膠原蛋白含量豐富，排列緊密，膠原蛋白相對表達量為（45.76±2.15）%。與對照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少，膠原蛋白相對表達量[（5.35±0.80）%]顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，OST-L組、OST-M組和OST-H組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積增多，膠原蛋白相對表達量[（12.06±1.14）%、（20.87±1.59）%、（34.52±2.06）%]均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）。與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少，膠原蛋白相對表達量[（8.21±1.05）%]顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4。

3.4 OST對大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平的影響

與對照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖5。

3.5 OST對大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量的影響

與對照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖6。

3.6 OST對大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達的影響

與對照組相比，Model組大鼠創(chuàng)面組織中VEGFA、VEGFR-2、SHH、GLI1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與OST-L組相比，OST-M組、OST-H組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性（P＜0.05）；與OST-H組相比，OST-H+環(huán)巴胺組大鼠創(chuàng)面組織中上述蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖7。

4 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，皮膚創(chuàng)面愈合需要經(jīng)過凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期：在創(chuàng)面形成初期，毛細血管內(nèi)血液流入創(chuàng)面，形成凝血塊覆蓋在創(chuàng)面表層；在炎癥期，巨噬細胞、中性粒細胞在創(chuàng)面聚集并吞噬病原體，同時伴隨大量肉芽組織形成，成纖維細胞逐漸遷移，膠原蛋白沉積增多[13]。血管網(wǎng)形成和血管再生在創(chuàng)面愈合中非常關鍵，新生血管為創(chuàng)面組織細胞提供氧氣和營養(yǎng)；Ang-1、VEGFA是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，能夠促進血管內(nèi)皮細胞增殖和血管生成，其中VEGFA可參與芽生血管形成[14]。bFGF是從腦組織與垂體抽提物中發(fā)現(xiàn)的具有促進成纖維細胞生長的因子，同時還可增強血管內(nèi)皮生長因子的分泌，促進內(nèi)皮細胞與成纖維細胞的增殖，從而促進血管新生和修復[15]。VEGFR-2是生長因子受體，具有促進表皮細胞生長和分化的作用[16]。

OST是蛇床子的活性成分，Kordulewska等[5]研究發(fā)現(xiàn)其在皮膚創(chuàng)面愈合過程中具有潛在作用：在組胺誘導的人角質形成細胞和成纖維細胞炎癥過程中，OST降低了白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α水平，改善了細胞遷移和細胞屏障功能。本研究結果顯示，Model組大鼠創(chuàng)面新生血管數(shù)較少，肉芽組織出現(xiàn)水腫，炎癥細胞浸潤嚴重；創(chuàng)面組織的膠原纖維、膠原蛋白沉積減少；創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平和VEGFA、VEGFR-2mRNA及蛋白表達水平均升高，與李學鋒[17]的研究一致，說明大鼠皮膚遭受創(chuàng)傷后自體修復機制被激活。經(jīng)OST干預后，大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面組織中Ang-1、bFGF水平以及VEGFA、VEGFR-2mRNA和蛋白表達水平均進一步升高。這說明OST可通過上調(diào)血管生成相關因子水平，促進大鼠創(chuàng)面愈合和血管生成，從而加快機體對創(chuàng)面損傷的修復作用。有報道顯示，OST具有抑制原發(fā)性肝癌、鼻咽癌等腫瘤血管生成的作用[6，18]；此外，OST雖然不能直接促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成，但具有誘導骨髓間充質干細胞成骨-血管生成耦合的能力[19]。這與本研究中OST促進創(chuàng)面血管生成的結果不相符，推測導致其發(fā)揮不同作用的原因可能與藥物的作用效果受到其所處的生理或病理環(huán)境的影響有關[6，18―19]。

SHH信號通路在血管生成過程中發(fā)揮著重要作用，其通過調(diào)控下游分子GLI1影響血管生成[8]。朱美霖等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血大鼠中，SHH信號通路激活劑Purmorphamine可以激活缺血半暗帶中SHH信號通路并促進血管新生，而環(huán)巴胺可以通過抑制SHH信號通路來抑制血管新生。孫浩等[21]研究發(fā)現(xiàn)，實驗室自制的毛囊再生乳膏能夠通過調(diào)控毛囊生長發(fā)育過程中的Wnt信號通路和SHH信號通路促進創(chuàng)面愈合時的毛囊再生。既往研究顯示，正常小鼠皮膚損傷后，SHH蛋白表達升高，說明皮膚受損會刺激SHH信號通路活化[22]。本研究結果顯示，經(jīng)OST干預后，大鼠創(chuàng)面組織中SHH、GLI1蛋白表達水平相比對照組升高。進一步使用SHH抑制劑環(huán)巴胺干預后發(fā)現(xiàn)，大鼠創(chuàng)面組織中SHH、GLI1蛋白表達水平降低，這說明環(huán)巴胺減弱了OST的作用效果，提示OST可能通過激活SHH信號通路促進大鼠皮膚血管生成和創(chuàng)面愈合。

綜上所述，OST可促進大鼠皮膚創(chuàng)面愈合和血管生成，其機制可能與激活SHH信號通路有關。但本研究仍有一些不足，如未設置單獨的SHH信號通路激活劑組、缺少相關體外細胞水平的研究、機制不夠全面等，還需進一步探究。此外，OST促進大鼠創(chuàng)面愈合的最佳給藥劑量和給藥途徑（全身給藥或局部皮膚給藥）仍需深入分析。