基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別的精天顆粒質(zhì)量評價

關(guān)鍵詞精天顆粒；指紋圖譜；超高效液相色譜法；層次聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；質(zhì)量評價

慢性腎臟病（chronickidneydisease，CKD）是一種起病隱匿、治療周期長且患病率在數(shù)十年內(nèi)顯著升高的疾病，現(xiàn)已成為全球發(fā)病率及病死率增長最快的疾病之一[1]。目前，化學(xué)藥治療CKD存在高血鉀、血肌酐升高等副作用，而中醫(yī)藥治療CKD的不良反應(yīng)較少，且與化學(xué)藥聯(lián)合治療時，可減少化學(xué)藥的劑量和不良反應(yīng)[2]。精天顆粒是湖北省中醫(yī)院腎病科巴元明教授在長期治療CKD的臨床實踐中凝練而成的經(jīng)驗方，由酒黃精、紅景天、茯苓、豬苓、澤瀉、桂枝、熟大黃、穿山龍、白術(shù)、炙甘草10味藥組成。方中，酒黃精為君藥，可養(yǎng)陰潤肺、滋腎填精；紅景天為臣藥，可補氣清肺、益智養(yǎng)心；茯苓、豬苓、澤瀉、桂枝、白術(shù)可利水滲濕、溫陽化氣，熟大黃可瀉下、活血化瘀，穿山龍可祛風(fēng)除濕、舒筋活血，共為佐藥；炙甘草為使藥，可顧護胃氣，使攻不傷胃，并調(diào)和諸藥；全方共奏益氣養(yǎng)陰、利水瀉濁之功效，用于氣陰兩虛、水濁內(nèi)停所致的CKD3～4期患者。

本課題組擬將該方開發(fā)為醫(yī)療機構(gòu)制劑。目前，在精天顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案（正在注冊申報）中，除了對其粒度、水分、溶化性等關(guān)鍵物理特性進行檢查外，還通過薄層色譜法成功鑒別了茯苓、熟大黃和大黃酸的特征性斑點。在含量測定項下，該草案選取了紅景天苷作為檢測成分，以評估臣藥的質(zhì)量。除此之外，該草案尚未對處方中的其他藥材進行質(zhì)控。因此，為了更好地控制精天顆粒的質(zhì)量，有必要建立一種全面、高效、快速的檢測方法。指紋圖譜是一種全面且客觀的中藥質(zhì)量評價工具，通過結(jié)合指紋圖譜與化學(xué)模式識別技術(shù)，如層次聚類分析（hierarchicalclusteranalysis，HCA）、主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）等，可以更真實地反映中藥質(zhì)量的差異，并揭示中藥復(fù)雜成分間的相互作用規(guī)律，這些方法已廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方制劑的質(zhì)量評價[3]。本研究擬采用超高效液相色譜（UPLC）法建立精天顆粒的指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)全面、系統(tǒng)地評價該制劑的質(zhì)量，以期為該制劑的質(zhì)量評價及控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括WayealLC3600系列UPLC儀（安徽皖儀科技股份有限公司）、AS220.R2型萬分之一天平（美國Ohaus公司）、ES225SM-DR型十萬分之一分析天平（瑞士Precisa公司）、KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

酒黃精、紅景天、茯苓、豬苓、澤瀉、桂枝、熟大黃、穿山龍、白術(shù)、炙甘草飲片購于湖北辰美中藥有限公司、黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司、保和堂（亳州）制藥有限公司、甘肅九州天潤中藥產(chǎn)業(yè)有限公司等，經(jīng)湖北省中醫(yī)院藥事部陳樹和主任藥師鑒定均為真品。將不同廠家不同批次飲片進行隨機組合，再按照精天顆粒制備工藝制成顆粒，其中10批精天顆粒由湖北省中醫(yī)藥研究院自制，批號依次為20240801（S1）、20240802（S2）、20240803（S3）、20240804（S4）、20240805（S5）、20240806（S6）、20240807（S7）、20240808（S8）、20240809（S9）、20240810（S10）；3批精天顆粒為勁牌持正堂藥業(yè)有限公司制備，批號分別為C0000230901（S11）、C0000230902（S12）、C0000230903（S13），以上規(guī)格均為18g/袋。

5-羥甲基糠醛對照品（批號111626-202316，純度98.4%）、紅景天苷對照品（批號110818-202210，純度99.7%）、綠原酸對照品（批號110753-202119，純度96.3%）、肉桂酸對照品（批號110786-202305，純度98.8%）、甘草酸銨對照品（批號110731-202122，純度94.4%）、大黃酸對照品（批號110757-201607，純度96.0%）、大黃素對照品（批號110756-201913，純度96.0%）、甘草次酸對照品（批號110723-202316，純度99.6%）、大黃酚對照品（批號110796-201922，純度99.4%）、蘆薈大黃素對照品（批號110795-201710，純度98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Luna?OmegaPolarC18（150mm×2.1mm，1.6μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3min，5%A→8%A；3～15min，8%A→15%A；15～50min，15%A→26%A；50～60min，26%A→42%A；60～68min，42%A→44%A；68～73min，44%A→70%A；73～76min，70%A→5%A；76～80min，5%A）；進樣量為1μL；流速為0.2mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為265nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取精天顆粒適量，研細，精密稱定2g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱質(zhì)量，超聲（功率250W，頻率45kHz）處理30min；放冷后再次稱質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量；濾過，濾液以0.22μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取5-羥甲基糠醛、紅景天苷、綠原酸、肉桂酸、大黃酸、甘草酸銨、大黃素、甘草次酸、大黃酚、蘆薈大黃素對照品適量，加甲醇制成一定濃度的單一對照品貯備液；分別取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為49.00、103.50、26.52、18.96、76.96、25.97、12.62、9.68、13.22、20.16μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 單味飲片供試品溶液的制備

按處方比例分別稱取10味飲片，再按精天顆粒制備工藝制樣，得各單味飲片樣品；取各單味飲片樣品，按“2.2.1”項下方法處理，即得單味飲片的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取精天顆粒（S11）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。以16號峰（峰形較好且響應(yīng)值較高）為參考峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均不大于2.9%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取精天顆粒（S11）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、8、12、24h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以16號峰為參考峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均不大于3.8%（n＝6），表明在室溫下24h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取精天顆粒（S11）適量，按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積。以16號峰為參考峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均不大于4.4%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 精天顆粒指紋圖譜的建立

取13批精天顆粒，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到13批樣品的UPLC圖，再導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件進行分析，設(shè)定樣品S13的圖譜為參照圖譜、時間窗寬度為0.1min，采用中位數(shù)法，結(jié)合多點校正并進行Mark峰匹配，生成精天顆粒對照指紋圖譜（R）及13批樣品的UPLC疊加指紋圖譜（圖1）。由對照指紋圖譜標(biāo)定出25個共有峰；相似度分析結(jié)果顯示，13批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.955～0.996，均在0.9以上，說明各批次間樣品具有高度相似性，各批次精天顆粒的制備工藝較為穩(wěn)定，質(zhì)量一致性較好。

2.5 精天顆粒共有峰的指認與歸屬

取按“2.2.3”項下方法制備的單味飲片供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，得各單味飲片的UPLC圖。將該色譜圖與混合對照品溶液的UPLC圖（R1）、精天顆粒對照指紋圖譜（R）同時進行比對（圖2），對樣品中各共有峰進行指認，共指認出其中10個，分別是3號峰5-羥甲基糠醛、5號峰紅景天苷、8號峰綠原酸、15號峰肉桂酸、19號峰蘆薈大黃素、20號峰甘草酸銨、21號峰大黃酸、23號峰大黃素、24號峰甘草次酸、25號峰大黃酚。對各單味飲片對共有峰的貢獻進行統(tǒng)計，結(jié)果可得，熟大黃、紅景天、穿山龍、炙甘草、白術(shù)、酒黃精、豬苓、桂枝、茯苓、澤瀉貢獻的共有峰分別有14、13、6、6、4、3、3、3、2、2個，詳見表1。

2.6 精天顆粒指紋圖譜的化學(xué)模式識別分析

2.6.1 HCA

采用SPSS26.0軟件對13批精天顆粒中25個共有峰的峰面積進行HCA，通過組間聯(lián)接和平方歐氏距離法進行處理，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)平方歐氏距離為15時，13批樣品被劃分為3類：S1、S5、S7、S11～S13聚為一類，S4、S6聚為一類，S2、S3、S8～S10聚為一類。

2.6.2 PCA

PCA屬于一種非監(jiān)督的多元統(tǒng)計分析方法，能夠較為全面地反映多個指標(biāo)成分原有的數(shù)據(jù)信息[4]。本研究以13批精天顆粒指紋圖譜中25個共有峰的峰面積為變量，將其導(dǎo)入SPSS26.0軟件進行PCA。以特征值＞1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[5]，得到7個主成分因子（圖4），其累計方差貢獻率達92.666％，表明該7個主成分因子可反映精天顆粒特征圖譜的主要信息。第1～7個主成分的因子載荷系數(shù)絕對值最高者依次為3號峰（5-羥甲基糠醛，0.914）、13號峰（0.934）、14號峰（0.974）、22號峰（0.903）、11號峰（－0.930）、12號峰（0.811）、15號峰（肉桂酸，0.965），這些成分的主要來源飲片為酒黃精、紅景天、熟大黃和桂枝。

2.6.3 OPLS-DA

采用SIMCA14.1軟件對13批精天顆粒中25個共有峰進行OPLS-DA，以探究樣品間的差異性。結(jié)果顯示，模型的累計解釋率RX2（cum）、RY2（cum）和累計預(yù)測率Q2（cum）分別為0.538、0.888和0.764，均大于0.5，表明該模型具有良好的解釋和預(yù)測能力[6]。為驗證模型的穩(wěn)健性，本研究進行了200次隨機置換檢驗，結(jié)果如圖5A所示。由圖5A可知，R2回歸線的Y軸截距為0.425，Q2回歸線的Y軸截距為－0.563，均低于原始值，證實了模型沒有過擬合，適合用于區(qū)分13批樣品間的差異。根據(jù)OPLS-DA得分，13批樣品可聚為3類（圖5B），其中S2、S7、S8聚為一類，S1、S5、S11～S13聚為一類，S3、S4、S6、S9、S10聚為一類，這一聚類結(jié)果與HCA結(jié)果存在部分差異。OPLS-DA常采用變量重要性投影（variableimportanceinprojection，VIP）評估每個共有峰的貢獻度，以VIP＞1作為判定標(biāo)準(zhǔn)[7]，從而識別組間差異的潛在關(guān)鍵因素。由圖5C可知，VIP＞1的共有峰有13個，按VIP值從高到低依次為25號峰（大黃酚）、13號峰、17號峰、7號峰、6號峰、16號峰、23號峰（大黃素）、21號峰（大黃酸）、24號峰（甘草次酸）、10號峰、11號峰、20號峰（甘草酸銨）、19號峰（蘆薈大黃素）。這些色譜峰所對應(yīng)的成分被認為是影響精天顆粒批次間差異的主要化學(xué)成分，即潛在的差異標(biāo)志物。進一步分析顯示，這些差異標(biāo)志物中，1個來自豬苓，1個來自穿山龍，3個來自炙甘草，5個來自紅景天，7個來自熟大黃（因6、7號色譜峰的來源飲片有多個，故此處合計值大于13），說明嚴(yán)格控制熟大黃、紅景天、炙甘草、穿山龍、豬苓飲片的質(zhì)量是確保精天顆粒批次間質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)鍵。在載荷散點圖中，距離原點越遠的成分對樣品分類的影響越大。由圖5D可知，上述13個色譜峰均遠離原點，與圖5C結(jié)果一致，進一步證實了上述13個成分可能是導(dǎo)致樣品批次間差異的主要標(biāo)志性成分。

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，本研究考察了不同提取溶劑（甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇）、不同溶劑體積（10、20、50、100mL）、不同超聲時間（15、30、45min）對提取結(jié)果的影響，最終選擇了以20mL甲醇作為提取溶劑，超聲提取30min的供試品溶液制備方法。在色譜條件的優(yōu)化方面，本研究對流動相（甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水）、柱溫（30、35、40℃）、進樣量（1、3、5μL）進行了考察，最終確定流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液，柱溫為30℃，進樣量為1μL；用二極管陣列檢測器進行全波長（190～400nm）掃描，發(fā)現(xiàn)在265nm波長下，供試品溶液的響應(yīng)信號較強且基線穩(wěn)定，并能檢測出包含190～400nm波長范圍內(nèi)的絕大部分色譜峰，故確定檢測波長為265nm。

本研究建立了13批精天顆粒的UPLC指紋圖譜，利用混合對照品溶液確認了10個特征峰的歸屬，指認出25個共有峰，并對這些共有峰進行了飲片歸屬。研究結(jié)果表明，13個不同批次樣品在化學(xué)成分上的一致性較好。在對13批精天顆粒進行指紋圖譜分析時，發(fā)現(xiàn)其相似度較高（0.955～0.996），表明樣品所采用的制備工藝和樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定。HCA結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為15時，樣品S1～S10被劃分為3個不同的類別，這可能與不同批次飲片的產(chǎn)地和質(zhì)量差異有關(guān)；樣品S11～S13是采用相同批次的飲片在相同生產(chǎn)條件下制備的，當(dāng)平方歐氏距離為5時，它們被單獨聚為一類，說明在保證飲片質(zhì)量、生產(chǎn)條件一致的前提下，制劑質(zhì)量較為一致。PCA和OPLS-DA的進一步分析結(jié)果揭示了多種成分的含量差異，這些成分主要來源于酒黃精、紅景天、熟大黃、炙甘草、桂枝、穿山龍和豬苓，故需要嚴(yán)格控制上述飲片的質(zhì)量。HCA是一種非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，其基于不同樣本之間的相似性進行分組，不依賴于預(yù)先定義的類別標(biāo)簽；而OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析方法，旨在通過最大化組間差異和最小化組內(nèi)差異來識別不同組別之間的差異化合物。上述2種方法在算法設(shè)計和目的上存在本質(zhì)區(qū)別，這可能是導(dǎo)致本研究中二者分組結(jié)果不一致的原因。

此外，鑒于所建立的指紋圖譜與茯苓、豬苓、澤瀉、穿山龍圖譜對應(yīng)的共有峰數(shù)目較少，本研究還對文獻報道的茯苓中的活性成分茯苓酸[8]，豬苓中的麥角甾醇[9]，澤瀉中的23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C[10]，穿山龍中的薯蕷皂苷[11]等成分進行了比對，但可能出于色譜柱不匹配、化學(xué)成分在樣品制備過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化或者含量低于儀器的檢測限無法被檢出等原因，上述成分均不能在本研究色譜條件下被檢測到，后續(xù)可使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方法對其進一步分析。

綜上所述，本研究所建立的指紋圖譜方法簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性良好，結(jié)合化學(xué)模式識別方法不僅適用于精天顆粒不同批次間的一致性評價，而且為全面控制精天顆粒的質(zhì)量提供了重要參考依據(jù)。方中酒黃精、紅景天、熟大黃、穿山龍、豬苓、桂枝、炙甘草的質(zhì)量是影響精天顆粒整體質(zhì)量的關(guān)鍵。