云南核桃分心木總黃酮純化工藝研究

摘 要：采用大孔樹脂吸附法對(duì)云南核桃分心木黃酮粗提物進(jìn)行純化處理。以吸附率和解吸率為考核指標(biāo)，從6種大孔樹脂（NKA-9、AB-8、XAD-7HP、HPD-500、HP-20及D-101）中進(jìn)行篩選，并通過動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)初步探討云南核桃分心木中黃酮的純化條件。結(jié)果表明，D-101大孔樹脂吸附和解吸效果最佳。在粗提物上樣液濃度為10 mg·mL-1、上樣液pH值為6、上樣液流速為2 mL·min-1、上樣液體積為40 mL以及洗脫液為體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液、洗脫液pH值為6、洗脫液流速為2 mL·min-1、洗脫液體積為75 mL時(shí)，采用D-101大孔樹脂純化后的總黃酮含量從41%提高至72%。該工藝條件適用于云南核桃分心木黃酮的純化。

關(guān)鍵詞：云南核桃；分心木；黃酮純化；大孔樹脂

Purification and Adsorption of Flavonoids from Diaphragma juglandis fructus in Juglans sigillata D. by Macroporous Resin

XIA Wenxi， HE Xuhua， KAN Huan， LIU Yun*

（School of Life Sciences， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract： The crude extracts of flavonoids from Diaphragma juglandis fructus in Juglans sigillata D. were purified by the adsorption method using macroporous resins. Six macroporous resins （NKA-9， AB-8， XAD-7HP， HPD-500， HP-20 and D-101） were screened with adsorption and desorption rates. The purification conditions of Diaphragma juglandis fructus from Juglans sigillata D. were studied by dynamic adsorption and desorption experiments. The results showed that D-101 macroporous resin had the best adsorption and desorption effect. When the concentration of crude extract was 10 mg·mL-1， the sample pH value was 6， the flow rate was 2 mL·min-1， and the sample volume was 40 mL， the eluent was 50% ethanol solution by volume， the elution pH value was 6， the elution flow rate was 2 mL·min-1， the elution volume was 75 mL， and the total flavonoid content was increased from 41% to 72% after purification with D-101 macroporous resin. In conclusion， the process conditions were suitable for the purification of flavonoids from Diaphragma juglandis fructus in Juglans sigillata D..

Keywords： Juglans sigillata D.; Diaphragma juglandis fructus; flavonoid purification; microporous resin

云南核桃（Juglans sigillata D.）品質(zhì)優(yōu)良、核仁飽滿、蛋白質(zhì)及脂肪含量較高，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[1]。目前，核桃加工以果仁基礎(chǔ)加工為主[2]，而產(chǎn)生的大量分心木通常被丟棄，造成了極大的浪費(fèi)。分心木（Diaphragma juglandis fructus）是生長(zhǎng)在核桃內(nèi)部的干燥木質(zhì)隔膜組織[3]，味道苦澀、食性平和[4-5]。分心木中主要含有黃酮類、醌類和酚酸類化學(xué)成分[6]，其中黃酮類成分的含量最高，通常在7%～13%[7]。目前，大孔樹脂因具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、溶劑消耗少、易再生等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于富集植物類黃酮[8]，但關(guān)于大孔樹脂純化云南核桃分心木黃酮的研究卻鮮有報(bào)道。本文旨在初步確定分心木總黃酮的純化工藝，以期為分心木黃酮的高效利用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

云南核桃分心木，云南磨漿農(nóng)業(yè)有限公司。

NKA-9、AB-8、XAD-7HP、HPD-500、HP-20大孔樹脂，北京惠德易科技有限責(zé)任公司；HP-20、D-101大孔樹脂，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；蘆?。ǚ治黾儯虾Ｔ慈~生物科技公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82恒溫振蕩器，常州智博瑞儀器制造有限公司；SG5200HD超聲波清洗機(jī)，上海冠特超聲儀器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；TG16-WS離心機(jī)，湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LX-JY0304蠕動(dòng)泵，廣州市家有樂寵電子商務(wù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 云南核桃分心木黃酮粗提物的制備

稱取一定量云南核桃分心木粉，按照液料比60∶1（mL∶g），加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，在溫度51 ℃、功率160 W的條件下超聲提取

39 min，經(jīng)過抽濾、減壓濃縮、凍干后，即可得到黃酮粗提物，用純水溶解配制成不同濃度的粗提物水溶液，備用。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

參考趙娟娟等[7]的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，蘆丁質(zhì)量濃度（x）和吸光值（y）的線性回歸方程為y=13.185 7x+0.018 7，R2=0.999。按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法處理黃酮樣品，依次測(cè)量吸光度。云南核桃分心木黃酮粗提液或純化液中總黃酮含量的計(jì)算公式為

（1）

式中：X為黃酮含量，%；C為溶液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V為溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為黃酮粗提物或純化物質(zhì)量，g。

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

6種大孔樹脂均進(jìn)行以下預(yù)處理。①用純水浸泡去除6種大孔樹脂的雜質(zhì)，濾干。②用無(wú)水乙醇浸泡24 h后用純水洗凈，濾干。③用5%鹽酸浸泡4 h后用純水洗凈，濾干。④用5% NaOH浸泡4 h，再用純水洗至中性，備用[9]。

1.3.4 大孔樹脂篩選

分別取3 g預(yù)處理后的6種大孔樹脂置于錐形瓶中，加入20 mL一定濃度的云南核桃分心木黃酮粗提物水溶液，在25 ℃、120 r·min-1的恒溫振蕩器中振蕩24 h，過濾，取濾液測(cè)定吸光值，按照公式（2）計(jì)算吸附率。隨后取20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液與濾干樹脂混勻，在25 ℃、120 r·min-1的恒溫振蕩器中解吸24 h，過濾，測(cè)定濾液的吸光值，按照公式（3）計(jì)算解吸率[10-11]。

（2）

（3）

式中：K為吸附率，%；F為解吸率，%；C0為粗提物水溶液中總黃酮濃度，mg·mL-1；C1為吸附飽和后濾液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V0為吸附液總體積，mL；C2為解吸液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V2為解吸液總體積，mL。

1.3.5 大孔樹脂D-101動(dòng)態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

（1）大孔樹脂D-101動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。設(shè)置基礎(chǔ)吸附條件為上樣液濃度10 mg·mL-1、上樣液pH值6、上樣液流速2 mL·min-1，以每5 mL為收集單元，收集流出液，計(jì)算吸附率。分別考察上樣液濃度（5、10、15、20 mg·mL-1和25 mg·mL-1）、上樣液pH值（1、2、3、4、5、6、7和8）對(duì)吸附率的影響。通過泄露曲線考察上樣液流速和上樣液體積對(duì)黃酮濃度的影響。

（2）大孔樹脂D-101動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)。以最佳上樣條件對(duì)黃酮粗提物水溶液進(jìn)行吸附后，設(shè)置基礎(chǔ)解吸條件為洗脫液體積分?jǐn)?shù)50%、洗脫pH值為6、洗脫流速2 mL·min-1，以每5 mL為收集單元，收集流出液，計(jì)算解吸率。分別考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%）、洗脫液pH值（1、2、3、4、5、6、7和8）、洗脫流速（1、2 mL·min-1和3 mL·min-1）對(duì)解吸率的影響。通過洗脫曲線考察洗脫液流速和洗脫液體積對(duì)黃酮濃度的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖，采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂篩選結(jié)果

由圖1可知，D-101大孔樹脂對(duì)黃酮的吸附率（70.23%）略高于NKA-9（69.37%）及HP-20（68.46%），三者無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于（P＜0.05）AB-8（65.08%）、HPD-500（64.43%）及XAD-7HP（53.00%）；AB-8大孔樹脂對(duì)黃酮的解吸率（93.97%）略高于D-101大孔樹脂（92.02%），二者無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于（P＜0.05）NKA-9（86.71%）、HPD-500（78.61%）、XAD-7HP（66.15%）及HP-20（54.60%）。綜合吸附與解吸效果，選擇D-101大孔樹脂作為后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)的材料。

2.2 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 上樣液濃度的確定

由圖2可知，在D-101大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附過程中，吸附率隨上樣液濃度的增大而先升高后降低。當(dāng)上樣液濃度小于10 mg·mL-1時(shí)，吸附率持續(xù)增大，直至濃度為10 mg·mL-1時(shí)達(dá)到峰值，而后吸附率開始減小。這可能是由于上樣液濃度較小時(shí)，所產(chǎn)生的吸附推動(dòng)力小，導(dǎo)致吸附速率低，體系中的樹脂在同時(shí)間內(nèi)對(duì)黃酮的吸附率較??；上樣液濃度過大時(shí)，雜質(zhì)含量增加，其與黃酮競(jìng)爭(zhēng)樹脂的吸附活性位點(diǎn)，且易堵塞層析柱濾膜，導(dǎo)致吸附率降低[12]。因此，選擇10 mg·mL-1為最佳上樣液濃度。

2.2.2 上樣液pH值的確定

由圖3可知，在D-101大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附過程中，吸附率隨上樣液pH值的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH值在4～6時(shí)，吸附率在91.62%～91.11%，變化不明顯；當(dāng)pH值大于6時(shí)，吸附率明顯降低。這可能是由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中存在大量酚羥基，呈弱酸性，當(dāng)酸度過高時(shí)，易以“佯鹽”形式存在；當(dāng)酸度過低時(shí)，便會(huì)形成離子態(tài)，兩種情況都會(huì)影響樹脂對(duì)云南核桃分心木黃酮的吸附[13]。由于云南核桃分心木黃酮粗提物水溶液的pH值為6，綜合考慮，選擇pH=6進(jìn)行上樣。

2.2.3 上樣液流速和體積的確定

通常，流出液中黃酮濃度達(dá)到上樣液中黃酮濃度10%時(shí)認(rèn)為開始泄漏[13]（當(dāng)上樣液濃度為

10 mg·mL-1時(shí)，上樣液中黃酮濃度為0.22 mg·mL-1，故泄漏點(diǎn)為0.022 mg·mL-1）。由圖4可知，上樣液流速為3 mL·min-1時(shí)，因速率過快，泄漏點(diǎn)最早出現(xiàn)，此時(shí)云南核桃分心木黃酮可能與樹脂未充分接觸；上樣液流速為1 mL·min-1時(shí)，泄漏點(diǎn)最晚出現(xiàn)，此時(shí)云南核桃分心木黃酮被樹脂充分吸附，但周期較長(zhǎng)，會(huì)降低純化過程的效率[14]。因此，選擇2 mL·min-1為最適上樣液流速。在該流速下，上樣液體積為

25 mL時(shí)達(dá)到泄漏點(diǎn)。上樣液體積為25～40 mL時(shí)，黃酮濃度未發(fā)生明顯變化（上樣液體積為40 mL時(shí)，流出液中黃酮濃度為0.029 mg·mL-1），表明泄露量變化不明顯?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作效率與時(shí)間成本，選擇40 mL為上樣液體積，此時(shí)泄露率不超過3%。

圖4 上樣液流速和體積對(duì)黃酮濃度的影響

2.3 大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的確定

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～50%時(shí)，云南核桃分心木黃酮的解吸率逐漸升高；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，解吸率達(dá)到最高（90.31%）；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，樹脂中醇溶性雜質(zhì)大量溶出至洗脫液，從而降低了黃酮的解吸率。樹脂與黃酮間存在一定的范德華力，二者的極性越相近，范德華力越大[14]。因此推測(cè)體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液可能與云南核桃分心木黃酮的極性最相近，洗脫效果較好。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

2.3.2 洗脫液pH值的確定

由圖6可知，洗脫液pH值在1～8時(shí)，樹脂中云南核桃分心木黃酮的解吸率隨洗脫pH值的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)洗脫液pH值為6時(shí)，解吸率達(dá)到峰值，繼續(xù)增大洗脫pH值，解吸率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于云南核桃分心木黃酮粗提物水溶液pH值為6，呈現(xiàn)弱酸性，弱酸性的條件有助于D-101大孔樹脂對(duì)黃酮的解吸。因此，選擇pH=6進(jìn)行洗脫。

圖6 洗脫液pH值對(duì)解吸率的影響

2.3.3 洗脫液流速和體積的選擇

由圖7可知，當(dāng)洗脫液流速為1 mL·min-1時(shí)，流速較慢，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)；當(dāng)洗脫液流速為

3 mL·min-1時(shí)，流速較快，洗脫時(shí)間短，但洗脫效果不及2 mL·min-1。因此，選擇2 mL·min-1為最適洗脫液流速。當(dāng)流速控制在2 mL·min-1，洗脫液體積消耗至75 mL時(shí)，溶液中黃酮濃度為0.002 mg·mL-1，表明吸附在樹脂上的黃酮已基本被洗脫完全。為了保證產(chǎn)物的回收率，選擇洗脫液體積為75 mL，洗脫液流速控制在2 mL·min-1。

2.4 純化前后總黃酮含量的變化

以上述純化工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，純化前后溶液中總黃酮含量從41%提高至72%。結(jié)果表明，該工藝條件分離純化效果較好，操作可行。

3 結(jié)論

本研究采用6種大孔樹脂對(duì)云南核桃分心木黃酮進(jìn)行靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)，篩選出吸附率及解吸率較好的D-101大孔樹脂并進(jìn)行云南核桃分心木總黃酮純化工藝研究。結(jié)果表明，當(dāng)上樣液濃度為10 mg·mL-1、上樣液pH值為6、上樣液流速為

2 mL·min-1、上樣液體積為40 mL以及乙醇洗脫液體積分?jǐn)?shù)為50%、洗脫液pH值為6、洗脫液流速為

2 mL·min-1、洗脫液體積為75 mL時(shí)，云南核桃分心木總黃酮含量從41%提高至72%。本研究可為云南核桃分心木黃酮的純化工藝提供一定理論支撐。但本研究只通過單因素實(shí)驗(yàn)初步確定了黃酮的純化工藝，后續(xù)可進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高云南核桃副產(chǎn)物的加工利用水平。

參考文獻(xiàn)

[1]謝蕾，李賢忠，寧德魯，等.深紋核桃種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與挖掘研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技通訊，2021（11）：26-31.

[2]何旭華，王超，彭小偉，等.云南核桃分心木不同極性提取物純化及抗氧化活性分析[J].食品科技，2022，47（10）：217-224.

[3]TAN J Y，CHENG Y G，LI J L，et al.New taraxasterane-type triterpenes from Diaphragma juglandis fructus[J].Tetrahedron Letters，2022，100：153868.

[4]何旭華，闞歡，黃陸繄，等.云南核桃分心木黃酮提取及抗氧化性研究[J].現(xiàn)代食品，2020（19）：204-209.

[5]MENG Q R，WANG Y Q，CHEN F，et al.Polysaccharides from Diaphragma juglandis fructus： extraction optimization， antitumor， and immune-enhancement effects[J].International Journal of Biological Macromolecules，2018，115：835-845.

[6]王丹.核桃分心木化學(xué)成分分離鑒定及抗炎活性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[7]趙娟娟.分心木黃酮超聲-微波協(xié)同提取及抗氧化性研究[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（18）：70-76.

[8]王玲玲，邊祥雨，高蔚娜，等.植物類黃酮提取純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2019，41（6）：606-610.

[9]羅磊，姬青華，馬麗蘋，等.NKA-9大孔樹脂對(duì)綠豆皮黃酮的純化研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2019，19（6）：157-167.

[10]陳素雯，邱思娃，蔡延渠，等.大孔樹脂對(duì)龍脷葉總黃酮的純化工藝及其吸附特性研究[J].應(yīng)用化工，2021，50（2）：340-344.

[11]晏俊玲，樊揚(yáng)，秦川，等.苦竹筍總黃酮大孔樹脂純化工藝及其體外抗炎活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（23）：184-192.

[12]馬娟娟.山楂葉黃酮的提取、純化及分離技術(shù)研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[13]WU S H，WANG Y Y，GONG G L，et al.Adsorption and desorption properties of macroporous resins for flavonoids from the extract of Chinese wolfberry （Lycium barbarum L.）[J].Food and Bioproducts Processing，2015，93：148-155.

[14]金慧鳴，郭紅英，譚興和，等.大孔吸附樹脂—聚酰胺聯(lián)用純化茅巖莓總黃酮工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2016，37（12）：13-18.