乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛含量檢測方法的建立及其方法學(xué)驗(yàn)證

摘 要：本文建立了一種高效液相色譜法檢測乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。使用Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行色譜分離，以0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）作為流動相，設(shè)置流速為1.0 mL·min-1、進(jìn)樣量為10 μL、柱溫為30 ℃以及檢測波長為284 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，樣品的平均回收率為90.90%。該方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、耐用性良好，適用于乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛含量的測定。

關(guān)鍵詞：乳酸菌發(fā)酵；5-羥甲基糠醛；高效液相色譜法；方法學(xué)驗(yàn)證

Establishment of a Method for the Detection of 5-Hydroxymethylfurfural Content in Milk Products Fermented by Lactic Acid Bacteria and Its Methodological Validation

ZHONG Dichang， XIONG Yanxia， ZHANG Yang， WU Yuzhen， LI Liying， YU Yinfang*

（Jiangzhong Pharmaceutical Co.， Ltd.， Nanchang 330004， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for the determination of 5-hydroxymethylfurfural in milk products fermented by lactic acid bacteria was established and the method was verified. The separation was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with 0.1% formic acid-acetonitrile （98∶2， V/V） as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the sample size was 10 μL， the column temperature was

30 ℃， and the detection wavelength was 284 nm. The quantification was performed by external standard method. The results showed that 5-hydroxymethylfurfural had a good linear relationship in the range of 0.030 2 μg·mL-1 to

15.120 0 μg·mL-1 with correlation coefficient R2=0.999 9. The average recovery of sample was 90.90%. The method has strong specificity， good stability and good durability， and is suitable for the determination of 5-hydroxymethylfurfural content in milk products fermented by lactic acid bacteria.

Keywords： lactic acid bacteria fermentation; 5-hydroxymethylfurfural; high performance liquid chromatography method; methodological validation

乳酸菌發(fā)酵牛乳是乳酸菌發(fā)酵食品中使用最廣泛的制品之一，牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后可以產(chǎn)生大量的胞外多糖、活性肽、乳酸等乳酸菌代謝產(chǎn)物，可發(fā)揮廣泛的代謝和調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫、緩解非酒精性脂肪肝、抗氧化、降低血脂和膽固醇等生理功能[1-4]。牛乳在乳酸菌發(fā)酵以及加工成型過程中，特別是在高溫處理時，極易發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成一系列的芳香與顏色物質(zhì)，5-羥甲基糠醛就是其中的代表產(chǎn)物之一[5-7]。相關(guān)研究表明[8-10]，5-羥甲基糠醛含量與中藥材色澤變化具有一定的相關(guān)性。為了進(jìn)一步表征乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物的外觀顏色，為其外觀品質(zhì)鑒別提供量化數(shù)據(jù)支撐，本研究建立了一種高效液相色譜法檢測乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，以期有效測定乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛的含量，為乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物的質(zhì)量控制及關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

乳酸菌發(fā)酵牛乳噴干粉，購于某公司。

ME204 TE電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；1200液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SB-500DTY超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5M臺式低速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；IQ 7000超純化水儀（廈門精益興業(yè)科技有限公司）。

5-羥甲基糠醛對照品（批號111626，純度≥99%），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（分析純），國藥化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲酸（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；超純化水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB -Aq 色譜柱（250 mm×

4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：284 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛對照品約3.024 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲使其溶解并定容，得到濃度約為30.24 μg·mL-1的5-羥甲基糠醛對照品儲備液。精密吸取儲備液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用純化水定容至刻度線，得到濃度約為6.048 μg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取乳酸菌發(fā)酵牛乳噴干粉5 g，置于50 mL

容量瓶中，加入純化水約40 mL，超聲10 min使其溶解，放冷，使用純化水定容至刻度線，搖勻，經(jīng)

0.45 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.2.4 專屬性

按照1.2.2項(xiàng)的方法制備對照品溶液，1.2.3項(xiàng)的方法制備供試品溶液，精密量取適量對照品溶液、空白溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄相應(yīng)的色譜圖。

1.2.5 線性范圍

分別取適量1.2.2項(xiàng)下的對照品儲備液，配制成濃度分別為0.030 2、0.302 4、0.604 8、1.209 6、

3.024 0、6.048 0 μg·mL-1和15.120 0 μg·mL-1的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。以5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 檢出限與定量限

以3倍左右信噪比作為方法的檢出限，以10倍左右信噪比作為方法的定量限。在空白溶液中加入已知濃度的5-羥甲基糠醛對照品溶液，經(jīng)過梯度稀釋后，得到不同濃度的樣品溶液，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測。

1.2.7 精密度

精密稱取5 g乳酸菌發(fā)酵牛乳噴干粉6份，按照1.2.3項(xiàng)的方法制備樣品溶液，共6個平行，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄相應(yīng)色譜圖，計算峰面積。

1.2.8 準(zhǔn)確度

精密稱取已知5-羥甲基糠醛含量（4.322 8 μg·g-1）的乳酸菌發(fā)酵牛乳噴干粉4.0 g各6份，置于50 mL容量瓶中，精密加入對照品儲備液20.5 mL，加純化水約40 mL，超聲處理10 min，放冷，使用純化水定容至刻度線。注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄相應(yīng)色譜圖，按照峰面積計算5-羥甲基糠醛的含量，計算回收率。

1.2.9 穩(wěn)定性

按照1.2.3的方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，計算峰面積。

1.2.10 耐用性

按照1.2.3的方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，分別在流速增減0.1 mL·min-1、柱溫增減2 ℃、流動相比例增減1%的色譜條件下進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，計算峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察結(jié)果

對照品溶液、空白溶液、樣品溶液相對應(yīng)的色譜圖見圖1?？瞻兹芤涸趯φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤?-羥甲基糠醛出峰處，沒有出現(xiàn)干擾峰，說明該方法專屬性較好，沒有雜質(zhì)干擾。

2.2 線性范圍考察結(jié)果

以5-羥甲基糠醛對照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，其線性關(guān)系見圖2。線性回歸方程為y=

1.351 7x+0.010 2，R2=0.999 9，表明5-羥甲基糠醛濃度在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限與定量限

分別以信噪比（S/N）=5和信噪比（S/N）=13.5確定方法的檢出限和定量限，計算得到該方法中5-羥甲基糠醛的檢出限為0.004 536 μg·mL-1，定量限為0.018 144 μg·mL-1。

2.4 精密度考察結(jié)果

精密度考察結(jié)果見表1。結(jié)果表明，同一濃度下6份供試品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%，表明該方法儀器精密度良好，重復(fù)性好，能夠滿足檢測要求。

2.5 準(zhǔn)確度考察結(jié)果

準(zhǔn)確度考察結(jié)果見表2。結(jié)果表明，6份樣品的回收率在89.19%～92.19%，平均回收率為90.90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%，表明該方法回收率穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高。

2.6 穩(wěn)定性考察結(jié)果

穩(wěn)定性考察結(jié)果見表3。結(jié)果表明，供試品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，其峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.44%，說明該方法下5-羥甲基糠醛在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 耐用性考察結(jié)果

耐用性考察結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在流速增減0.1 mL·min-1、柱溫增減2 ℃、流動相比例增減1%的色譜條件下，對照品溶液中5-羥甲基糠醛含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%，表明該方法的耐用性良好。

3 結(jié)論

本研究建立了一種高效液相液相色譜法測定乳酸菌發(fā)酵牛乳噴干粉中5-羥甲基糠醛含量的方法。根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》中“9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，該方法專屬性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，耐用性良好，適用于乳酸菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)物中5-羥甲基糠醛含量的測定。

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