文心蘭生物鐘基因OnELF3克隆與表達(dá)分析

摘""要：ELF3是重要的生物鐘基因，調(diào)節(jié)光信號(hào)的輸入與晝夜節(jié)奏輸出，參與調(diào)控植物的重要過程。為了了解其在文心蘭花瓣衰老啟動(dòng)中的調(diào)控作用，本研究對(duì)OnELF3基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析。結(jié)果表明：利用轉(zhuǎn)錄組文庫中的ELF3基因序列，從文心蘭花瓣中擴(kuò)增得到OnELF3基因（GenBank登錄號(hào)：OL613896）；OnELF3基因全長2208"bp，編碼735個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位表明其在細(xì)胞核中表達(dá)。同源序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示OnELF3與鐵皮石斛蘭和蝴蝶蘭親緣關(guān)系最近。原核表達(dá)分析表明，OnELF3基因能原核表達(dá)出功能蛋白。該基因在長光照、全光照及全黑暗條件下表達(dá)模式與其作為生物鐘基因功能一致。實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，OnELF3基因在綻口期和盛開期表達(dá)量最高，表明OnELF3基因可能在開花和花衰老啟動(dòng)中均發(fā)揮作用。本研究為進(jìn)一步鑒定OnELF3基因在開花和花衰老啟動(dòng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：文心蘭；花衰老；ELF3基因；基因克??；表達(dá)分析中圖分類號(hào)：S31""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"the"Biological"Clock"Gene"OnELF3"in"Oncidium

TAN"Yurong1，2，3，"PEI"Xiaohua1，2，"ZHAI"Ke1，2，"WU"Shuang1，2，"LI"Mengtao1，2，"MENG"Qingchang1，2，SONG"Haoming1，2，"YANG"Yujing1，2，"PAN"Yingwen4，"XIE"Guangming1，2，5，"LI"Xiumei5，"LIU"Jinping1，2*

1."School"of"Breeding"and"Multiplication"（Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication），"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"3."Guangxi"Academy"of"Argicultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"4."Post-entry"Quarantine"Station"for"Tropical"Plant，"Hainan"Entry-exit"Inspection"and"Quarantine"Bureau，"Haikou，"Hainan"570311，"China;"5."Wuzhishan"Wanquan"Horticulture"Co.，"Ltd."/"Hongshan"Farm，"Zhongshan"Town，"Wuzhishan，"Hainan"572216，"China

Abstract："ELF3"is"an"important"biological"clock"gene"that"regulates"the"input"of"light"signal"and"the"output"of"circadian"rhythm，"participating"in"modulation"of"many"important"processes"of"plants."In"order"to"understand"its"regulation"in"the"initiation"of"petal"senescence"of"Oncidium，"we"conducted"cloning"and"expression"analysis"of"OnELF3"in"Oncidium."OnELF3"（GenBank"accession"number："OL613896）"was"isolated"from"the"Oncidium"petals."OnELF3"had"a"length"of"2208"bp"and"encoded"a"protein"of"735"amino"acids."Subcellular"localization"showed"its"expression"in"the"nucleus."Homologous"sequence"alignment"and"phylogenetic"tree"analysis"showed"that"OnELF3"was"closest"to"the"counterparts"of"Dendrobium"candidum"and"Phalaenopsis."Prokaryotic"expression"analysis"showed"that"the"cloned"OnELF3"was"capable"of"prokaryotic"expression"of"functional"proteins."Its"expression"patterns"under"long"day，"full"light，"and"full"darkness"conditions"were"consistent"with"its"function"as"a"circadian"clock"gene."Real"time"fluorescence"quantitative"analysis"showed"that"the"expression"of"OnELF3"was"the"highest"in"cracked"buds"and"full-open"flowers，"indicating"that"OnELF3"may"play"a"role"in"both"flowering"and"flower"senescence"initiation."This"study"would"lay"a"foundation"for"further"functional"identification"of"OnELF3"in"the"initiation"of"flower"senescence.

Keywords："Oncidium;"flower"senescence;"ELF3"gene;"gene"cloning;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.005

文心蘭（Oncidium）花型酷似婆娑起舞的女郎，又名跳舞蘭、舞女蘭；又似飛翔的蝴蝶，因此又名金蝶蘭。文心蘭因其別致優(yōu)美的花型、亮黃鮮艷的花色，為極具觀賞價(jià)值的重要切花類型[1]?；ㄋダ喜粌H是重要的植物生理過程，也是影響文心蘭這類切花商品價(jià)值的一個(gè)十分重要的指標(biāo)。研究文心蘭花衰老的分子機(jī)制，不僅有助于了解植物器官的衰老與調(diào)控，也有助于從分子水平上控制花衰老，從根本上解決切花保鮮問題[2-11]。

EARLY"FLOWERING3（ELF3）是生物鐘（circadian"clock）基因，而生物鐘是生物為適應(yīng)外界變化的內(nèi)在晝夜節(jié)奏，參與調(diào)控幾乎所有的植物的重要過程[12-16]。ELF3作為生物鐘核心振蕩器中晚間復(fù)合體（evening"complex，"EC）即ELF3-"ELF4-LUX"ARRHYTHMO（LUX）的重要組成部分，調(diào)節(jié)光信號(hào)的輸入與生物鐘的輸出，不僅控制下胚軸伸長生長與植物開花時(shí)間[17-20]，還在植物耐鹽性[21]和葉片衰老[22]方面發(fā)揮重要作用。文心蘭花發(fā)育和衰老過程的轉(zhuǎn)錄組研究表明，ELF3基因還可能參與文心蘭花瓣衰老的啟動(dòng)調(diào)控[23]。

本研究從文心蘭中克隆到生物鐘基因OnELF3的全長序列，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位分析，以及其在不同花發(fā)育時(shí)期和晝夜中的表達(dá)分析，研究結(jié)果為研究OnELF3基因功能鑒定及其在文心蘭花瓣衰老啟動(dòng)的調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為南茜黃金3代文心蘭鮮切花，購自海南省出入境檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心。亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pCAMBIA1300、原核表達(dá)載體pET-30a、農(nóng)桿菌菌株GV3101、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）及本生煙草均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2""方法

1.2.1""OnELF3基因的克隆與生物信息學(xué)分析""參照CTAB法提取文心蘭花瓣總RNA[24]。利用1%濃度凝膠電泳檢測RNA條帶的完整性，并利用微量分光光度計(jì)測量RNA濃度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript"RT"regent"Kit"with"gDNA"Eraser）合成cDNA第1條鏈。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列設(shè)計(jì)引物OnELF3-F/R（表1），以獲得的文心蘭cDNA為模板擴(kuò)增OnELF3基因CDS區(qū)（去掉終止密碼子），將獲得的目的片段純化后連接T載體，菌落檢測正確后測序，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

以擴(kuò)增得到的正確的序列在ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件上預(yù)測氨基酸序列；通過ExPASy服務(wù)器的ProtParam"tool（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用SignalP"4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/"SignalP/）在線軟件對(duì)氨基酸序列的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測；用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/"cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）在線軟件預(yù)測OnELF3蛋白亞細(xì)胞定位。以預(yù)測到的OnELF3蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中作Blast檢索，并使用MEGA"6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2""OnELF3的亞細(xì)胞定位分析""利用Primer"5.0軟件設(shè)計(jì)OnELF3基因帶有p1300載體多克隆酶切位點(diǎn)的引物OnELF3-1300-F/R（表1）。以含有目的片段的T載體質(zhì)粒為模板克隆目的條帶，采用酶切酶連法構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體35S：：OnELF3：GFP，將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。采用瞬時(shí)表達(dá)的方法，將含有亞細(xì)胞定位載體35S：：OnELF3：GFP的農(nóng)桿菌注射到生長期為1個(gè)月的煙草葉片背部，28"℃弱光培養(yǎng)3"d后剪取葉片，利用激光共聚焦熒光顯微鏡分析基因的定位情況。

1.2.3""OnELF3基因的原核表達(dá)分析""利用Primer"5.0軟件設(shè)計(jì)OnELF3基因帶有pET30a載體多克隆酶切位點(diǎn)的引物OnELF3-30a-F/R（表1）。以含有目的片段的T載體質(zhì)粒為模板克隆目的條帶，構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體T7"promoter：："OnELF3：His-Tag，將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中。0.8"mol/L"IPTG，37"℃誘導(dǎo)pET30a和OnELF3-pET30a表達(dá)0、1、2、3"h后收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；0.8"mol/L"IPTG"pET30a和OnELF3-pET30a表達(dá)3"h進(jìn)行Western"Blotting分析。

1.2.4""OnELF3基因的表達(dá)模式分析""生物鐘節(jié)律表達(dá)分析取樣：將150枝文心蘭花枝平均分到3個(gè)量杯中，對(duì)文心蘭切花進(jìn)行2～3"d的暗處理、全光照和長光照處理后，從早上6：00開始時(shí)每隔2"h采1次樣，采樣時(shí)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選擇采集盛開期花瓣（盛開前期、盛開期及衰老初期3個(gè)時(shí)期中在盛開期表達(dá)量最高），連續(xù)采樣72"h，液氮速凍后保存于?80"℃冰箱。文心蘭切花不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析取樣：根據(jù)文心蘭南茜品種花的形態(tài)變化特征，將其花發(fā)育分為花苞期（A）、綻口期（B）、半開放期（C）、盛開前期（D）、盛開期（E）、衰老初期（F）、衰老期（G）等8個(gè)不同的時(shí)期[25]，在同一時(shí)間點(diǎn)采集不同時(shí)期的花瓣，裝于無RNA酶的離心管中，于?80"℃冰箱保存?zhèn)溆?。取樣結(jié)束后提取花瓣RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以文心蘭肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因，設(shè)計(jì)OnELF3基因熒光定量PCR的引物OnELF3Q-F/R（表1）。

2""結(jié)果與分析

2.1""OnELF3基因CDS區(qū)序列克隆與生物信息學(xué)分析

據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果得到OnELF3基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增出2432"bp序列，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast分析得到OnELF3基因的開放閱讀框全長為2208"bp（GenBank登錄號(hào)：OL613896）。根據(jù)該開放閱讀框設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到OnELF3的CDS，長度為2240"bp（圖1）。

利用PtptParam軟件預(yù)測分析OnELF3基因的編碼蛋白，表明OnELF3蛋白分子量大小為80.70"kDa，等電點(diǎn)為8.22，不穩(wěn)定系數(shù)為54.07，屬于不穩(wěn)定蛋白，易降解。Signal"P4.1"Server"軟件預(yù)測OnELF3蛋白無信號(hào)肽，不是分泌蛋白。Plant-mPLoc軟件預(yù)測OnELF3蛋白定位在細(xì)胞核上。利用NCBI分析OnELF3保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，未找到與OnELF3基因編碼的蛋白相對(duì)應(yīng)的已知結(jié)構(gòu)域，但與其他物種的ELF3蛋白的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，因此，認(rèn)為克隆到的基因的確是ELF3基因。利用DNAMAN軟件對(duì)OnELF3氨基酸與其他9種植物的ELF3氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這10個(gè)植物的ELF3存在保守的部分序列，OnELF3蛋白與鐵皮石斛、蝴蝶蘭等蘭科植物的ELF3蛋白同源性在63%～"81%之間，與其他物種的ELF3蛋白同源性在40%～50%之間（圖2）。

利用MEGA"6軟件對(duì)OnELF3與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast檢索到的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，文心蘭OnELF3蛋白與鐵皮石斛蘭和蝴蝶蘭ELF3親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.2""OnELF3在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

將含有OnELF3基因的重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌懸浮液注射到煙草葉片中，使其在煙草表皮細(xì)胞中表相似性水平≥100%為黑色；相似性水平≥75%為粉紅色；相似性水平≥50%為綠色；相似性水平lt;50%則為白色。The"similarity"was"indicated"by"different"colors："blue-black=100%，"pink≥75%;"green≥50%，"and"whitelt;50%.達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察OnELF3蛋白的定位情況。當(dāng)注射的是空載pCAMBIA"1300時(shí)，在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均能看到GFP熒光，而當(dāng)GFP與OnELF3蛋白融合表達(dá)時(shí)，熒光信號(hào)主要在細(xì)胞核上（圖4）。OnELF3蛋白的核定位使其具有作為轉(zhuǎn)錄因子的基本特征。

2.3""OnELF3基因的原核表達(dá)分析

OnELF3基因原核表達(dá)經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，OnELF3-pET30a與空載pET30a相比，條帶較深，大小與預(yù)測的蛋白大小一致（圖5A）。Western"Blot驗(yàn)證結(jié)果表明，重組蛋白OnELF3-pET30a誘導(dǎo)成功，重組蛋白OnELF3-"pET30a可被特異性抗體識(shí)別，得到與預(yù)測時(shí)大小一致的單一蛋白條帶（圖5B）。上述結(jié)果說明本研究成功克隆了OnELF3基因并能原核表達(dá)出功能蛋白。

2.4""OnELF3基因的生物鐘節(jié)律表達(dá)分析

為確定OnELF3基因的表達(dá)是否受生物鐘的影響，利用實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析對(duì)OnELF3基因在長光照（LD）、全光照（LL）及全黑暗（DD）條件下的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，OnELF3基因只在長光照條件下呈節(jié)律性振蕩表達(dá)，在22：00和6：00分別有1個(gè)高峰值，在全光照與全黑暗條件下表現(xiàn)出節(jié)律不齊（圖6）。

2.5""OnELF3基因在文心蘭不同花期花瓣中的表達(dá)分析

對(duì)OnELF3在文心蘭切花發(fā)育各個(gè)時(shí)期的花瓣實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，OnELF3基因在綻口期表達(dá)量達(dá)到最高值，之后表達(dá)量下降，在盛開期上升到第二高峰值，之后表達(dá)量下降，在衰老期達(dá)到最低值（圖7）。

3""討論

本研究克隆到1個(gè)文心蘭生物鐘基因OnELF3，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其無已知功能的結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，OnELF3定位于細(xì)胞核。與擬南芥[26]的研究結(jié)果一致，ELF3編碼無已知功能結(jié)構(gòu)域的植物特異性核蛋白。在擬南芥中，ELF3是生物鐘晚間階段轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)的重要成員，呈現(xiàn)24"h節(jié)律性振蕩，并在傍晚出現(xiàn)表達(dá)峰。本研究結(jié)果顯示，在長日照條件下，OnELF3呈24"h節(jié)律性振蕩表達(dá)，出現(xiàn)2個(gè)表達(dá)峰，這與擬南芥中ELF3在傍晚出現(xiàn)1個(gè)表達(dá)峰有所不同，說明不同植物間生物鐘基因的節(jié)律表坐標(biāo)軸下方的黑色矩形代表正常條件下的黑暗時(shí)間，白色代表光照時(shí)間。

達(dá)存在一致性與差異性[27]。

ELF3在植物中不僅維持生物鐘節(jié)律性振蕩，還在開花調(diào)控過程中扮演重要角色[27]。通過分析OnELF3基因在花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在花的各個(gè)發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，其中在綻口期的表達(dá)量最高，在盛開期出現(xiàn)第二個(gè)高峰，這一結(jié)果與之前的轉(zhuǎn)錄組分析相吻合[23]，表明OnELF3基因可能參與開花過程及花衰老的啟動(dòng)。小麥屬的ELF3突變后，突變系比野生型更早開花[28]；水稻ELF3抑制Ghd7的表達(dá)，促進(jìn)水稻開花[29]；大豆ELF3與LUX1、LUX2形成復(fù)合物，抑制開花抑制因子E1表達(dá)，促使大豆提前開花[30]。盡管ELF3在花瓣衰老中的作用尚未見報(bào)道，但已有研究表明，ELF3在葉片衰老的調(diào)控中起著重要作用[22，"31-34]。擬南芥ELF3通過與ELF4和LUX組成的晚間復(fù)合體（EC）直接與MYC2的啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)茉莉酸鹽（JA）誘導(dǎo)的葉片衰老起著負(fù)調(diào)控作用[32]；在自然條件下和黑暗誘導(dǎo)條件下的葉片衰老中，ELF3可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控PIF4和PIF5，不依賴于EC而對(duì)葉片衰老發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[33]；在高溫條件下，ELF3對(duì)PIF4抑制作用減弱，從而加速葉片衰老[34]。據(jù)此可推測OnELF3基因在文心蘭開花和花衰老啟動(dòng)中發(fā)揮作用，但由于開花和花衰老過程中的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，OnELF3基因功能仍需進(jìn)一步研究。

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