西瓜專用瓠瓜砧木蘇砧1號種子純度的KASP鑒定

摘 要：為準(zhǔn)確、高效地鑒定西瓜專用瓠瓜砧木蘇砧1號雜交種子純度，以蘇砧1號及其親本為試驗材料，結(jié)合簡化重測序和KASP技術(shù)，篩選并獲得2個穩(wěn)定多態(tài)性KASP標(biāo)記（SNP1101和SNP1102）。利用2對KASP標(biāo)記進(jìn)行蘇砧1號的537株單株基因型檢測，并結(jié)合田間表型驗證標(biāo)記準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，該批蘇砧1號葫蘆類型砧木種子純度為99.44%，2對KASP標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果一致；并且可將蘇砧1號與其他葫蘆類型砧木品種區(qū)分開。以上結(jié)果可為高效、準(zhǔn)確地鑒定瓠瓜類型砧木品種及種子純度提供便捷的方法。

關(guān)鍵詞：西瓜；砧木；蘇砧1號；KASP標(biāo)記；純度鑒定

中圖分類號：S642.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）01-039-05

KASP marker for identification of seed purity in watermelon special bottle gourd rootstock F1 hybrid Suzhen No. 1

LIU Guang， LIU Jinqiu， YANG Xingping， ZHANG Man， YAO Xiefeng， XU Jinhua

（Institute of Vegetable， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic amp; Improvement， Nanjing 210014， Jiangsu， China）

Abstract： In order to identify the seed purity of the hybrid seeds of Suzhen No. 1， a special watermelon bottle gourd type rootstock accurately and efficiently， two stables polymorphic KASP markers （SNP1101 and SNP1102） were screened and obtained by using Suzhen No. 1 and its parental inbred lines as experimental materials， combined with simplified resequencing and KASP technology. These two KASP markers were used to detect the genotype of 537 individual plants belonging to Suzhen No. 1 and the accuracy of these markers were rigorously validated by combination with the field phenotypes. The results showed that the seed purity of this batch of Suzhen No. 1 was 99.44%， and the identification results of the two pairs of KASP markers were consistent with the result of field phenotype identification， which could be used to distinguish Suzhen No. 1 from other bottle gourd-type rootstock varieties. Above results can provide a convenient method for efficiently and accurately identifying the" bottle gourd-type rootstock varieties and seed purity.

Key words： Watermelon; Rootstock; Suzhen No. 1; KASP markers; Purity identification

瓠瓜又稱葫蘆，是西瓜嫁接栽培最常用的砧木類型之一。中國是西瓜生產(chǎn)和消費大國，西瓜產(chǎn)業(yè)在中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級與鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用[1]。近年來，連作障礙已成為阻礙西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因子，目前，嫁接是生產(chǎn)上減少西瓜連作障礙發(fā)生的最為有效的技術(shù)措施，高質(zhì)量砧木雜交種子是保證西瓜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，隨著市場上對用于不同西瓜品種嫁接的優(yōu)質(zhì)配套砧木需求逐年增加，用于西瓜嫁接的不同類型的瓠瓜砧木品種也日益增多；瓠瓜類型砧木新品種逐年增多，市場上由于“同名異種”和“同種異名”引發(fā)的知識產(chǎn)權(quán)糾紛問題時常發(fā)生[2]；同時，瓠瓜類型砧木制種過程中易出現(xiàn)母本混入、昆蟲傳粉或機械混雜等現(xiàn)象，從而嚴(yán)重降低雜交品種種子純度，因此，建立高效且準(zhǔn)確的雜交種子純度鑒定方法至關(guān)重要。

目前，用于西瓜嫁接專用瓠瓜類型砧木雜交種子純度的鑒定方法仍以田間表型性狀調(diào)查為主。然而，通過觀察田間性狀鑒定雜交種子純度，往往存在鑒定周期長、工作量大和耗費成本高等問題，同時容易受到季節(jié)和極端天氣等自然因素的影響，加大了種子純度鑒定的難度。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，不同類型DNA分子標(biāo)記逐漸成為鑒別種子純度的重要手段[3-5]。隨著不同作物、不同品種高質(zhì)量參考基因組的公布以及高通量測序成本的逐漸降低，各種類型的DNA分子標(biāo)記（AFLP標(biāo)記、Indel標(biāo)記、SSR標(biāo)記和KASP標(biāo)記等）逐漸成為高效、快速鑒別不同作物雜交種子純度的重要手段[6-7]。其中，基于KASP標(biāo)記分析具有效率更高、穩(wěn)定性更好和成本較低等優(yōu)勢，成為用于快速、高效鑒定作物品種純度的首選技術(shù)。其中，KASP標(biāo)記檢測技術(shù)具有適于規(guī)?；Y選、檢測便捷且高效的特點[8]，已在西瓜[9]、甜瓜[10]、黃瓜[11]、白菜型油菜[12]等園藝作物雜交種子純度鑒定中得到應(yīng)用。

蘇砧1號是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所自主選育的瓠瓜類雜種一代西瓜嫁接專用砧木品種，2023年通過江蘇省非主要農(nóng)作物品種認(rèn)定（證書編號2023-1-011）。該砧木品種根系發(fā)達(dá)、嫁接親和力高、結(jié)果率高、抗西瓜枯萎病、耐低溫弱光，不影響西瓜的品質(zhì)且增產(chǎn)效果明顯[13]。筆者采用隨機區(qū)組方法，以537株蘇砧1號及其親本為試驗材料，擬篩選出合適的KASP多態(tài)性標(biāo)記用于蘇砧1號雜交種純度鑒定；同時，建立基于KASP技術(shù)高效穩(wěn)定的瓠瓜類型砧木雜交種子純度鑒定體系，為瓠瓜類型砧木品種及其他瓜類作物種子純度快速鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以西瓜專用瓠瓜類型砧木品種蘇砧1號及其父本（14S-80）和母本（14S-59）為主要試驗材料，父本（14S-80）和母本（14S-59）為SLAF-seq試驗材料。其中，蘇砧1號播種537株（單株編號SZ1～SZ537）、父本和母本材料各播種20株。以上材料均進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)取樣，用于后續(xù)的提取DNA、重測序和篩選KSAP標(biāo)記。

西瓜專用瓠瓜類型砧木蘇砧3號和蘇砧4號各播種20株，其各自父本和母本（蘇砧3號父本為18S-57，蘇砧3號母本為18S-55，蘇砧4號父本為19S-68，蘇砧4號母本為19S-84）各播種5株，用于后續(xù)特異性標(biāo)記鑒定。上述試驗材料均于2023年3月播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗基地，4月初，待蘇砧1號幼苗長至2葉1心時，按照單株編號定植于塑料大棚，用于后續(xù)田間純度鑒定。以上材料均進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)取樣，用于驗證KASP標(biāo)記。

1.2 方法

1.2.1 瓠瓜基因組DNA提取 蘇砧1號537株（單株編號）、蘇砧3號和蘇砧4號各20單株取樣，3個雜交種的父本和母本均各自取樣（隨機5株混樣），3個生物學(xué)重復(fù)。選取幼嫩葉片樣品約0.5 g放置2 mL離心管并迅速置于液氮保存，采用改良CTAB法提取樣品基因組DNA[14]。測定各DNA樣品濃度后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNP特異性位點篩選 委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行蘇砧1號父本14S-80和母本14S-59簡化基因組測序，將得到的短序列reads與瓠瓜參考基因組（Lagenaria siceraria var. USVL1VR-Ls）比對，檢測親本之間SNP，通過群體SNP過濾（過濾參數(shù)：平均測序深度≥5X，最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）≥0.05，保證樣品SNP信息完整度≥0.70，SNP質(zhì)量值Q≥30，等位基因數(shù)為2）。每條染色體最終挑選1個最佳SNP進(jìn)行一代PCR測序驗證，擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

1.2.3 KASP基因分型 引物5’端添加通用熒光標(biāo)簽，F(xiàn)AM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，VIC：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。特異性引物用TE（pH 8.0）稀釋至10 μmol·L-1，按照上游分型引物F：上游分型引物V：下游通用引物R=1∶1∶3體積比混合，每5 μL反應(yīng)體系加1.25 μL引物混合物。每5 μL反應(yīng)體系中含有稀釋后的DNA樣本1.25 μL。PCR反應(yīng)體系（5 μL）：2（KASP master mix （FLU-ARMS for KASP 2×PCR Mix V4）2.5 μL、引物混合物1.25 μL和DNA樣本1.25 μL，96孔PCR板（云賀生物，PC01-TW）進(jìn)行封膜、振蕩和離心，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s；55～61 ℃退火延伸60 s，10個循環(huán)，每個循環(huán)的退火溫度降低0.6 ℃；95 ℃變性20 s；55 ℃ 退火延伸60 s，27個循環(huán)；25 ℃讀取結(jié)果30 s。通過CFX Connect熒光定量PCR進(jìn)行分型檢測。x軸和y軸分別代表HEX熒光信號和FAM熒光信號，根據(jù)熒光信號值對樣品進(jìn)行聚類分簇，分析樣品簇，確定位點基因型。

1.2.4 種子純度及標(biāo)記特異性鑒定 以537株蘇砧1號及其父本和母本DNA樣品為模板，利用熒光定量PCR系統(tǒng)（CFX ConnectTM Real-Time System，BIO-RAD）檢測特異性多態(tài)性KASP的等位基因分型結(jié)果，均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，鑒定蘇砧1號種子純度。以蘇砧3號和蘇砧4號及其各自父本和母本DNA樣品為模板，將熒光定量PCR檢測特異性多態(tài)性KASP的等位基因分型結(jié)果，鑒定KASP標(biāo)記在其他瓠瓜砧木品種中的特異性。

1.2.5 田間性狀鑒定 2023年7月底，對田間父本、母本和蘇砧1號的果實性狀進(jìn)行鑒定。每隔7 d進(jìn)行1次田間果實性狀調(diào)查，共計3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇砧1號純度鑒定引物篩選

通過比對篩選蘇砧1號父本14S-80和母本14S-59簡化基因組重測序中的SNP差異位點，開發(fā)用于鑒定蘇砧1號種子純度的KASP標(biāo)記。挑選不同染色體或相同染色體不同位置的親本間具有穩(wěn)定多態(tài)性差異的SNP，共篩選出38個SNP差異位點，其中10個SNP位點在親本間分型良好。通過一代測序驗證以及KASP分型，最終在10個SNP中篩選出等位基因分型結(jié)果穩(wěn)定且物理位置較遠(yuǎn)的2個KASP標(biāo)記，分別編號為SNP1101、SNP1102，作為蘇砧1號種子純度鑒定的引物（圖1，表1）。

2.2 蘇砧1號種子純度的鑒定及田間性狀調(diào)查

KASP標(biāo)記SNP1101、SNP1102在蘇砧1號及其雙親的分型結(jié)果見表2。其中，標(biāo)記SNP1101在蘇砧1號、父本和母本中的基因型分別為CT、TT和CC，標(biāo)記SNP1102在蘇砧1號、父本和母本中的基因型分別為TA、AA和TT。利用上述2個SNP位點開發(fā)的KASP標(biāo)記進(jìn)行537株蘇砧1號種子純度鑒定。如圖2所示，標(biāo)記SNP1101（圖2-a）和標(biāo)記SNP1102（圖2-b）具體等位基因分型如下：在537株蘇砧1號單株中，534個單株為父母本互補雜合基因型（標(biāo)記SNP1101基因型為CT、標(biāo)記SNP1102基因型為TA），3株蘇砧1號單株與母本帶型一致。結(jié)果表明，該批蘇砧1號葫蘆類型砧木種子純度為99.44%。

為進(jìn)一步驗證KASP標(biāo)記的準(zhǔn)確性，田間調(diào)查統(tǒng)計了上述537株蘇砧1號單株果實形狀。蘇砧1號及其父本果實呈長棒狀，母本果實呈瓢形，果實形狀可用于田間區(qū)分蘇砧1號及其親本。通過對上述537株蘇砧1號單株果實形狀田間調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)534株果實形狀一致，呈長棒狀，僅編號SZ112、SZ250和SZ301的3個單株果實呈瓢形，與母本高度一致。因此，田間調(diào)查顯示該批蘇砧1號的種子純度為99.44%，結(jié)果與2對KASP標(biāo)記鑒定結(jié)果一致。

2.3 KASP標(biāo)記在其他砧木父母本及雜交種中的驗證

2個KASP標(biāo)記在蘇砧3號和蘇砧4號及其各自父本和母本中的等位基因分型結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，SNP1101位點在蘇砧3號和蘇砧4號中等位基因型均與親本一致，均為CC；SNP1102位點在蘇砧3號雜交種中的基因型為TA、親本間基因型均為AA，無法區(qū)分蘇砧3號父母本，而蘇砧4號親本和雜交種的基因型均為AA。因此，兩個標(biāo)記均無法進(jìn)行蘇砧3號和蘇砧4號親本和雜交種子鑒定。由此說明，KASP標(biāo)記SNP1101和SNP1102為蘇砧1號雜交種子特異性鑒定引物，通過標(biāo)記SNP1101和標(biāo)記SNP1102能夠?qū)⑻K砧1號與其他瓠瓜類型砧木品種和雜交種區(qū)分開。

3 討論與結(jié)論

高質(zhì)量的雜交種子是實現(xiàn)作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和高效的物質(zhì)基礎(chǔ)，雜交種子純度是衡量種子品質(zhì)的重要指標(biāo)。筆者結(jié)合基因型和田間性狀鑒定，驗證了2個標(biāo)記的準(zhǔn)確性及有效性。前人研究表明，同時利用2～4個穩(wěn)定多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行品種純度鑒定試驗，可以有效防止因單個標(biāo)記選擇不當(dāng)?shù)犬a(chǎn)生的偶然誤差[3，15]。KASP標(biāo)記SNP1101和SNP1102分別位于瓠瓜1號染色體前端和7號染色體末端，且遺傳距離較遠(yuǎn)，可有效避免連鎖標(biāo)記導(dǎo)致的鑒定結(jié)果差異，進(jìn)而提高蘇砧1號純度鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

KASP技術(shù)在多種作物雜種F1代純度鑒定和品種鑒定中得到應(yīng)用，由于KASP具有準(zhǔn)確率高和可信度高等優(yōu)勢，前期通過結(jié)合田間表型性狀驗證KASP標(biāo)記準(zhǔn)確性，后期可以取代傳統(tǒng)田間表型性狀鑒定[16-18]。Shen等[19]通過對372份青花菜種質(zhì)全基因組SNP的篩選及遺傳多樣性分析，篩選出28個KASP標(biāo)記可用于青花菜種質(zhì)的種子和品種純度鑒定。馮子珊等[2]利用KASP 技術(shù)通過對浙蒲9號的91株F1代雜交種及其親本進(jìn)行基因分型和種子純度鑒定，結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果一致。在本研究中，利用KASP標(biāo)記SNP1101和標(biāo)記SNP1102對蘇砧1號的537株單株基因型鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果一致，由此表明2個標(biāo)記可用于蘇砧1號種子純度的快速高效鑒定。

綜上所述，筆者通過KASP技術(shù)對瓠瓜類型砧木蘇砧1號及其親本基因分型的結(jié)果表明， KASP標(biāo)記SNP1101和SNP1102對537個蘇砧1號單株純度鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果一致，該批蘇砧1號種子純度為99.44%。SNP1101和SNP1102 KASP標(biāo)記的開發(fā)，可為蘇砧1號種子的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為促進(jìn)西瓜專用砧木種業(yè)健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。

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