馬鈴薯StSUT2基因啟動子克隆及表達分析

摘" " 要：植物蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporter，SUT）主要介導蔗糖質(zhì)外體運輸，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。為探討馬鈴薯蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因StSUT2的表達模式，通過TOPO定向克隆了StSUT2基因上游1700 bp啟動子序列，對其進行生物信息學分析；并利用熒光定量PCR技術檢測了StSUT2基因在不同組織器官、不同光照時間下的表達特性。結果表明，馬鈴薯StSUT2啟動子區(qū)域內(nèi)存在多個光響應元件以及脫落酸等激素和脅迫響應元件；StSUT2基因于光照 4 h后在花和老葉中表達量較高；光照16 h后在花中表達量最高；此外，StSUT2在雄蕊和雌蕊中的表達量顯著高于全花。綜上，StSUT2在花器官尤其在花蕊組織的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。研究結果可為深入研究馬鈴薯StSUT2的生物學功能提供參考。

關鍵詞：馬鈴薯；StSUT2啟動子；克??；表達模式

中圖分類號：S532 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）01-025-06

Promoter cloning and expression analysis of sucrose transporter gene StSUT2 in potato

GONG Huiling， YANG Yaqian， LIANG Jinyong， TIAN Ze， FENG Zaiping， BAO Jingting

（School of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou 730050， Gansu， China）

Abstract： Plant sucrose transporter（SUT）mainly mediates the transport of sucrose extracellular vesicles and plays an important role in plant growth and development. To investigate the expression characteristics of sucrose transporter gene StSUT2， cloned the upstream 1700 bp promoter sequence of the StSUT2 gene using TOPO and performed bioinformatics analysis on it; and the expression pattern of StSUT2 gene in different organs and tissues after different light time was analyzed by qRT-PCR technology. The results showed that there are several photo-responsive elements， and other response elements such as abscisic acid， salicylic acid， auxin， anaerobic induction， defense and stress response in StSUT2 promoter region. StSUT2 has the highest expression level in flowers and old leaves after 4 h lighting， and in flowers after 16 h lighting， while StSUT2 has a certain expression level in young leave， mature leave， stem， root and stolon. Except for the old leave， StSUT2 expression level in various organs and tissues is not significantly affected by the light time. Furthermore， StSUT2 expression level was significantly higher in stamen and pistil than in whole flower， which suggests that StSUT2 plays an important role in the development of flower organs， especially in stamen tissue. These results provide a reference for intensive investigation of the biological function of StSUT2.

Key words： Potato; StSUT2 promoter; Cloning; Expression pattern

蔗糖是高等植物光合作用的產(chǎn)物，為植物的生長發(fā)育提供了主要的碳源和能源。在蔗糖的質(zhì)外體轉(zhuǎn)運途徑中，植物蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporter/sucrose cotransporter， SUT/SUC）作為一類具有蔗糖轉(zhuǎn)運活性的載體介導蔗糖的裝載、運輸和卸載[1-3]。植物SUTs屬于跨膜結合蛋白，屬于目前已知的最大膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族之一的易化擴散載體超家族（major facilitator superfamily， MFS）[4]?；诟叩戎参镎崽寝D(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列同源性及蔗糖親和力的分析，Kühn和Grof[5]將SUT蛋白分為SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5五個亞族，其中SUT3和SUT5為單子葉植物所特有。辣椒[6]和茶樹[7]中分別鑒定出4種和7種SUTs基因，且具有組織特異性。Frost等[8]研究表明，干擾PtaSUT4基因的表達，影響源庫蔗糖分配致使楊樹葉片萎蔫、發(fā)育遲緩。植物SUTs不僅在植株生長發(fā)育、花器官發(fā)育[9-10]和結果率[11]、籽粒質(zhì)量[12]等方面發(fā)揮重要作用，且參與了植物對非生物和生物脅迫的響應和調(diào)控。在低溫脅迫下，玉米的ZmSUT4基因在不同組織中表達量相較于未處理時，至少上升2倍，揭示了ZmSUT4響應玉米低溫耐受性[13]；李寧等[6]發(fā)現(xiàn)CaSUTs基因在辣椒響應低溫脅迫時被誘導。干旱脅迫下大豆幼苗葉片和根系的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSUT2表達水平上調(diào)[14]。鹽脅迫下馬鈴薯根、莖和葉中的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因StSUT2也被誘導表達，且StSUT2在煙草中超表達后增強了耐鹽性[15]；在擬南芥中過表達GmSUT4.2，有助于緩解鹽脅迫造成的損傷[16]；在大豆GmSUT4.2基因和西瓜ClSUT基因的啟動子中發(fā)現(xiàn)激素和逆境響應等作用元件，過表達后大豆和西瓜對鹽脅迫的耐受性增強[16-17]；過量表達小麥蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因TaSUT1A增強了耐旱性[18]。因而，推測SUTs可能參與干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫的響應和調(diào)控。此外，SUTs在植物與微生物的互作中也發(fā)揮了重要作用[19]，水稻蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因OsSUT2被敲除后，突變體植株對稻瘟病和白葉枯病的抗病性減弱[20]；大豆蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSUT1過表達后，根瘤數(shù)增加，而GmSUT1干擾表達后蔗糖的運輸受損，表明GmSUT1在蔗糖轉(zhuǎn)運到根瘤及共生固氮中發(fā)揮作用[21]；番茄SlSUT2能夠影響根際叢枝菌根真菌的形成[22-24]。

目前，在馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）中共鑒定到3種蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，分別為StSUT1、StSUT2和StSUT4。下調(diào)StSUT1的表達會阻礙蔗糖在質(zhì)外體中的長距離運輸，導致植株生長減緩，葉片中可溶性糖和淀粉大量積累，并影響塊莖早期形成階段的鮮質(zhì)量（數(shù)量不變但形態(tài)縮?。?，表明StSUT1對馬鈴薯的蔗糖吸收和塊莖形成具有重要作用[25]。通過RNA干擾技術抑制馬鈴薯StSUT4的表達，發(fā)現(xiàn)StSUT4影響馬鈴薯莖的伸長、避蔭反應、開花時間、結薯以及乙烯的產(chǎn)生等[26-27]。謝海娟等[15]及Gong等[29]克隆了馬鈴薯StSUT2基因，發(fā)現(xiàn)該基因的CDS長度為1818 bp，編碼605個氨基酸。Gong等[29]通過RNA干擾技術抑制馬鈴薯StSUT2的表達發(fā)現(xiàn)，StSUT2參與調(diào)控馬鈴薯的生長、開花時間和結薯。筆者采用PCR技術克隆了馬鈴薯StSUT2基因啟動子序列，并分析了StSUT2基因在不同器官和不同光照時間下的表達模式，以期為深入研究馬鈴薯StSUT2的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年3－10月在蘭州理工大學生命科學與工程學院實驗平臺進行。試驗材料為馬鈴薯品種Atlantic組培苗，用于提取馬鈴薯基因組DNA；馬鈴薯品種Shepody盆栽苗，用于提取不同器官組織RNA。材料均由蘭州理工大學生命科學與工程學院植物逆境生理生態(tài)實驗室保存。隨機取樣且至少3盆混樣，每個時間點每個器官組織樣品設置3個重復。

E.coli DH 5α感受態(tài)細胞由蘭州理工大學植物逆境生理生態(tài)實驗團隊保存。PrimeSTAR HS（Premix）、DL5000 DNA maker、PrimeScript? RT Master和MixTB GreenTM Premix Ex TaqTM II試劑盒購自TaKaRa公司；Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、RNase A（10 mg·mL-1）、Trizol總RNA提取試劑盒（UNIQ-10柱式）和氯仿購自生工生物工程（上海）股份有限公司，ENTR?/D-TOPO?克隆試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 PCR引物設計

從http：//spuddb.uga.edu/數(shù)據(jù)庫中獲得馬鈴薯StSUT2基因上游約2000 bp的序列，以及StSUT2 cDNA序列，使用軟件oligo7設計引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 馬鈴薯DNA的提取和StSUT2基因啟動子片段的克隆

以馬鈴薯組培苗葉片和根組織為材料，液氮速凍后研磨成粉，依據(jù)Ezup DNA抽提試劑盒的使用標準進行DNA規(guī)范提取。

以上述提取的DNA為模板，PCR擴增StSUT2基因啟動子片段。PCR反應體系：PrimerSTAR HS （Premix） 25 μL，StSUT2-Promoter-F/R各2 μL，DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，設置35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目的片段。根據(jù)定向克隆的方法將目的片段與pENTR-TOPO載體在PCR管中混合冰浴10 min進行連接，連接結束后轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細胞進行抗生素篩選培養(yǎng)。通過菌落PCR篩選出陽性質(zhì)粒菌株進行測序、比對。

1.4 啟動子序列分析

使用在線工具PlantCARE（http：//binioformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/html/）分析克隆的StSUT2基因啟動子片段及其順式作用元件等信息。

1.5 StSUT2的表達特性分析

按照田澤[28]和梁金永[30]的方法，馬鈴薯品種Shepody盆栽苗待盛花期時，分別在光照4 h 和16 h時，采集功能葉、幼葉、老葉、莖、花、根、匍匐莖等組織器官以及光照4 h的雄蕊、雌蕊、花萼和花冠，立即液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱以備提取總RNA。用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR反應。實時熒光定量PCR儀來自蘇州雅睿生物技術有限公司。反應體系為：TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，引物各0.4 μL（表1），cDNA模板1.0 μL，RNase-free H2O 3.2 μL。反應程序：95 ℃ 30 sec；95 ℃ 5 sec，60 ℃ 32 sec，循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。利用IBM SPSS Statistis 22（版本號22.0.0.0.202）軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用Duncan檢驗法對顯著性差異（plt;0.05）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯StSUT2基因啟動子片段的克隆

對馬鈴薯品種Atlantic的基因組DNA進行PCR擴增后，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物結果顯示，在1500～2000 bp范圍內(nèi)觀察到清晰的條帶（圖1），與預期的理論片段大小一致。測序結果表明，StSUT2基因啟動子長度為1700 bp，與馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫檢索獲得的序列基本一致，序列同源性為99.2%，證明成功克隆了StSUT2基因啟動子序列。

2.2 馬鈴薯StSUT2基因啟動子的序列分析

使用PlantCARE在線工具分析克隆的StSUT2啟動子序列，結果顯示，該啟動子區(qū)域除了含有TATA-box和CAAT-box等定位轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率等啟動子特征序列元件外，還含有較多光響應元件，如AE-box、Box4、G-Box、GATA-motif、GT1-motif、TCT-motif和TCCC-motif等，此外，還含有脫落酸、水楊酸、生長素、厭氧誘導、防御和應激反應等激素和脅迫響應元件（表2）。

2.3 馬鈴薯StSUT2基因在不同組織器官和不同光照時間下的表達分析

為了探究馬鈴薯StSUT2基因的表達特性，通過熒光定量PCR方法檢測了馬鈴薯植株在光照4 h和16 h后，StSUT2基因在幼葉、成熟葉、老葉、花、莖、根、匍匐莖等組織器官的相對表達量。結果如圖2所示，在光照4 h后，StSUT2在老葉和花中的表達量較高，分別是成熟葉片中表達量的3.2倍和3.4倍，差異顯著；光照16 h后，StSUT2在花中表達量仍最高，是成熟葉片中表達量的3.1倍，差異顯著；在光照4和16 h后，StSUT2在成熟葉、幼葉、莖、根和匍匐莖等組織器官中均有表達，但差異不顯著；除老葉外，StSUT2在各器官組織中的表達量受光照時間的影響差異不顯著。

2.4 馬鈴薯StSUT2基因在花器官不同組織中的表達分析

為了分析馬鈴薯StSUT2在花器官不同組織中的表達特性，檢測了全花、花柄、花萼、花冠、雄蕊和雌蕊中StSUT2的表達量。結果如圖3所示，雄蕊和雌蕊中StSUT2基因表達量顯著高于全花，其中雄蕊和雌蕊分別為全花的4.2倍和9.1倍，而花柄、花萼及花冠的表達量與全花無顯著差異。以上結果表明，StSUT2基因主要在馬鈴薯花蕊中表達。

3 討論與結論

植物蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在蔗糖的轉(zhuǎn)載、運輸和卸載等過程中起著不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SUTs在植物響應生物脅迫和非生物脅迫中也扮演著重要的角色[1]。筆者成功克隆了馬鈴薯StSUT2基因的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)該啟動子含有脫落酸、水楊酸、生長素、厭氧誘導、防御和應激反應等響應元件，表明馬鈴薯StSUT2基因在應答生物脅迫和非生物脅迫中可能發(fā)揮一定的生理功能。Chincinska等[27]研究表明，馬鈴薯蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因在葉片中的表達受光周期的影響而略有波動，其中，StSUT1和StSUT4在光照階段的中期表達量較高，而StSUT2在光照的初期表達量較高。本研究表明，馬鈴薯StSUT2基因的啟動子序列中含有較多光響應的順式作用元件，推測StSUT2基因可感受光信號。但筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，光照16 h與4 h相比，除了老葉中的StSUT2表達量顯著下降外，其他組織中StSUT2的表達量均無顯著差異，即未受光照時間的影響，這可能是因為光照4 h后，StSUT2已被光誘導表達，而持續(xù)光照并不會繼續(xù)誘導StSUT2的表達。今后需設計黑暗處理或在光周期的黑暗階段取樣，來檢測和驗證馬鈴薯StSUT2是否受光信號的誘導。

雙子葉植物包含SUT1、SUT2和SUT4三個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白亞族，不同SUT亞族對蔗糖的親和力和轉(zhuǎn)運能力各異[5]。SUT2最初被認為是質(zhì)膜上的蔗糖信號感應器[31]，但這一觀點缺乏有力證據(jù)，更多研究傾向于認為SUT2只是一個低親和力的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白[5]。Hackel等[32]發(fā)現(xiàn)，番茄SlSUT2在韌皮部篩管、花粉和花粉管中有表達，且在莖、幼葉和果實中少量表達。此外，SlSUT2在花藥中的表達水平高于花冠、萼片和子房；與野生型相比，SlSUT2表達下調(diào)的轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出較低的花粉萌發(fā)率和較慢的花粉管生長速度，因此SlSUT2在蔗糖轉(zhuǎn)運過程中對花粉管的生長和授粉至關重要。此外，玉米OsSUT1參與調(diào)控花粉的發(fā)育[33]。本研究表明，馬鈴薯StSUT2在花中表達量較高，尤其在雄蕊和雌蕊中表達量最高，而在幼葉、成熟葉、莖、根和匍匐莖、全花、花柄、花萼、花冠等組織器官中也有一定的表達量，這一研究結果與番茄的SlSUT2基因相似。由此表明，StSUT2基因在馬鈴薯花蕊發(fā)育中可能發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，筆者成功克隆了馬鈴薯StSUT2基因啟動子序列，長度為1700 bp，含有多種光響應、激素和逆境響應順式作用元件。相較于幼葉、成熟葉、莖、根、匍匐莖和全花、花柄、花萼、花冠等組織器官，StSUT2基因在馬鈴薯花蕊中表達量較高。

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