基于Plackett-Burman設計和響應面法優(yōu)化棗花蜂蜜揮發(fā)性成分的萃取條件

摘要：為了提高蜂蜜中揮發(fā)性成分的頂空固相微萃取（head space-solid phase micro extraction，HS?SPME）效率，以便利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC?MS）對其進行更精確的定性與定量分析，以棗花（Ziziphus jujuba Mill.）蜂蜜揮發(fā)性成分的色譜圖總峰面積作為考察指標，采用Plackett-Burman（PB）設計和響應面（response surface methodology，RSM）對棗花蜂蜜的萃取條件（萃取溫度、萃取時間、樣品量、去離子水添加量、氯化鈉添加量和攪拌速度）進行優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)，萃取溫度、萃取時間和樣品量對色譜圖總峰面積影響顯著。優(yōu)化后的萃取條件為萃取溫度68.5 ℃、萃取時間51.6 min、取樣量5.1 g，在最優(yōu)萃取條件下，色譜圖總峰面積可達2.20×109 mAU·min-1。以上研究結果為蜂蜜中揮發(fā)性成分的進一步定性與定量分析提供一定的方法性指導。

關鍵詞：棗花蜂蜜；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃??；Plackett-Burman設計；響應面分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0384

中圖分類號：S896.1

文獻標志碼：A

文章編號：1008?0864（2025）01?0181?12

蜂蜜是由蜜蜂（Apis mellifera L.）采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，將其儲存于巢房中，并經(jīng)脫水、發(fā)酵和成熟等過程形成的一種天然甜味物質[1]。天然蜂蜜中含有多種揮發(fā)性物質，其主要由蜜源植物的香氣物質和蜜蜂的代謝產(chǎn)物組成。不同種類的蜂蜜揮發(fā)性物質組成不同，而且蜂蜜的產(chǎn)地、季節(jié)、儲存條件、加工方式等因素都會影響揮發(fā)性物質的組成和含量[2]。因此，對蜂蜜中揮發(fā)性物質進行分析和鑒定可以作為蜂蜜質量評價和鑒別的重要依據(jù)[3]。

常見的蜂蜜揮發(fā)性成分萃取技術包括固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）、頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HSSPME）、溶劑萃取、超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）等。SPME是一種基于無溶劑樣品預處理的技術，通過注射器內(nèi)石英纖維表面上的特殊固相涂層，對樣品揮發(fā)性成分進行萃取和富集[4?5]。HS?SPME 結合了頂空技術和SPME技術的優(yōu)點，通過加熱使樣品揮發(fā)性成分進入氣相空間，然后使用SPME纖維吸附和富集揮發(fā)性成分，最后將纖維送入氣相色譜儀進行分析[6]。研究表明，使用HS?SPME對蜂蜜中揮發(fā)性物質進行提取，再結合氣相色譜-質譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，在蜂蜜中檢測到的揮發(fā)性物質多達93種，主要為醇類、酮類、醛類、羧酸類、萜烯類、烴類、苯和呋喃衍生物等化合物[7-9]。Neggad等[10]利用HS-SPME結合GC-MS分析7種不同蜜源植物蜂蜜中的揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，各組蜂蜜樣品的揮發(fā)性成分存在較大差異，可以作為鑒定蜜源植物和蜂蜜產(chǎn)地的特定標志。Igor等[11]利用HS-SPME法和超聲波萃取法對馬哈利櫻桃（Prunus mahaleb L.）蜂蜜中的揮發(fā)性成分進行萃取，再結合GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，香豆素可作為該種蜂蜜的潛在生物標志物。為更準確、高效地萃取蜂蜜中揮發(fā)性成分，分析其組成和含量，需對萃取條件進行優(yōu)化。以往的研究多采用逐因子試驗來改變1個因素以比較各因素選定水平的優(yōu)劣，但這種方法無法提供未考察區(qū)域的信息。相比之下，Plackett-Burman（PB）法可以通過較少的試驗次數(shù)篩選出對試驗結果最重要的因素[12]。在PB設計中，每個因素都被分配到2個水平，通常為高水平和低水平，然后在每個試驗中選擇其中1種水平，通過對試驗結果的分析篩選出對蜂蜜揮發(fā)性成分含量最具影響的因素[13-15]；然后通過響應面（response surface methodology，RSM）法對篩選出的因素進行優(yōu)化，通過對響應變量的測定和分析，建立響應變量與試驗因素之間的數(shù)學模型，利用統(tǒng)計學方法對模型進行分析和求解，從而確定最佳的萃取條件，以獲得最高的揮發(fā)性成分含量[16-18]。

本研究將PB 法和RSM 法相結合，對棗花蜂蜜揮發(fā)性成分的HS?SPME萃取條件進行優(yōu)化，以確定蜂蜜樣品揮發(fā)性成分的HS?SPME萃取最佳條件，為其揮發(fā)性成分進一步高效、準確的分析提供方法性指導。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

棗花蜂蜜樣品于2022年6月采集于甘肅省臨澤縣養(yǎng)蜂場（39°15′26″N、100°16′44″E）。采樣時養(yǎng)蜂場周圍的主要開花植物為棗樹，且處于盛花期，種植面積約30 hm2。樣品采集后密封，在室溫下輕搖10 min至均勻狀態(tài)，備用，其基本理化指標如表1所示。

1.2 儀器與試劑

試驗儀器包括電子天平（AR5120，美國Ohaus公司）、氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（7890A GC/5975C MS，美國Agilent 公司）、手動固相微萃取裝置、50/30 μm 萃取纖維頭（DVB/CAR/PDMS，美國Supelco 公司）、加熱磁力攪拌器（PC-420D，美國Corning公司）；氯化鈉為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 萃取纖維老化

50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取纖維頭在首次使用時需在氣相色譜圖的進樣口老化，溫度為270 ℃，時間為1 h，直至空載時色譜圖無干擾峰出現(xiàn)，之后每使用8～10次需老化1次[19]。

1.4 頂空固相微萃取

準確稱取一定質量的蜂蜜樣品于15.0 mL頂空瓶中，在預先設定好溫度的加熱磁力攪拌器上平衡一定的時間，將老化好的固相微萃取針插入樣品瓶中大約1 cm處（不要接觸到樣品，以免污染針頭），推出萃取頭，在設定溫度下頂空吸附預制時間，收進萃取頭后，拔出針頭，迅速插入氣相進樣口（萃取頭每次插入襯管的長度需保持不變，確保試驗的可重復性），250 ℃下解析一定時間。

1.5 GC-MS 分析條件

GC 條件：HP-5MS 毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2.0 min，然后以4 ℃·min-1 的速率升溫到160 ℃，保持2.0 min，再以10 ℃·min-1 升溫至250 ℃，保持5.0 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純度氦氣（純度≥99.999%）；恒流流速1.5 mL·min-1；壓力11.962 psi；整個模式采用不分流進樣[8， 20?21]。

MS 條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，掃描質荷比（m/z）范圍55～500[8， 22]。

1.6 單因素試驗設計

1.6.1 萃取溫度優(yōu)化

分別將萃取溫度設置為40、50、60、70和80 ℃，固定萃取的樣品量為5.0 g、去離子水添加量為0.5 g、氯化鈉添加量為0.3 g、攪拌速度為650 r·min-1、萃取時間為50 min，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同萃取溫度對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.6.2 萃取時間優(yōu)化

分別將萃取時間設置為20、30、40、50 和60 min，固定萃取的樣品量為5.0 g、去離子水添加量為0.5 g、氯化鈉添加量為0.3 g、攪拌速度為650 r·min-1、萃取溫度為60 ℃，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同萃取時間對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.6.3 樣品量優(yōu)化

分別將萃取樣品量設置為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g，固定萃取的去離子水添加量為0.5 g、氯化鈉添加量為0.3 g、攪拌速度為650 r·min-1、萃取溫度為60 ℃ 、萃取時間為50 min，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同的樣品量對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.6.4 去離子水添加量優(yōu)化

分別將萃取時的去離子水添加量設置為0.0、0.5、1.0、2.5和5.0 g，固定萃取的樣品量為5.0 g、氯化鈉添加量為0.3 g、攪拌速度為650 r·min-1、萃取溫度為60 ℃、萃取時間為50 min，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同去離子水添加量對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.6.5 氯化鈉添加量優(yōu)化

分別將萃取時的氯化鈉添加量設置為0.0、0.3、0.6、0.9和1.2 g，固定萃取的樣品量為5.0 g、去離子水添加量為0.5 g、攪拌速度為650 r·min-1、萃取溫度為60 ℃、萃取時間為50 min，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同的氯化鈉添加量對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.6.6 攪拌速度優(yōu)化

分別將萃取時的攪拌速度設置為350、500、650、800和950 r·min-1，固定萃取的樣品量為5.0 g、去離子水添加量為0.5 g、氯化鈉添加量為0.3 g、萃取溫度為60 ℃、萃取時間為50 min，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，比較不同攪拌速度對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響。

1.7 Plackett-Burman 試驗設計

基于前期單因素試驗結果，確定萃取溫度（A）、萃取時間（B）、樣品量（C）、去離子水添加量（D）、氯化鈉添加量（E）和攪拌速度（F）6個因素作為考察因素，以色譜圖總峰面積作為衡量指標，每個考察因素取2個水平，即低水平（-1）和高水平（+1），通過Plackett?Burman試驗設計（表2），篩選顯著影響蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的因素。

1.8 Box-Benhnken 響應面設計

以Plackett?Burman 法篩選得到的顯著影響蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的因素為基礎，即萃取溫度（A）、萃取時間（B）和樣品量（C），應用Box-Benhnken 中心組合試驗設計的方法進行響應面分析，試驗因素與水平設計如表3所示，以色譜總峰面積作為響應值，優(yōu)化蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取參數(shù)[23?24]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次。氣相色譜-質譜聯(lián)用儀數(shù)據(jù)使用軟件Qualitative Analysis 10.0（美國Agilent公司）進行積分，統(tǒng)計總峰面積。使用GraphpadPrism 9.0（美國GraphPad 公司）軟件制圖，利用Minitab 16.0（美國Minitab公司）軟件進行Plackett-Burman試驗設計及數(shù)據(jù)分析，利用Design-Expert（美國Stat-Ease公司）軟件進行響應面分析，使用SPSS 27.0軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析。

2 結果與分析

2.1 萃取條件對棗花蜂蜜中揮發(fā)性成分萃取效果的影響

2.1.1 萃取溫度

棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同萃取溫度下的萃取效果如圖1 所示。萃取溫度為40 ℃時，萃取纖維吸附待測組分較少，色譜圖總峰面積偏??；萃取溫度從40 ℃升至60 ℃的過程中，峰面積總體呈先減小后增大趨勢，可能是萃取溫度的升高加快了物質的擴散和對流，使氣相中組分含量升高[25]；當萃取溫度為60 ℃時，頂空瓶環(huán)境達到平衡，萃取纖維處于飽和狀態(tài)，總峰面積達到最大值，且顯著大于40、50和70 ℃處理。隨著溫度繼續(xù)升高至80 ℃，總峰面積呈減小趨勢，可能是沸點低的物質在與沸點高的物質競爭中損失，導致萃取纖維的吸附能力降低，某些揮發(fā)性成分脫附[26?27]。綜上所述，60 ℃為最佳萃取溫度，因此選擇50、60、70 ℃進行萃取溫度響應面優(yōu)化試驗。

2.1.2 萃取時間

萃取時間是萃取達到平衡所需的時間，由揮發(fā)性成分的分配系數(shù)、擴散速率、樣品基質、體積、萃取纖維頭的膜厚、吸附能力以及涂層的物理化學性質等因素共同決定。棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同萃取時間下的萃取效果如圖2所示。當萃取時間為20～50 min時，揮發(fā)性成分很容易富集到固定相涂層上，吸附量迅速增加，總峰面積隨萃取時間的延長逐漸增大[27]，其中30 min時的總峰面積顯著大于20 min時；40 min時的總峰面積與20和30 min時無顯著性差異；當萃取時間為50 min時，頂空瓶內(nèi)環(huán)境達到平衡，萃取處于飽和狀態(tài)，總峰面積達到最大值，顯著大于其他萃取時間；當萃取時間為50～60 min時，總峰面積隨萃取時間的延長逐漸減小，可能是萃取時間過長，原本被吸附的組分出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，使萃取效果降低[26]。綜上，50 min為最佳萃取時間，因此選擇40、50、60 min 進行萃取時間響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 樣品量

棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同樣品量下的萃取效果如圖3所示。當樣品量為2～5 g時，由于樣品量小，頂空體積相對較大，揮發(fā)性成分易析出，但因揮發(fā)性成分含量較少從而導致總峰面積偏小[28]；樣品量從5 g升至6 g，峰面積呈現(xiàn)下降趨勢，此過程可能是頂空體積變小，揮發(fā)性成分含量增加，使得含量高的揮發(fā)性成分吸附較多而其他成分未被吸附[29]；當樣品量為5 g時，頂空瓶環(huán)境達到平衡，萃取纖維處于飽和狀態(tài)，總峰面積最大，不同樣品量處理組間均存在顯著差異。綜上所述，5 g為最佳樣品量，因此選擇4、5、6 g進行樣品量響應面優(yōu)化試驗。

2.1.4 去離子水添加量

棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同去離子水添加量下的萃取效果如圖4所示。去離子水添加量為0.0～5.0 g時，色譜圖總峰面積呈先升高后降低趨勢，各處理組間存在顯著差異，其中去離子水添加量為0.5 g時，色譜圖總峰面積最大。這是由于蜂蜜為粘稠狀液體，加入一定量的水，可使粘度下降，有利于揮發(fā)性成分的釋放[27]；隨著去離子水添加量的繼續(xù)增加，蜂蜜中揮發(fā)性成分被稀釋，總峰面積隨之下降。綜上，0.5 g為最佳去離子水添加量，因此選擇0.0、0.5、1.0 g進行去離子水添加量響應面優(yōu)化試驗。

2.1.5 氯化鈉添加量

萃取過程中鹽離子可以增加揮發(fā)性風味物質在頂空瓶上空的含量，使其富集在萃取纖維上的量增多[26]。棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同氯化鈉添加量下的萃取效果如圖5 所示。當氯化鈉添加量從0.0～1.2 g時，總峰面積的變化趨勢隨氯化鈉添加量的增加存在一定的起伏，其中當氯化鈉添加量為0.3 g時，總峰面積最大，顯著高于除添加量為0.0 g外的其他處理。這可能是氯化鈉的過量添加影響了基質黏度，從而降低了揮發(fā)性成分的擴散速度，產(chǎn)生鹽析負效應，使萃取纖維上富集的物質減少[30]。綜上所述，0.3g為最佳氯化鈉添加量，因此選擇0.0、0.3、0.6 g進行氯化鈉添加量響應面優(yōu)化試驗。

2.1.6 攪拌速度

棗花蜂蜜揮發(fā)性成分在不同攪拌速度下的萃取效果如圖6 所示。攪拌速度從350 r·min-1 升至650 r·min-1 的過程中，峰面積總體呈現(xiàn)升高的趨勢，500 和650 r·min-1 條件下的總峰面積顯著大于350 r·min-1 處理，但500 與650 r·min-1處理間差異不顯著。這可能是由于蜂蜜樣品的粘度較大，攪拌可促進體系的均勻化，有利于揮發(fā)性成分的釋放，從而提高對揮發(fā)物的檢測效率[31]。隨著攪拌速度升至950 r·min-1，總峰面積呈先減小后上升的趨勢，且950 r·min-1時的總峰面積與500 和650 r·min-1 處理間差異不顯著，但950 r·min-1易造成HS-SPME裝置的穩(wěn)定性變差，所以650 r·min-1為最佳攪拌速度。因此，選擇650 r·min-1為響應面優(yōu)化試驗的中點。

2.2 關鍵影響因素的確定

以單因素試驗結果為基礎，確定Plackett?Burman試驗的因素和水平。由于峰個數(shù)和主要揮發(fā)性成分峰面積的變化與總峰面積的變化基本保持一致，只是在個別物質略有差異，因此以總峰面積為判定指標即響應值（Y）來分析蜂蜜中揮發(fā)性成分的萃取效果，從而篩選得到對其影響顯著的因素。由表4和表5可知，萃取溫度、萃取時間和樣品量對總峰面積影響顯著；樣品、去離子水、氯化鈉的添加量及攪拌速度對總峰面積無顯著影響。因此，選用萃取溫度、萃取時間和樣品量作為響應面分析的影響因素。

2.3 Box-Behnken 響應面分析

響應面分析方案及結果如表6所示。試驗共有15個試驗點，其中試驗號1～12為析因試驗，13～15為中心試驗，重復3次，用以估計試驗誤差。

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗

利用DesignExpert軟件，對表6的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，以色譜總峰面積（Y）為響應值，得到二次多元回歸方程如下。

Y=2.151×109+1.882×108A+3.725×107B+4.892×107C+8.547×107AB+2.106×107AC-1.437×108BC-1.201×108A2-3.059×108B2-2.524×108C2 （1）

對模型進行方差分析，結果（表7）表明，一次項A 為極顯著，B 和C 均不顯著；交互項均不顯著；平方項B2極顯著，C2顯著，A2不顯著；模型F=6.54，P=0.026，表明模型是顯著的；模型的相關系數(shù)為0.921 7，說明自變量與因變量之間的回歸關系顯著，有助于降低試驗誤差。因而擬合度良好，試驗誤差小，可以用于SPME 萃取條件優(yōu)化的理論預測。

2.3.2 因素間交互作用的影響

根據(jù)回歸分析結果，各因素間交互作用對總峰面積的影響作如圖7～9所示。3組交互作用的響應面坡度都相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響響應值的大小。等高線圖表示在同一橢圓型區(qū)域內(nèi)，總峰面積相同；在橢圓形的區(qū)域中心，總峰面積最大，由中心擴散至邊緣則總峰面積逐漸變小[32]。同時等高線的形狀可反映交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，而圓形則不顯著[33]。由圖7可知，樣品量為5 g時，隨著萃取溫度的升高，總峰面積緩慢增加；隨著萃取時間的延長，總峰面積呈先增加后有所減少的趨勢，表明兩者的交互作用不顯著。由圖8可知，萃取時間為50 min時，隨著萃取溫度的升高，總峰面積緩慢增加；隨著樣品量的增加，總峰面積呈先增加后有所減少的趨勢，表明兩者的交互作用不顯著。由圖9可知，萃取溫度為60 ℃時，隨著萃取時間的延長，總峰面積呈迅速增加后略有減少的趨勢；隨著樣品量的增加，總峰面積呈迅速增加后略有減少的趨勢。在較長萃取時間與較低樣品量區(qū)域和在較高樣品量與較短萃取時間區(qū)域，總峰面積較高，且由響應曲面投影的等高線圖為橢圓，表明萃取時間與樣品量間的交互作用較顯著，與表7的結果一致。

2.3.3 萃取條件的優(yōu)化及模型驗證

通過Expert-design軟件預測出基于HS?SPME的蜂蜜揮發(fā)性成分萃取條件優(yōu)化后為：萃取溫度68.49 ℃，萃取時間51.59 min，樣品量5.09 g，在此條件下響應面模型預測的總峰面積為2.24×109 mAU·min?1。

為了驗證方法的可靠性與重現(xiàn)性，采用優(yōu)化后的萃取條件進行揮發(fā)性成分的HS-SPME驗證試驗?？紤]到試驗操作的實際條件，將萃取的最優(yōu)條件修正為：萃取溫度68.5 ℃、萃取時間51.6 min、樣品量5.1 g。在此條件下進行4次試驗，得到總峰面積為2.20×109 mAU·min?1，與模型預測值之間的相對誤差較?。?.13%～1.84%），說明該模型可較好地用于優(yōu)化蜂蜜揮發(fā)性成分固相微萃取的萃取條件。

3 討論

揮發(fā)性成分是蜂蜜中的重要組成部分，對于蜂蜜的香氣、口感和品質有著重要影響。通過對蜂蜜中揮發(fā)性物質萃取條件的優(yōu)化可以更深入了解蜂蜜的化學成分和特性，有助于蜂蜜的質量控制和產(chǎn)品開發(fā)。

本研究以棗花蜂蜜為試驗材料，以氣相色譜峰中的總峰面積、峰個數(shù)和主要揮發(fā)物質峰面積為觀察指標，通過Plackett-Burman設計，篩選出顯著影響棗花蜂蜜揮發(fā)性成分HS-SPME萃取的3個因素，分別為萃取溫度、萃取時間和樣品量，這一結果為后續(xù)的研究提供了重要參考，有助于減少試驗次數(shù)并提高研究效率。其中，萃取溫度的高低影響揮發(fā)性成分的釋放和溶解；而萃取時間的長短則關系到萃取效率和成分的穩(wěn)定性；樣品量的選擇也是關鍵，它直接影響萃取液的濃度和成分的溶解度。本研究利用響應面法進一步確定最優(yōu)萃取條件為萃取溫度68.5 ℃ 、萃取時間51.6 min、樣品量5.1 g。在此最佳條件下，總峰面積可達2 204 894 036 mAU·min?1。經(jīng)試驗驗證后，預測結果與驗證結果較吻合，說明回歸方程可以較好地應用于蜂蜜揮發(fā)性成分HS-SPME萃取效率的預測。篩選出的最優(yōu)萃取溫度與蔡秋萍等[8]的研究結果相符合，既能充分地體現(xiàn)蜂蜜揮發(fā)性物質的種類，又能不產(chǎn)生新的物質。此外，本研究還探討了不同因素之間交互作用對萃取效果的影響，發(fā)現(xiàn)萃取時間與樣品量間存在顯著的交互作用，這一結果有助于深入理解萃取機制，為蜂蜜中揮發(fā)性成分進一步GC-MS的定性與定量分析提供一定的方法性指導。

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基金項目：國家蜜蜂產(chǎn)業(yè)技術體系項目（NYCYTI-43-KXJ17）。