花椒籽粕蛋白質(zhì)的酶提工藝研究

摘要：為高值化利用花椒加工業(yè)的副產(chǎn)物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）籽粕，采用酶解法對花椒籽粕蛋白質(zhì)的提取進(jìn)行了研究?？疾炝嗣柑砑恿?、酶解溫度、酶解時間、pH值對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率的影響。進(jìn)一步通過正交試驗確定了復(fù)合蛋白酶提取花椒籽粕蛋白質(zhì)的優(yōu)化工藝為酶添加量0.04%、酶解溫度50℃、酶解時間6 h、pH值12.0，此時蛋白質(zhì)回收率為（96.98±0.24）%。正交試驗優(yōu)化得到的工藝可有效提高花椒籽粕蛋白質(zhì)的提取率，結(jié)果重復(fù)性好、穩(wěn)定可行，可為今后合理利用該資源提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：花椒籽粕蛋白質(zhì)；酶解法；提取工藝

中圖分類號：TS201.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0206-04

Study on Enzymatic Extraction Process of Zanthoxylum bungeanum Maxim. Seed Meal Protein

WANG Lu¹， CAI Lei¹， LIU Qi-hua²， CUI Chun^1*

（1.College of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou 510641， China; 2.Anhui Yanzhifang Food Co.， Ltd.， Hefei 230001， China）

Abstract： In order to achieve high-value utilization of the by-product Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal in Zanthoxylum bungeanum Maxim. processing industry， the extraction of protein from Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal by enzymatic method is studied. The effects of enzyme addition amount， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time， pH value on the recovery rate of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein are investigated. Further， through orthogonal test， the optimal process for extracting protein from Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal by complex protease is determined as follows： the enzyme addition amount is 0.04%， the enzymatic hydrolysis temperature is 50℃， the enzymatic hydrolysis time is 6 h， and the pH value is 12.0， at this time， the protein recovery rate is （96.98±0.24）%. The process optimized by orthogonal test can effectively improve the extraction rate of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein. The results have good repeatability， stability and feasibility， which can provide a basis for the rational utilization of Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal resource in the future.

Key words： Zanthoxylum bungeanum Maxim. seed meal protein; enzymatic method; extraction process

收稿日期：2024-07-22

基金項目：廣東省普通高校特色創(chuàng)新類項目（2021KTSCX003）

作者簡介：王露（2000—），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：崔春（1978—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

花椒是我國重要的調(diào)味品、中藥材和香料，目前人們主要食用從花椒果殼和花椒葉等部位所提取的花椒精油^[1-2]?；ń纷迅缓伙柡椭舅?、蛋白質(zhì)、膳食纖維、黑色素等物質(zhì)，可進(jìn)一步提取制備高價值產(chǎn)品^[3-7]。花椒籽粕是花椒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，脫脂后的花椒籽粕蛋白質(zhì)含量達(dá)到70%，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中富含呈味肽和活性肽序列，富含谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸^[8]，且具有價格低、產(chǎn)量大的特點，可作為一種優(yōu)質(zhì)、無毒的新型植物蛋白質(zhì)資源。對花椒籽粕蛋白質(zhì)進(jìn)一步水解，可得到呈味肽、抗疲勞肽、降血壓肽和抗氧化肽等功能性多肽，在食品添加劑和保健食品等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)利用前景^[9-10]。

目前國內(nèi)已有多種提取花椒籽粕蛋白質(zhì)的工藝。馬寅斐等^[11]以脫油后的花椒渣料為原料，采用堿提酸沉工藝制得蛋白質(zhì)含量為78.23%的花椒蛋白粉。呂俊霞^[12]以堿溶酸析法提取花椒籽蛋白質(zhì)，提取率達(dá)33.40%。宋燕^[13]選用復(fù)合蛋白酶提取花椒籽蛋白質(zhì)，得率為77.21%。姜歡笑等^[14]通過水相酶解法提取花椒冷榨餅中蛋白質(zhì)，提取率為56.49%。李超^[15]采用鹽提法提取花椒籽仁中蛋白質(zhì)，提取率可達(dá)88.77%。然而，這些花椒籽粕蛋白質(zhì)提取方法效率低，蛋白質(zhì)回收率低，生產(chǎn)肽類產(chǎn)品成本高，因此，目前大部分花椒籽粕主要被用作飼料或肥料，既造成資源浪費，又導(dǎo)致環(huán)境污染，故深入研究花椒籽粕并使其得到合理充分的利用已成為我國花椒產(chǎn)業(yè)面臨的一項新挑戰(zhàn)。

本文采用酶法提取花椒籽粕中的蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)，通過單因素試驗確定提取花椒籽粕蛋白質(zhì)的酶解條件，并通過正交試驗優(yōu)化提取工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

花椒籽粕：陜西為康生物科技股份有限公司；復(fù)配蛋白酶胰酶1-12（4 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；氫氧化鈉：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

EXD-2202B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；PHS-3E pH計 上海雷磁儀器廠；THZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；HYP-308消化爐、KDN-103F凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)回收率的測定

稱取適量花椒籽粕粉末或酶解液，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定花椒籽粕和酶解液的蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)回收率的計算公式如下：

蛋白質(zhì)回收率（%）=酶解液總質(zhì)量（g）×酶解液蛋白質(zhì)含量（%）/所取花椒籽粕質(zhì)量（g）×花椒籽粕蛋白質(zhì)含量（%）×100%。

1.3.2 水解度的測定

采用甲醛滴定法^[16]測定酶解產(chǎn)物的水解度，計算公式如下：

水解度（%）=上清液中氨基酸態(tài)氮含量（%）/所取樣品中總氮含量（%）×100%。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酶添加量對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分別置于5個250 mL錐形瓶中，按酶解溫度50℃、酶解時間6 h、料液比1∶8、酶添加量（以反應(yīng)液總質(zhì)量計）0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%進(jìn)行酶解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，沸水滅酶15 min，冷卻后以10 000 r/min離心15 min，收集上清液后記錄各樣品上清液總重。分別取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，計算蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，計算氨基酸態(tài)氮含量和水解度，確定最適酶添加量。

1.3.3.2 酶解溫度對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分別置于5個250 mL錐形瓶中，按酶添加量0.08%（以反應(yīng)液總重量計）、酶解時間6 h、料液比 1∶8、酶解溫度45，50，55，60，65℃進(jìn)行酶解。反應(yīng)結(jié)束后，沸水滅酶15 min，冷卻后離心（10 000 r/min，15 min），收集上清液后記錄各樣品上清液總重。分別取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，計算蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，計算氨基酸態(tài)氮含量和水解度，確定最適酶解溫度。

1.3.3.3 酶解時間對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分別置于5個250 mL錐形瓶中，按酶添加量0.08%（以反應(yīng)液總質(zhì)量計）、酶解溫度50℃、料液比 1∶8、酶解時間 3，6，9，12，15 h進(jìn)行酶解。反應(yīng)結(jié)束后，沸水滅酶15 min，冷卻后以10 000 r/min離心15 min，收集上清液后記錄各樣品上清液總重。分別取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，計算蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，計算氨基酸態(tài)氮含量和水解度，確定最佳酶解時間。

1.3.3.4 pH值對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末分別置于5個250 mL錐形瓶中，按酶添加量0.08%（以反應(yīng)液總質(zhì)量計）、酶解溫度50℃、酶解時間6 h、料液比1∶8，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，穩(wěn)定后進(jìn)行酶解。反應(yīng)結(jié)束后，沸水滅酶15 min，冷卻后以10 000 r/min離心15 min，收集上清液后記錄各樣品上清液總重。分別取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，計算蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，計算氨基酸態(tài)氮含量和水解度，確定最適pH值。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH值（D）作為變量，設(shè)計四因素三水平正交試驗，以優(yōu)化最佳的蛋白質(zhì)提取工藝，因素水平見表1。

1.3.5 最佳工藝驗證試驗

準(zhǔn)確稱取3份10.00 g已粉碎的花椒籽粕粉末，分別按照最佳酶解條件制備樣品，并記錄各樣品上清液總重，分別取上清液2 mL，按1.3.1的方法操作，計算蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)回收率；另外取上清液5 mL，按1.3.2的方法操作，計算氨基酸態(tài)氮含量和水解度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每次試驗重復(fù)3次，取平均值，以減小試驗帶來的偶然誤差，采用SPSS 22.0、Origin 2019b等作圖分析，以Tukey方法在95%置信區(qū)間進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽粕蛋白質(zhì)含量

重復(fù)3次試驗，通過計算得到花椒籽粕的蛋白質(zhì)含量為71.61%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶添加量對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)回收率和水解度均逐漸升高。當(dāng)酶添加量為0.08%時，蛋白質(zhì)回收率和水解度均達(dá)到最高，分別為47.32%和23.16%。雖然增加酶添加量可以使蛋白質(zhì)回收率進(jìn)一步升高，但考慮到實際生產(chǎn)成本，選擇0.08%為最適酶添加量。

2.2.2 酶解溫度對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白質(zhì)回收率先升高后降低，在50℃時達(dá)到最高，為46.89%，這可能是因為當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，酶活性受到抑制，使蛋白質(zhì)回收率下降。在45，50，55 ℃的條件下，水解度沒有顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇50℃為最佳酶解溫度。

2.2.3 酶解時間對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)酶解時間達(dá)到6 h時，蛋白回收率達(dá)到最大值46.89%。隨著酶解時間的延長，水解度逐漸升高，這是由于蛋白質(zhì)被進(jìn)一步水解成氨基酸和肽，因此，選擇6 h為最佳酶解時間。

2.2.4 pH值對花椒籽粕蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

由圖4可知，隨著pH值的增大，蛋白質(zhì)回收率呈上升趨勢，在pH值12.0時達(dá)到最高90.27%。當(dāng)pH值繼續(xù)增大時，雖然蛋白質(zhì)回收率有進(jìn)一步提升的空間，但蛋白酶會失去活性，大大降低水解度，過高的pH值不僅不適用于工業(yè)生產(chǎn)，而且會降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值并產(chǎn)生有害物質(zhì)。因此，選擇pH值12.0作為較優(yōu)pH值條件。

2.3 正交試驗結(jié)果

結(jié)合單因素試驗所得結(jié)果，設(shè)計四因素三水平正交試驗對花椒籽粕蛋白質(zhì)的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以便使蛋白質(zhì)提取率得到進(jìn)一步提高。正交試驗結(jié)果極差分析見表2。

由表2可知，各因素對蛋白質(zhì)回收率影響的主次順序為D＞B＞A＞C，即pH值的影響最大，其次是酶解溫度和酶添加量，酶解時間的影響最小。最優(yōu)方案為A₁B₂C₂D₃，即酶解條件為酶添加量0.04%、酶解溫度50℃、酶解時間6 h、pH值12.0。

直觀分析法無法判斷是試驗誤差還是各因素導(dǎo)致的結(jié)果差異，同時也不能通過直觀分析法判斷因素的變化影響是否顯著。因此，有必要進(jìn)一步做正交試驗結(jié)果的方差分析，見表3。

由表3可知，各因素對蛋白質(zhì)回收率的影響順序為pH值＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。由P值可知，以蛋白質(zhì)回收率為考察指標(biāo)時，試驗各因素的P值均小于0.01，說明各因素都對試驗結(jié)果有極顯著影響。因此，應(yīng)選擇各因素中水平最高的，即最優(yōu)方案為A₁B₂C₂D₃，與極差分析結(jié)果一致。

2.4 最佳提取工藝驗證試驗

由于正交試驗結(jié)果極差分析和方差分析所得的最優(yōu)方案不包含在9個已做試驗中，因此對A₁B₂C₂D₃的試驗方案進(jìn)行重復(fù)試驗驗證，結(jié)果見表4。

由表4可知，該方案的蛋白質(zhì)回收率均達(dá)到96%以上，高于正交試驗的最高水平，故最佳工藝驗證試驗成功，說明該提取工藝具有較好的穩(wěn)定性。因此，確定以A₁B₂C₂D₃，即酶添加量0.04%、酶解溫度50℃、酶解時間6 h、pH值12.0為最佳工藝條件，此時蛋白質(zhì)回收率為（96.98±0.24）%，蛋白質(zhì)含量為（8.10±0.00）%，水解度為（3.80±0.06）%。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗確定了復(fù)合蛋白酶提取花椒籽粕蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件為酶添加量0.04%、酶解溫度50℃、酶解時間6 h、pH值12.0，此時蛋白質(zhì)回收率為（96.98±0.24）%。本工藝可為花椒籽粕的綜合利用提供重要參考，證明花椒籽粕具有良好的開發(fā)價值，應(yīng)綜合利用并加強資源開發(fā)力度。

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