羚牛IFN-γ基因克隆、生物信息學(xué)分析與原核表達(dá)

摘 要 旨在研究羚牛γ干擾素（IFN-γ）基因結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步增強(qiáng)羚牛的免疫調(diào)節(jié)能力提供理論依據(jù)。通過RT-PCR方法克隆羚牛IFN-γ基因，并運(yùn)用多種生物信息學(xué)分析工具對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入研究。將IFN-γ基因序列連入原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，羚牛IFN-γ cDNA序列全長(zhǎng)501 bp，編碼166個(gè)氨基酸。蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，存在13個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，并含有1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)低度復(fù)雜區(qū)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及1個(gè)IFN-γ結(jié)構(gòu)域，其中IFN-γ結(jié)構(gòu)域位于胞外區(qū)。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與綿羊、山羊、家牛、水牛、人、黑猩猩、小鼠、雞的核苷酸序列同源性分別為" 99.0%、98.8%、97.2%、96.2%、75.8%、75.4%、64.1%、54.1%，氨基酸序列同源性分別為99.4%、99.4%、" 95.8%、95.8%、62.7%、62.7%、43.9%、33.5%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，羚牛與山羊、綿羊的親緣關(guān)系最近。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組IFN-γ蛋白以可溶性形式大量表達(dá)，分子質(zhì)量約為34 ku。通過密碼子優(yōu)化及不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)等原核表達(dá)優(yōu)化策略發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化能促進(jìn)重組蛋白的高效表達(dá)，且最佳誘導(dǎo)濃度為0.9 mmol·L^-1。

關(guān)鍵詞 羚牛；IFN-γ；基因克??；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)；IPTG誘導(dǎo)

羚牛又稱扭角羚，因其體形粗壯如牛，叫聲似羚羊，故名羚牛。據(jù)估計(jì)，全球現(xiàn)存羚牛數(shù)量約為7 000～12 000頭，是國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，被《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》列為易危級(jí)（UV）物種^[1]。近年來隨著人類活動(dòng)范圍的增加，羚牛適宜生境面積不斷縮減^[2]。在抵御病蟲害方面，已在羚牛中發(fā)現(xiàn)16個(gè)寄生蟲物種^[3]，對(duì)羚牛的生存造成了極大的威脅。較其他反芻動(dòng)物而言，羚牛對(duì)禽分枝桿菌亞種副結(jié)核也具有更高的易感性^[4]。這些因素導(dǎo)致了羚牛免疫調(diào)節(jié)能力下降，給羚牛的保護(hù)帶來了挑戰(zhàn)。

干擾素（interferon，IFN）是天然免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞因子。正常情況下，IFN基因處于抑制狀態(tài)。在特異性或非特異性誘生劑刺激下，激活一些與IFN基因活性相關(guān)的蛋白，從而解除IFN基因的抑制狀態(tài)，啟動(dòng)IFN的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其本身不具有殺滅細(xì)菌病毒的能力，但能通過旁分泌信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)臨近未感染細(xì)胞表達(dá)抗病毒蛋白，間接干擾病毒的復(fù)制^[5]。按其受體類型和功能特性可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素。Ⅰ型干擾素在抗病毒、抗增殖反應(yīng)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與凋亡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Ⅲ型干擾素具有抗病毒反應(yīng)及黏膜免疫的功能^[6]，Ⅱ型干擾素（也稱為γ干擾素）則主要在免疫調(diào)節(jié)上發(fā)揮作用。γ干擾素與臨近未被感染細(xì)胞的γ干擾素受體結(jié)合，通過JAK-STAT信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控抗病毒蛋白的表達(dá)，阻止病毒基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯從而發(fā)揮抗病毒的作用^[7]；它可以刺激樹突狀細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)NO等細(xì)胞毒性產(chǎn)物的釋放，進(jìn)而殺傷細(xì)胞內(nèi)微生物^[8]；它還能促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞表面MHC類分子表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答^[9]；此外，γ干擾素還具有直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)^[10]。在體外，γ干擾素制劑也逐漸成為動(dòng)物疾病診斷與治療的一種有效手段^[11]。然而迄今為止關(guān)于羚牛的研究多集中在其活動(dòng)節(jié)律、種群結(jié)構(gòu)與生境利用等行為生態(tài)學(xué)方面^[12-14]，關(guān)于分子遺傳學(xué)的研究也多聚焦于線粒體基因組、腸道微生物等方面^[15-16]，關(guān)于羚牛IFN-γ的基因信息及其重組蛋白制備研究尚屬空白。

本研究通過對(duì)羚牛IFN-γ進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)，進(jìn)一步研究羚牛γ干擾素的結(jié)構(gòu)與功能，為后期生產(chǎn)羚牛γ干擾素免疫佐劑、增強(qiáng)羚牛免疫力及疾病治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

羚牛組織樣來自秦嶺大熊貓研究中心（陜西珍稀野生動(dòng)物救助基地）。RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeScript RT Reagent Kit with DNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTARMax酶、DNA膠回收試劑盒、pMD19-T、DNA A-Tailing 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；pET-32a（+）載體、IPTG、細(xì)菌蛋白裂解液、考馬斯亮藍(lán)染色液、兔抗6×His多克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （HRP-IgG）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；超敏化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自Uelandy公司；12% Western blotting快速制膠試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中羚牛近緣綿羊IFN-γ（NM_001009803.1）基因序列，在基因編碼區(qū)兩側(cè)高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列為IFN-γ-F：5′-ACTCCGGCCTAACTCTCTCC-3′；IFN-γ-R：5′-GCAGGCAGGA- GGACCATTA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RNA提取和IFN-γ基因克隆 采用Trizol試劑提取羚牛肝臟組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系25 μL：上下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max酶12.5 μL，模板1 μL，補(bǔ)加滅菌水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性15 s；" 98 ℃變性10 s；56 ℃退火5 s；72 ℃延伸6 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定目的片段的大小。采用DNA膠回收試劑盒回收特異性擴(kuò)增的片段。

按照TakaRa DNA A-Tailing Kit說明書在PCR產(chǎn)物的3′末端添加“A”尾，并與pMD19-T載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞" 37" ℃培養(yǎng)過夜，然后挑單克隆送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 從GenBank中獲取山羊、綿羊、水牛、家牛、人、黑猩猩、小鼠、雞等物種IFN-γ基因的開放閱讀框序列及氨基酸序列，利用DNA Star-Meg Align軟件對(duì)擴(kuò)增得到的羚牛及其他物種進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性分析。利用MEGA 7.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建IFN-γ基因在上述9個(gè)物種中的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)值設(shè)置為1 000。利用在線軟件NetPhos 3.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）對(duì)羚牛IFN-γ的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。使用Protean軟件以Hopp-Woods算法分析IFN-γ蛋白親水性、Karplus-Schulz算法分析蛋白柔韌性、Emini算法分析蛋白表面可及性以及Jameson-Wolf算法分析蛋白抗原指數(shù)，并結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)IFN-γ的B細(xì)胞抗原表位。用在線軟件MEME （http：//meme-suite.org）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）、SMART（http：//smart.embl.de/）和TMHMM Server v.2.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-" 2.0/） 預(yù)測(cè)分析羚牛IFN-γ蛋白超二級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.4 羚牛IFN-γ原核表達(dá) 分析克隆得到的羚牛IFN-γ基因序列，對(duì)該序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化前后的序列連接入pET-32a（+）原核表達(dá)載體的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，分別命名為pET32a-IFNG-wt和pET32a-IFNG-op。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑取單個(gè)菌落至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r·min^-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。隨后按1∶100（菌液∶培養(yǎng)基）的體積比例擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.4～0.6。最后向菌液中加入終濃度為0.3 mmol·L^-1、0.6mmol·L^-1、0.9 mmol·L^-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

1.2.5 重組蛋白的提取與鑒定 分別收集誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后4 h的菌液1 mL，8 000 r·min^-1離心1 min，收集菌體沉淀。采用細(xì)菌蛋白裂解液裂解細(xì)菌，然后12 000 r·min^-1于4 ℃離心" 5 min，吸取上清，通過BCA法測(cè)定蛋白濃度。將上清液按照4∶1體積比加入蛋白上樣緩沖液，于100 ℃金屬浴熱變性10 min后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，通過考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 重組蛋白的Western blot鑒定 將提取的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。轉(zhuǎn)印后用1×TBST漂洗2次，每次10 min。加入封閉液，室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后用1×TBST漂洗3次。之后加入1∶4 000倍稀釋的6×His兔多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。用1×TBST漂洗3次后加入1∶5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。再用1×TBST漂洗3次，取出PVDF膜，用濾紙瀝干水分，按照Super ECL Plus超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說明書加入顯色底物顯色，ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 羚牛IFN-γ基因克隆

通過RT-PCR方法特異性擴(kuò)增得到羚牛肝組織IFN-γ mRNA片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在500 bp左右出現(xiàn)一條特異性條帶（圖1）。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物回收并克隆至T載體，測(cè)序結(jié)果顯示，羚牛IFN-γ擴(kuò)增片段全長(zhǎng)501 bp，編碼166個(gè)氨基酸。核苷酸序列與GenBank公布的綿羊IFN-γ序列同源性為99.0%，說明成功克隆到羚牛IFN-γ基因。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 IFN-γ序列同源性分析 將羚牛IFN-γ核苷酸序列及氨基酸序列與GenBank中其他參考物種進(jìn)行同源性比對(duì)（表1），結(jié)果表明羚牛與綿羊（NM_001009803.1）、山羊（NM_001285682.1） 、家牛（NM_174086.1）、水牛（NM_001290905.1）等物種IFN-γ基因的序列同源性較高，核苷酸序列同源性分別為99.0%、98.8%、97.2%、96.2%，氨基酸序列同源性分別為" 99.4%、99.4%、95.8%、95.8%。與綿羊相比，羚牛核苷酸序列存在T9C、T318C、A350G、A399C、C482G突變，其中A350G為錯(cuò)義突變（K117R）。比對(duì)結(jié)果表明反芻動(dòng)物間IFN-γ核苷酸及氨基酸序列具有高度的保守性。而羚牛與人（NM_000619.3）、黑猩猩（NM_001193665.1）、小鼠（NM_008337.4）、雞（NM_205149.2）等物種IFN-γ的核苷酸同源性較低，分別為75.8%、" 75.4%、64.1%、54.1%，氨基酸同源性分別為" 62.7%、62.7%、43.9%、33.5%，說明由于種屬間的差異，羚牛與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的單胃動(dòng)物的IFN-γ基因序列存在較大差異。

2.2.2 基于IFN-γ氨基酸序列的物種系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 IFN-γ氨基酸序列在不同物種間的同源性有所差異，為了更加直觀地展現(xiàn)不同物種間IFN-γ的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建羚牛與其他物種IFN-γ氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2。羚牛先與山羊聚為一類，然后再與綿羊、水牛、家牛、人、黑猩猩、小鼠、雞等聚類。這說明羚牛與山羊、綿羊的親緣關(guān)系最近，其次是偶蹄目中的家牛、水牛，再是人和黑猩猩，然后是嚙齒目的小鼠，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這一結(jié)果符合物種進(jìn)化規(guī)律，表明IFN-γ可作為構(gòu)建物種系統(tǒng)進(jìn)化樹、反映物種間遺傳進(jìn)化關(guān)系的候選基因之一。

2.2.3 IFN-γ蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 磷酸化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要過程，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用。利用NetPhos 3.1 Server對(duì)IFN-γ蛋白磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3、表2），羚牛IFN-γ蛋白上存在13個(gè)潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)（評(píng)分gt;0.5），包括12個(gè)絲氨酸位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。這些位點(diǎn)主要受到非特異性激酶（unsp，8 個(gè)）、蛋白激酶（PKC，5 個(gè)；PKA，3 個(gè)；PKB，2 個(gè)；PKG，1 個(gè)）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK5，1 個(gè)）、酪蛋白激酶（CKⅡ，1 個(gè)；CKⅠ，1 個(gè)）、p38MAPK（1 個(gè)）、CDC2（1 個(gè)）、ATM（1 個(gè)）、DNAPK（2 個(gè)）、RSK（2 個(gè)）等蛋白磷酸化激酶修飾。其中DKⅠ、CKⅡ、CDC2、CDK5、DNAPK、p38MAPK、RSK等激酶是細(xì)胞周期調(diào)控及DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵激酶，提示IFN-γ蛋白的磷酸化修飾很有可能與細(xì)胞增殖調(diào)控有關(guān)。

2.2.4 IFN-γ蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 利用Protean軟件對(duì)羚牛IFN-γ蛋白親水性、柔韌性、表面可及性、抗原指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IFN-γ蛋白存在6個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位（圖4），分別為62～66、83～86、108～109、144～147、153～157、160～163位氨基酸。

2.2.5 IFN-γ蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 應(yīng)用MEME在線工具預(yù)測(cè)羚牛IFN-γ蛋白超二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，羚牛與山羊、綿羊、家牛、水牛IFN-γ的超二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守（圖5），均存在4個(gè)相似的模體（motif）。在人與黑猩猩中均存在3個(gè)相似的模體。而在小鼠和雞中模體差異較大，尤其是雞，與羚牛沒有相似的motif。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示羚牛IFN-γ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋構(gòu)成，中間夾雜有無規(guī)則卷曲（33.13%）、少量延伸鏈（3.01%）與β轉(zhuǎn)角（3.61%）（圖6-A）。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果如圖6-C所示，該蛋白主要由α螺旋構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。隨后對(duì)羚牛IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其含有1個(gè)低度復(fù)雜區(qū)（5～21 位氨基酸）、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（7～28 位氨基酸）、1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域（1～23 位氨基酸）以及1個(gè)IFN-γ結(jié)構(gòu)域（15～152 位氨基酸）（圖6-B）。由此可知，IFN-γ是分泌蛋白且存在跨膜結(jié)構(gòu)，經(jīng)過翻譯后修飾過程分泌到細(xì)胞外發(fā)揮其生物學(xué)功能。進(jìn)一步用TMHMM Server v.2.0對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其1～6 位氨基酸為胞內(nèi)區(qū)域，" 7～28 位氨基酸為跨膜區(qū)域，28～166 位氨基酸為胞外區(qū)域，該區(qū)域即為IFN-γ成熟肽序列" （圖7）。

2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)定

對(duì)測(cè)序得到的羚牛IFN-γ基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化前后的序列分別連接入pET-32a（+）載體，經(jīng)過生物合成得到重組質(zhì)粒。并根據(jù)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN軟件對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，IFNG-wt和IFNG-op基因序列正確連入pET-32a（+）載體，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切可得到507 bp目的基因條帶和5.8k bp的載體條帶（圖8-A），說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白的鑒定

利用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，重組的融合蛋白在34 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖8-B），與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。Western blot鑒定結(jié)果表明，重組的融合蛋白與6×His多克隆抗體結(jié)合，在34 ku 處有特異性條帶（圖8-C），在原核表達(dá)系統(tǒng)中正確表達(dá)。此外，Western blot結(jié)果顯示密碼子未優(yōu)化組蛋白表達(dá)量隨著IPTG濃度的升高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在0.6 mmol·L^-1處達(dá)到最高。而密碼子優(yōu)化組中IPTG濃度越高蛋白表達(dá)量越多，最佳誘導(dǎo)濃度為0.9 mmol·L^-1。整體而言，IFNG-op蛋白表達(dá)量較IFNG-wt有所增加，說明密碼子優(yōu)化能夠促進(jìn)重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。

3 討" 論

IFN-γ作為天然免疫佐劑，能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果^[17]，在抗細(xì)菌感染等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景^[18]。然而天然IFN-γ含量極少，并且存在較強(qiáng)的種屬特異性^[19]，使用其他物種的IFN-γ免疫制劑治療羚牛的疾病可能會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)。因此利用基因工程技術(shù)研究與開發(fā)羚牛IFN-γ對(duì)羚牛保護(hù)工作的開展是十分必要的。

本研究成功克隆到羚牛IFN-γ cDNA序列，對(duì)該序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸和氨基酸序列比較保守，尤其與山羊、綿羊、家牛、水牛等反芻動(dòng)物同源性較高。蛋白空間結(jié)構(gòu)上，反芻動(dòng)物IFN-γ蛋白以α螺旋為主，存在一個(gè)信號(hào)肽、跨膜區(qū)、低度復(fù)雜區(qū)以及IFN-γ結(jié)構(gòu)域，4個(gè)motif高度保守。相反地，在人、黑猩猩、小鼠、雞等物種中由于與羚牛存在種屬變異，其IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)存在較大差異，并且隨著親緣關(guān)系的疏遠(yuǎn)，蛋白結(jié)構(gòu)差異越大，這與前人的研究一致^[20]。根據(jù)蛋白B細(xì)胞抗原表位參數(shù)篩選得到6個(gè)抗原表位，與溫貴蘭等^[20]在豬上的報(bào)道結(jié)果大致相同，為研究IFN-γ與B細(xì)胞相互作用提供了依據(jù)，也為后續(xù)開發(fā)和利用羚牛IFN-γ抗體提供參考。羚牛IFN-γ蛋白共發(fā)現(xiàn)13個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，主要受細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)激酶修飾，推測(cè)IFN-γ可能受到這些位點(diǎn)的磷酸化并參與細(xì)胞增殖調(diào)控^[21]。進(jìn)一步對(duì)不同物種磷酸化位點(diǎn)變異進(jìn)行分析，第19、21、108、109、147位的絲氨酸（S）在人、黑猩猩、小鼠、雞等物種中均發(fā)生了突變，導(dǎo)致該處磷酸化位點(diǎn)丟失，而該位點(diǎn)在牛、山羊、綿羊、水牛、家牛上均有所體現(xiàn)，很有可能是反芻動(dòng)物所特有的位點(diǎn)。綜合以上結(jié)果，推測(cè)反芻動(dòng)物IFN-γ蛋白翻譯后修飾、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及誘導(dǎo)抗原呈遞等機(jī)制類似，因此可以將其他物種IFN-γ的研究方法應(yīng)用于羚牛中，以期為羚牛IFN-γ的研究和保護(hù)提供啟示與借鑒。

在分類學(xué)上，對(duì)羚牛的歸屬仍然存在爭(zhēng)議。Li等^[22]構(gòu)建的線粒體基因組水平的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示羚牛大概在1006萬年前從綿羊和山羊的祖先中分離出來。任軼等^[23]將羚牛Cyt b基因與山羊、綿羊、麝牛屬動(dòng)物進(jìn)行序列分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)羚牛與綿羊的親緣關(guān)系最密切，其次是山羊、麝牛。而Zhou等^[24]報(bào)道了羚牛完整線粒體基因組，根據(jù)其10個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和2個(gè)rRNA基因重建了13個(gè)牛科代表物種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)羚牛與山羊?qū)佟r羊?qū)俚挠H緣關(guān)系比盤羊?qū)俑H近。本研究通過NJ法構(gòu)建了IFN-γ在羚牛與其他物種中的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)羚牛先與山羊聚類，再與綿羊分支合并。這一結(jié)果為與綿羊相比羚牛與山羊親緣關(guān)系更近的觀點(diǎn)提供了支撐依據(jù)。

本研究在對(duì)羚牛IFN-γ進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，采用了pET-32a（+）載體，并以大腸桿菌為宿主進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由于大腸桿菌遺傳背景明了清晰，且具有成本低廉、易于培養(yǎng)、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)^[25]，基因工程中廣泛使用大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)外源蛋白^[26]。李小鳳等^[27]采用大腸桿菌表達(dá)水牛IFN-γ發(fā)現(xiàn)重組目的蛋白以可溶性形式大量表達(dá)。Ma等^[28]通過構(gòu)建原核表達(dá)重組載體，正確表達(dá)出了山羊IFN-γ重組蛋白，并制備了針對(duì)山羊IFN-γ的單克隆抗體?？紤]到真核細(xì)胞和原核細(xì)胞密碼子偏好性不同，本研究對(duì)羚牛IFN-γ基因密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，探討密碼子優(yōu)化前后重組蛋白表達(dá)量是否有差異。此外，研究顯示誘導(dǎo)濃度對(duì)原核表達(dá)的影響也不可忽視^[29]。為了進(jìn)一步提高重組蛋白的表達(dá)量，本研究設(shè)置了不同IPTG誘導(dǎo)濃度以探索羚牛IFN-γ基因的最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果表明，重組目的蛋白以可溶性形式正確表達(dá)，優(yōu)化組蛋白表達(dá)量比未優(yōu)化組高，并且在0.9 mmol·L^-1 IPTG誘導(dǎo)下優(yōu)化的IFN-γ蛋白表達(dá)量可達(dá)到最高水平。猜測(cè)密碼子優(yōu)化可能通過影響IFN-γ基因mRNA穩(wěn)定性、翻譯延伸速率等方式，有效提高了外源蛋白原核表達(dá)的效率^[30]。

4 結(jié)" 論

本研究通過RT-PCR方法成功克隆到羚牛IFN-γ基因mRNA序列，全長(zhǎng)501 bp，編碼166個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IFN-γ序列及結(jié)構(gòu)在反芻動(dòng)物中高度保守，與綿羊相比IFN-γ核苷酸序列同源性達(dá)99%，存在4 個(gè)同義突變和1 個(gè)錯(cuò)義突變（K117R）；羚牛IFN-γ蛋白是分泌蛋白，主要由α螺旋構(gòu)成，含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，與綿羊、山羊、家牛、水牛等反芻動(dòng)物具有4 個(gè)相似的motif，受到CDK5、DNAPK、p38MAPK、RSK等多種細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)激酶的磷酸化修飾，經(jīng)多個(gè)抗原指數(shù)分析篩選到6 個(gè)B細(xì)胞抗原表位區(qū)域。構(gòu)建的原核表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，IFN-γ重組蛋白以可溶性形式正確表達(dá)，密碼子優(yōu)化后重組蛋白最佳誘導(dǎo)濃度為 0.9 mmol·L^-1。

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Cloning，Bioinformatics Analysis and ProkaryoticExpression of" IFN-γ Gene in Takin

LIU Li YAO Yuhang LIU Chenyang ZHANG Wentao

MA Junjie ZAN Linsen ² and CHENG Gong ²

（1.College of Animal Science and Technology，Northwest Aamp;F University，Yangling" Shaanxi 712100，China;

2.National Beef Cattle Improvement Centre of Northwest Aamp;F University，Yangling" Shaanxi 712100，China）

Abstract The objective of this study was to explore the structure and function of the interferon γ （IFN-γ） gene in takin，with the aim of providing a theoretical basis for enhancing the immune regulation capacity of this species.In this study，the IFN-γ gene of takin was cloned via RT-PCR，a comprehensive analysis of its structure and function were conducted using variety of bioinformatics tools.The IFN-γ gene sequence was connected to the prokaryotic expression vector and transformed into E.coli to induce its expression.The results showed that the IFN-γ cDNA sequence of takin was 501 bp in length and encoded 166 amino acids.The prediction of the protein’s higher order structure showed that the secondary structure was dominated by α helix，with 13 phosphorylation modification sites，a signal peptide，a low-grade complex region，a transmembrane domain and an IFN-γ domain.The IFN-γ domain is located in the extracellular region.Sequence alignment analysis showed that the nucleotide sequence homology with sheep，goat，cattle，buffalo，human，chimpanzee，mouse and chicken was99.0%，98.8%，97.2%，96.2%，75.8%，75.4%，64.1%，and 54.1%，respectively.The amino acid sequence homology was 99.4%，99.4%，95.8%，95.8%，62.7%，62.7%，43.9%，and 33.5%，respectively.The result of the phylogenetic tree analysis also showed that takin was most closely related to goats and sheep.SDS-PAGE and Western-blot showed that the recombinant IFN-γ protein was abundantly expressed in soluble form with a molecular weight of about 34 ku.Through optimization strategies for prokaryotic expression，such as codon optimization and IPTG induction expression at different concentrations，it was found that codon optimization promoted the efficient expression of recombinant proteins，and the optimal induction concentration was determined to be 0.9 mmol·L^-1.This study lays a foundational understanding for comprehensive functional exploration of IFN-γ gene in takin，as well as the potential application of interferon γ in takin.These findings provide novel insights into takin conservation efforts.

Key words Takin; IFN-γ; Gene cloning; Bioinformatics analysis; Prokaryoticexpression;IPTG induction

Received" 2024-01-26 Returned 2024-03-05

Foundation item Forestry Science and Technology Innovation Program" of" Shaanxi Province （No.SXLK2020-030 No.SXLK2021-0102）.

First author LIU Li，female，undergraduate.Research area：conservation of animal genetic resources and molecular breeding.E-mail：liulixinong@163.com

Correspondingauthor CHENG Gong，male，Ph.D，associate research fellow.Research area：animal functional genomics and molecular breeding.E-mail：chenggong@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）