威氏綠絨蒿葉斑病病原鑒定及藥劑篩選

摘 要 確定威氏綠絨蒿病原菌及其寄主范圍，并篩選對(duì)病原菌具有抑制作用的殺菌劑，為威氏綠絨蒿病害的科學(xué)防控提供理論基礎(chǔ)。以采自西南林業(yè)大學(xué)苗木基地的威氏綠絨蒿表現(xiàn)葉斑病的病害葉片為試驗(yàn)材料，運(yùn)用組織分離法分離獲得純化菌株。使用柯赫氏法則驗(yàn)證菌株的致病性，通過形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學(xué)特性，對(duì)病原菌進(jìn)行種類鑒定。采用離體葉片接種法測(cè)定病原菌的寄主范圍，并利用帶毒平板法測(cè)定50%多菌靈、50%嘧菌酯、38%唑醚啶酰菌胺、50%咪鮮胺錳鹽、75%百菌清和80%代森錳鋅對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力。從威氏綠絨蒿葉斑病病葉分離得到病原菌LRH-2，其菌落為圓形具輪紋，菌絲白色，分生孢子紡錘形，2～3根附屬絲。結(jié)合rDNA-ITS序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株與小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）（菌株號(hào)：KT459349）聚在同一個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)特征和ITS序列分析，鑒定LRH-2為小孢擬盤多毛孢" （P.microspora）。通過離體葉片接種法對(duì)21科24種植物的致病性進(jìn)行測(cè)定，其中12科13種供試植物在試驗(yàn)觀察期內(nèi)出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀。6種低毒殺菌劑對(duì)LRH-2均有一定抑制作用，其中50%多菌靈WP和38%唑醚啶酰菌胺WG對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制效果較好，其質(zhì)量濃度（EC50）為0.447和0.497 mg·L^-1。明確了威氏綠絨蒿葉斑病病原菌為小孢擬盤多毛孢（P.microspora），并通過對(duì)病原菌寄主范圍測(cè)定，證實(shí)了該病原菌的環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，篩選出抑制作用較強(qiáng)的藥劑50%多菌靈WP和38%唑醚啶酰菌胺WG。

關(guān)鍵詞 威氏綠絨蒿；葉斑?。徊≡b定；小孢擬盤多毛孢；寄主范圍；殺菌劑；防治效果

綠絨蒿被譽(yù)為“高山牡丹”，一年生或多年生的草本，屬于“云南八大名花”之一。該屬常生長(zhǎng)于海拔2 800～5 000 m的林下、高山草地和流石灘地帶，主要分布于亞洲中南部，集中于四川、云南、西藏等地區(qū)^[1]。其品種眾多，分為2個(gè)亞屬、5個(gè)組和9個(gè)系，Grey Wilson曾記錄該屬植物有79種，其中我國(guó)58種^[2]。綠絨蒿有極高的觀賞價(jià)值，艷麗優(yōu)美，花色豐富。另外它還具有獨(dú)特的民族文化內(nèi)涵，其園林藝術(shù)價(jià)值可以彌補(bǔ)園林綠化的景觀同質(zhì)化等問題，同時(shí)豐富地域文化特色^[2]。除此之外，綠絨蒿具有極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是著名的藏藥材料。藏醫(yī)藥典籍《月王藥診》、《四部醫(yī)典》和《晶珠本草》等均對(duì)綠絨蒿有詳細(xì)記載，現(xiàn)代藥理也表明該屬植物具有止瀉、鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗心肌缺血等作用^[3]。

由于該屬植物特有的生長(zhǎng)環(huán)境，病蟲害難以發(fā)生。所以在實(shí)際栽植中，對(duì)病蟲害的抵御能力不強(qiáng)。近年來不少學(xué)者致力于其綠絨蒿的育種研究，但在培育的過程中病害發(fā)生嚴(yán)重，時(shí)常造成葉片脫落，大大影響其生長(zhǎng)存活。關(guān)于綠絨蒿病害病原菌的分離鑒定鮮有報(bào)道，因此對(duì)病原菌進(jìn)行系統(tǒng)分離鑒定，并明確其寄主范圍，對(duì)生產(chǎn)上防治該病害具有重要意義。

筆者于2021年末在西南林業(yè)大學(xué)苗圃基地中的威氏綠絨蒿（Meconopsis wilsonii）植株上，發(fā)現(xiàn)了疑似葉斑病病癥，表現(xiàn)為褐色斑點(diǎn)，感病后期葉片干枯死亡。本研究主要針對(duì)種植威氏綠絨蒿面臨的這種病害，通過鑒定威氏綠絨蒿病害病原，測(cè)定病原菌對(duì)不同種類植物的致病性，確定病原菌的潛在寄主范圍，并研究多菌靈、嘧菌酯、唑醚啶酰菌、咪鮮胺錳鹽、百菌清、代森錳鋅6種常用廣譜低毒殺菌劑對(duì)它的防治效果，為治理威氏綠絨蒿病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品采自云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)苗木基地，隨機(jī)從3株威氏綠絨蒿 （M.wilsonii），分別采取3片發(fā)病病葉，放置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。綠絨蒿健康葉片采自同植株新鮮、無機(jī)械傷、大小一致的健康葉片。寄主范圍供試植物采自西南林業(yè)大學(xué)不同植物的健康葉片。

供試殺菌劑為50%多菌靈WP（江蘇三山農(nóng)藥有限公司）、50%嘧菌酯WG（河北冠龍農(nóng)化有限公司）、38%唑醚啶酰菌胺WG（江西正邦作物保護(hù)有限公司）、50%咪鮮胺錳鹽WP（美國(guó)富美實(shí)公司）、75%百菌清WP（利民化學(xué)有限公司）、80%代森錳鋅WP（山東省濟(jì)南一農(nóng)化工有限公司）。

1.2 病原菌分離純化

采用組織分離法，從葉片病健交界處獲取" 6 mm×6 mm左右的組織，接種到PDA平板中。倒置在25 ℃左右的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后挑取病葉附近的菌絲純化，純化3～5次后獲得純菌株并進(jìn)行編號(hào)。將純化后的菌株甘油凍存，于-20 "℃冰箱保存，備用。

1.3 病原菌致病性測(cè)定

參考離體接種法對(duì)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定：采取同一植株采取健康無病、生長(zhǎng)良好的綠絨蒿葉片，葉片表面消毒后晾干，備用。將培養(yǎng)7 d 的菌絲塊（直徑5 mm）覆蓋于用滅菌針刺破的葉片傷口處，放置保濕培養(yǎng)皿，并設(shè)置3組重復(fù)，以空白PDA為對(duì)照^[4]。觀察記錄接種情況，7 d后從發(fā)病的葉片用組織分離法分離病原菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 采用玻片培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)觀察：將察氏培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，厚度為1 mm左右，用解剖刀在凝固好的培養(yǎng)基劃1.5 cm×1.5 cm的方塊，并放置在載玻片上，挑取病原菌菌絲接種在方塊邊緣，蓋上蓋玻片，放置在保濕培養(yǎng)皿中^[5]。25 ℃培養(yǎng)4～7 d，長(zhǎng)出菌絲后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄分生孢子形態(tài)大小和著生方式等特征。比較觀察結(jié)果與已報(bào)道的病原菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 采用真菌DNA抽提試劑盒提取病菌DNA，使用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為MIX 12.5 μL，DDW 9.5 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，" 72 ℃ 50 s，這3個(gè)階段重復(fù)循環(huán)35次；72 ℃10 min；4 ℃保存^[5]。把擴(kuò)增后序列送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對(duì)，參考文獻(xiàn)并篩選出相關(guān)菌株的ITS序列，用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并在NCBI官網(wǎng)上傳菌株序列以獲取登錄號(hào)。

1.5 寄主范圍測(cè)定

參考楊迪等^[6]的方法，采用離體針刺接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。供試寄主植物包括：杜仲（Eucommia ulmoides）、滇樸（Celtis tetrandra）、潤(rùn)楠（Machilus pingii" Cheng）、玉蘭（Magnolia denudata）、桂花（Osmanthus fragrans）、木芙蓉（Hibiscus mutabilis）、日本晚櫻（Cerasus serrulata）、木槿（Hibiscus syriacus）、黃楊（Buxus sinica）、杜鵑（Rhododendron simsii）、女貞（Ligustrum lucidum）、灰莉（Fagraea ceilanica）、南天竹（Nandina domestica）、三角梅（Bougainvillea spectabilis） 、紅花檵木（Loropetalum chinense）、長(zhǎng)春油麻藤（Mucuna sempervirens）、月季（Rosa chinensis）、薔薇（Rosa multiflora）、繡球（Hydrangea macrophylla）、馬纓丹（Lantana camara）、天竺葵（Pelargonium hortorum）、黃金（Euryops pectinatus）、蔓長(zhǎng)春花（Vinca major）、花葉冷水花（Pilea cadierei）。

1.6 藥劑敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定病原菌對(duì)6種供試殺菌劑的敏感性，50%多菌靈和38%唑醚啶酰菌胺參考吳玉珠等^[7]設(shè)置的質(zhì)量濃度，80%代森錳鋅、75%百菌清及50%醚菌酯參考于靜亞等^[8]設(shè)置的質(zhì)量濃度，50%咪鮮胺錳鹽參考熊朝偉等^[9]。制成上述6種殺菌劑的含藥平板，藥劑與培養(yǎng)基體積比1∶10。以無菌水為對(duì)照，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次，25 ℃倒置暗培養(yǎng)7" d。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算不同濃度梯度下殺菌劑的抑菌率。

抑菌率（抑制生長(zhǎng)率）=[（對(duì)照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值）/（對(duì)照菌落直徑平均值-菌餅直徑）]×100%

通過SPSS 26和DPS處理數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，計(jì)算毒力回歸方程并求出半最大效應(yīng)濃度（EC50 ）的值，比較不同防治藥劑的相對(duì)抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定

分離得到3株純菌株LRH-1、LRH-2和LRH-3，通過刺傷將菌餅接種于健康、無病蟲害的綠絨蒿葉片上，7 d后觀察，結(jié)果如圖1所示。LRH-2接種處理葉片發(fā)病，癥狀與田間發(fā)病葉片癥狀一致，對(duì)照處理葉片均健康未發(fā)病。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 LRH-2號(hào)：菌絲白色，菌落圓形具輪紋，后期產(chǎn)生黑色油滴狀分生孢子團(tuán)（圖2-a）。將玻片培養(yǎng)6" d左右的菌絲置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其分生孢子為紡錘形，20 μm 左右，具有4個(gè)隔膜5個(gè)細(xì)胞，中間3個(gè)細(xì)胞為褐色，兩端細(xì)胞無色三角狀，頂端附屬絲2～3根（圖2-b）；其分生孢子梗短、無色（圖2-b），分生孢子萌發(fā)如圖2-c，分子孢子盤初期埋生，后期突出基物外露（圖2-d）。從該菌形態(tài)特征，查閱文獻(xiàn)可初步鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）^[6]。

2.2.2 分子鑒定 利用ITS1/ITS4引物對(duì)LRH-2的ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得知其序列長(zhǎng)度為585 bp，進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載并選擇序列長(zhǎng)度接近和同源性高的近緣種序列，使用MEGA7軟件用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，菌株LRH2（登錄號(hào)：OR086089）與小孢擬盤多毛孢（登錄號(hào)：KT459349）聚類于同一分枝，親緣關(guān)系密切。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將LRH2鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora），隸屬于腔孢綱（Coelomycetes）黑盤孢目（Melanconiales）黑盤孢科（Melanconiaceae）擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）。

2.3 病原菌的潛在寄主范圍

對(duì)21科22屬24種植物葉片進(jìn)行離體接種，其中12科13種植物葉片接種部分出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀。LRH-2號(hào)對(duì)天竺葵、玉蘭、木槿、黃楊和月季等植物的致病力強(qiáng)，接種后3" d左右就顯示不同程度的病癥。病原菌對(duì)繡球、黃金菊、蔓長(zhǎng)春花、南天竹、潤(rùn)楠、滇樸和日本晚櫻等植物致病力弱且發(fā)病緩慢，約在5～7 d顯示不同程度的病癥，具體發(fā)病時(shí)間、病斑大小如表1所示。但對(duì)薔薇、木芙蓉、馬纓丹、女貞、灰莉、三角梅、桂花、杜仲、紅花檵木和花葉冷水花不致病，暗示這些植物體內(nèi)可能含有對(duì)該病原菌有抑制作用的化合物。

2.4 殺菌劑對(duì)病原菌的藥劑敏感性

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定6種供試殺菌劑對(duì)病原菌的藥劑敏感性，結(jié)果表明LRH-2在不同濃度含藥平板上均能生長(zhǎng)，但與對(duì)照組相比，菌絲生長(zhǎng)緩慢，且抑制率與殺菌劑濃度呈正相關(guān)，表明6種供試殺菌劑對(duì)其菌絲的生長(zhǎng)均有較好的抑制效果。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到6種殺菌劑的毒力回歸方程（表2），其相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.987、" 0.983、0.945、0.928、0.933和0926，表明毒力回歸方程的擬合度較好。其中多菌靈的毒力最高，對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制效果最好，EC50值為0.447" mg·L^-1。由EC50值可知病原真菌對(duì)6種殺菌劑的敏感性50%多菌靈＞38%唑醚啶酰菌胺＞50%咪鮮胺鹽錳＞80%代森錳鋅＞50%嘧菌酯＞75%百菌靈。

3 討" 論

綠絨蒿葉斑病是綠絨蒿栽培上重要的病害之一，國(guó)內(nèi)外關(guān)于綠絨蒿葉斑病病原菌鮮有報(bào)道。本研究對(duì)威氏綠絨蒿（M.wilsonii）感病葉片分離純化，通過科赫氏法則對(duì)其致病性進(jìn)行驗(yàn)證，得到病原真菌LRH-2。經(jīng)形態(tài)特征及序列分析等，證明供試病原菌與小孢擬盤多毛孢的特征基本一致，系統(tǒng)發(fā)育樹中與小孢擬盤多毛孢的同源性達(dá)100%。因此將威氏綠絨蒿病害的病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。小孢擬盤多毛孢可引起威氏綠絨蒿葉斑病，目前在國(guó)內(nèi)外尚屬首次報(bào)道。擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）最初被盤多毛孢屬（Pestalotia）包含，后于1949年被Steyaert劃分出來，認(rèn)為其屬擁有5細(xì)胞分生孢子，Sutton和Nag Raj在此基礎(chǔ)上，對(duì)擬盤多毛孢屬的特征作不同的界定。韋繼光等^[10-11]的研究證實(shí)Sutton界定的屬間特征具合理性，并發(fā)現(xiàn)其分生孢子有色胞分為暗色和淡色。一直以來，該屬是一類重要的植物致病菌，癥狀表現(xiàn)為葉斑、葉枯、腐爛、潰瘍等，主要分布在全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)大多分布于南方^[12-13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）的寄主范圍十分廣泛，可寄生超過50多個(gè)科的植物，如芒果^[14]、楊梅^[15]、番石榴^[16]等生態(tài)作物和經(jīng)濟(jì)作物為害比較嚴(yán)重。

近年來，陸續(xù)有小孢擬盤多毛孢引起植物病害的報(bào)道。小孢擬盤多毛孢可對(duì)油棕、石楠、閩楠、紅葉石楠、崗梅、核桃、油茶、藍(lán)莓、橄欖等經(jīng)濟(jì)作物致病^[8，17-23]，主要表現(xiàn)為葉斑、潰瘍和腐爛等病癥。由此可見其寄主范圍較為廣泛，本研究中小孢擬盤多毛孢對(duì)24種植物的致病性測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)有14種植物呈現(xiàn)不同病癥，其中不致病的大部分植物為木本植物，在此之前韋繼光等^[24]認(rèn)為擬盤多毛孢是木本植物內(nèi)生真菌的重要類群之一。另外，劉韓等^[25]從松樹上分離得到11種內(nèi)生擬盤多毛孢，其中包含小孢擬盤多毛孢。謝津^[26]在前人的研究下，總結(jié)了小孢擬盤多毛孢在一些植物的內(nèi)生情況，如茶、樟樹、叢花厚殼桂、香葉樹、香桄榔、軟葉針葵和某些青岡、櫟樹、杉樹與松樹品種等。根據(jù)前人研究，可以推測(cè)小孢擬盤多毛孢在有些植物上為病原，而在其他植物上可能呈內(nèi)生狀態(tài)。

目前，關(guān)于小孢擬盤多毛孢的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑。管斌等^[27]在10種殺菌劑中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)咪鮮胺EC（25%）、代森錳鋅WP（80%）、嘧菌酯SC（250 g·L^-1）對(duì)小孢擬盤多毛孢的防治效果均較佳。于靜亞等使用與管斌等相同的6種殺菌劑，采用不同的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)效果較好的是咪鮮胺AS（450 g·L^-1）、甲基托布津WP（70%）和苯醚甲環(huán)唑WG（10%）^[8]；同時(shí)熊朝偉等^[9]增加了殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺效果也比較好。吳玉珠等^[7]使用了一些復(fù)合型殺菌劑，在12種殺菌劑中唑醚·代森聯(lián)WG（60%）的抑菌效果最好。在田間試驗(yàn)中，廖道林^[28]證實(shí)吡唑醚菌酯效果較好，與礦物質(zhì)油（99%）混合使用可以提高藥效。這與陽(yáng)廷密等^[29]對(duì)小孢擬盤多毛孢引起柑桔黃斑落葉病的防治結(jié)論基本一致。另外，廖道林^[28]還建議在病害不嚴(yán)重的情況下，選用600倍液的代森錳鋅WP。

本試驗(yàn)對(duì)引起威氏綠絨蒿的小孢擬盤多毛孢進(jìn)行了殺菌劑的抑菌效果測(cè)定，6種供試藥劑都有抑菌效果，其中多菌靈WP（50%）、嘧菌酯WG（50%）、唑醚啶酰菌WG（38%）、咪鮮胺錳鹽WP（50%）、百菌清WP（75%）和代森錳鋅WP（80%）的EC50分別為0.447、1.201、0.497、" 0.806、3.963和0.917" mg·L^-1。相比較而言，多菌靈和唑醚啶酰菌胺對(duì)病原菌的抑制效果較好。這些結(jié)果與管斌等^[27]的研究存在差異，管斌等得出的EC50分別為4.867 7、4.628 3、4.499 7 mg·L^-1；另外，于靜亞等^[8]和熊朝偉等^[9]的咪鮮胺EC50也存在出入，前者采用的是咪鮮胺AS（250 g·L^-1），EC50為0.099mg·L^-1；后者采用的是咪鮮胺EW（450 g·L^-1），EC50為0.013mg·L^-1。除此之外，參考于靜亞等^[8]濃度的代森錳鋅、嘧菌酯及百菌清WP，參考吳玉珠等^[7]濃度的多菌靈和唑醚啶酰菌胺，EC50也略有不同。本研究中咪鮮胺、多菌靈、代森錳鋅和嘧菌酯其有效中濃置信限與吳玉珠等^[7]的結(jié)果出現(xiàn)一定重疊，說明其結(jié)果有一定可取性，而EC50出現(xiàn)的這些差異可能是病原菌生境和殺菌劑的劑型、復(fù)合成分以及生產(chǎn)廠家不同導(dǎo)致。

小孢擬盤多毛孢（P.microspora）主要為害威氏綠絨蒿成株期的葉部，引起黃化褐斑等病癥，從而降低光合、影響生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)造成葉片脫落。在綠絨蒿培育和種植等方面，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)避開小孢擬盤多毛孢潛在寄主范圍的植物，減少病原侵染的途徑。在面對(duì)小孢擬盤多毛孢的防治中，可根據(jù)實(shí)際情況選擇殺菌劑。此外，還應(yīng)注意在冬、春季做好徹底清園，在5-6月物候期重點(diǎn)關(guān)注病害發(fā)生情況，避免病害傳播。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 屈 燕，區(qū) 智.綠絨蒿屬植物國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 [J].北方園藝，2012（2）：191-194.

[2]喻舞陽(yáng)，楊紫玲，李佶蕓，等.綠絨蒿屬植物的園林應(yīng)用及研究進(jìn)展 [J].四川林業(yè)科技，2020，41（1）：115-121.

[3]龔 宇，周蕙禎，陳胡蘭.近十年綠絨蒿屬藥用植物的研究進(jìn)展 [J].中藥材，2020，43（3）：758-763.

[4]朱軼慧，劉玉軍，畢飛虎，等.紅葉石楠葉斑病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 [J].植物保護(hù)，202 47（5）：210-215，235.

[5]石建龍，李玉權(quán)，胡琨敏，等.貴州半夏塊莖腐爛病病原菌的分離與鑒定 [J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（2）：289-299.

[6]楊 迪，鄭雪玲，黎 鵬，等.女貞褐斑病病原菌的生物學(xué)特性及寄主范圍測(cè)定 [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，202 52（9）：2482-2488.

[7]吳玉珠，陳 娜，胡軍華，等.青脆李枯萎病致病菌的分離鑒定及藥劑篩選 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，48（3）：298-304

[8]于靜亞，董立坤，王志華，等.石楠葉斑病病原鑒定及對(duì)藥物敏感性測(cè)定 [J].植物病理學(xué)報(bào)，2017，47（4）：440-447.

[9]熊朝偉，阮成江，吳 波，等.玉屏油茶葉枯病病原菌分子鑒定及防治藥劑篩選 [J].分子植物育種，2019，17（6）：1944-1950.

[10] 韋繼光，徐 同，潘秀湖，等.擬盤多毛孢屬的分類學(xué)研究進(jìn)展 [J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25（1）：78-85.

[11]韋繼光，徐 同，郭良棟，等.根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)特征界定擬盤多毛孢屬的種 [J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2005，24（4）：304-313.

[12]MAHARACHCHIKUMBURA S S N，GUO" L D，CHUKEATIROTE E，et al.Pestalotiopsis-morphology，phylogeny，biochemistry and diversity [J].Fungal Diversity，201 50（1）：167-187.

[13] CROUS P W，SUMMERELL B A，SWART L，et al.Fungal pathogens of" Proteaceae [J].Persoonia-Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi，201 27（1）：20-45.

[14]ISMAIL A M，CIRVILLERI G，POLIZZI G.Characterisation and pathogenicity of" Pestalotiopsis uvicola and Pestalotiopsis clavispora causing grey leaf spot of mango （Mangifera indica" L.） in Italy [J].European Journal of Plant Pathology，2013，135（4）：619-625.

[15]REN H Y，LI G，QI X J，et al.Identification and characterization of" Pestalotiopsis spp.causing twig blight disease of bayberry （Myrica rubra Sieb.amp; Zucc） in China [J].European Journal of Plant Pathology，2013，137（3）：451-461.

[16]KEITH L M，VELASQUEZ M E，ZEE F T.Identification and characterization of Pestalotiopsis spp.causing scab disease of guava，Psidium guajava，in Hawaii [J].Plant Disease，2006，90（1）：16-23.

[17]鄭 麗，楊興玉，謝昌平，等.油棕苗期葉斑病的病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 [J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2014，" 36（6）：794-801.

[18]陳全助，金亞杰，郭朦朦，等.閩楠葉斑病病原鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定 [J].植物病理學(xué)報(bào)，2018，48（3）：313-323.

[19]傅 昱，李燕霞，劉婉蓉，等.崗梅枝枯病病原鑒定 [J]." 植物保護(hù)，2019，45（3）：170-173.

[20]樊炳君，趙玉美，陳俊珠，等.云南核桃葉枯病病原鑒定及其生物學(xué)特性 [J].植物保護(hù)，2020，46（3）：123-130.

[21]秦紹釗，劉文霞，李御企，等.貴州油茶葉枯病病原鑒定研究 [J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2019，39（23）：16-17.

[22]尉瑩瑩，梁 晨，趙洪海，等.華東地區(qū)藍(lán)莓采后病害病原鑒定及其多樣性分析 [J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（7）：112-115.

[23]陳南泉，林河通，陳藝暉，等.橄欖小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）的生物學(xué)特性研究 [J].保鮮與加工，2016，16（3）：5-10.

[24]韋繼光，徐 同.植物內(nèi)生擬盤多毛孢的生物多樣性 [J].生物多樣性，2003，11（2）：162-168.

[25]劉 韓，劉應(yīng)高，李姝江，等.四川松樹內(nèi)生擬盤多毛孢的多樣性及其防病效果 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，43（12）：41-48，57

[26]謝 津.黑老虎輪斑病的病原鑒定和毒素成分分析及病害防治研究 [D].南寧：廣西大學(xué)，2020.

[27]管 斌，呂興萍，徐 超，等.紅葉石楠小孢擬盤多毛孢葉斑病化學(xué)防治試驗(yàn) [J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（2）：131-135.

[28]廖道林.廣西柑橘黃斑落葉病防治藥劑篩選 [J].現(xiàn)代園藝，202 44（10）：32-33.

[29]陽(yáng)廷密，張素英，唐明麗，等.廣西柑桔黃斑落葉病防治藥劑篩選 [J].中國(guó)南方果樹，2018，47（4）：29-31.

Identification of" Pathogen Causing" Meconopsis wilsonii" Leaf Spot and Screening of Fungicides for Control

TIAN Yunjing LU Junjia ZHANG Ziyue ²，YANG Mingguo ²，

LIU Mian ²，YANG" Fazhong³ and GU Xu⁴

（1.Landscape Architecture and Horticulture Sciences College，Southwest Forestry University，Kunming 650224，

China;2.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province，Kunming 650233，China;

3.College of Chemical Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650504，China;

4.The Biodiversity Research Institute in Yunnan Province，Kunming 65020 China）

Abstract To determine the disease pathogen of" Meconopsis wilsonii and its pathogenicity to different species of plants，and to screen the inhibitory fungicides.It provides a theoretical basis for the scientific prevention and control of M.wilsonii disease.Using the disease leaves of M.wilsonii" collected from the seedling base of Southwest Forestry University as the experimental material，the strains were isolated and purified by the tissue isolation.Koch’s" rule was used to verify the pathogenicity of the strains and identify the strain species of M.wilsonii by morphological observation and molecular biology.And the pathogenicity of the pathogenic bacteria to different species of plants was determined using the isolated leaf inoculation method to determine their host range，and the indoor toxicity of 50% Carbendazim，50% Azoxystrobin，38% Boscalid，50% Prochloraz mangnse，75% Chlorthalonil and 80% Mancozeb to pathogenic bacteria was determined by toxic plate method.The strains were purified from the disease leaves of M.wilsonii，among which the pathogen of M.wilsonii disease was LRH-2.Observe the colony cultured for 7 days were circular whorls，mycelium white，and fusiform conidia have 2-3 accessory filaments.Combined with the rDNA-ITS sequence analysis，a phylogenetic tree was constructed and the strain was found to be clustered in the same branch as Pestalotiopsis microspora （strain number： KT459349）.Combining morphological characteristics and ITS sequence analysis，LRH-2 was identified as P.microspora.The pathogenicity of 24 species of plants from 21 families was determined by isolated leaf inoculation method，and the results showed that the pathogenic symptoms of small spores on 13 species of test plants from 12 families appeared to varying degrees during the experimental observation period.The six elow-toxicity fungicides had inhibitory effect on LRH-2.The 50% Carbendazim and 38% Boscalid had more well inhibitory effect on LRH-2 with a concentration （EC50 ） of 0.447 and 0.497 mg·L^-1.The pathogenic fungus of M.wilsonii was clearly identified as P.microspora，and the host range of the pathogen is confirmed to be potentially pathogenic to some plants，and its adaptability to the environment is strong，and 50% Carbendazim and 38% Boscalid had good control effect against it.

Key words Meconopsis wilsonii; Leaf spot; Pathogen identification; Pestalotiopsis microspora; Host range; Fungicides; Control effect

Received" 2023-07-26 Returned 2023-10-07

Foundation item The National Natural Science Foundation of China（No.32060695）;Talent Training Finance Special Young Talents （Talent Training） of Yunnan Province （No.990122074）.

First author TIAN Yunjing，female，master" student.Research area：horticultural plant diseases." E-mail：2111413923@qq.com

Correspondingauthor LU Junjia，female，Ph.D，associate professor.Research area：plant disease control，functional components.E-mail：58826911@qq.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）