青藤堿調控LncRNA-HEIH表達抑制人食管癌細胞遷移和侵襲

摘要：目的" 探討青藤堿（SIN）對食管癌細胞遷移、侵襲的影響及對LncRNA-HEIH的調控作用。方法" 采用不同濃度青藤堿處理食管癌TE-1細胞，si-NC、si-HEIH分別轉染TE-1細胞，pcDNA、pcDNA-HEIH分別轉染TE-1細胞后加入青藤堿處理細胞;CCK8檢測細胞活力，劃痕實驗檢測細胞遷移率，Transwell實驗檢測侵襲細胞數(shù)，qRT-PCR檢測HEIH表達量。結果" 青藤堿25、50、100 mg/L對TE-1細胞活力無明顯影響（Pgt;0.05），在青藤堿25、50、100 mg/L的作用下，TE-1細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），在青藤堿25、50、100 mg/L的作用下，TE-1細胞HEIH表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01）。轉染si-HEIH可顯著降低TE-1細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），過表達HEIH可顯著逆轉青藤堿降低TE-1細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)的作用（Plt;0.01）。結論" 青藤堿通過抑制HEIH表達，抑制食管癌細胞遷移和侵襲。

關鍵詞：青藤堿;HEIH;遷移;侵襲;食管癌

中圖分類號：R285.5" " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.19.010

文章編號：1006-1959（2024）19-0062-06

Sinomenine Inhibits Migration and Invasion of Human Esophageal Cancer Cells

by Regulating LncRNA-HEIH Expression

CHEN Zhongkai，WU Xianquan，JING Jiahui，LONG Chunhui，LI Long，CHEN Weiyi

（Medical School of Hunan University of Medicine，Huaihua 418000，Hunan，China）

Abstract：Objective" To investigate the effect of sinomenine （SIN） on the migration and invasion of esophageal cancer cells and the regulation of LncRNA-HEIH.Methods" Esophageal cancer TE-1 cells were treated with different concentrations of sinomenine. TE-1 cells were transfected with si-NC and si-HEIH， respectively. TE-1 cells were transfected with pcDNA and pcDNA-HEIH， respectively， and then treated with sinomenine. CCK8 was used to detect cell viability， scratch test was used to detect cell migration rate， Transwell test was used to detect the number of invasive cells， and qRT-PCR was used to detect HEIH expression.Results" Sinomenine 25， 50 and 100 mg/L had no significant effect on the viability of TE-1 cells （Pgt;0.05）. Under the action of sinomenine 25， 50 and 100 mg/L， the migration rate and invasive cell number of TE-1 cells decreased significantly （Plt;0.01）. Under the action of sinomenine 25， 50 and 100 mg/L， the expression of HEIH in TE-1 cells decreased significantly （Plt;0.01）. Transfection of si-HEIH significantly reduced the migration rate and the number of invasive cells of TE-1 cells （Plt;0.01）. Overexpression of HEIH significantly reversed the effect of sinomenine on reducing the migration rate and the number of invasive cells of TE-1 cells （Plt;0.01）.Conclusion" Sinomenine inhibits the migration and invasion of esophageal cancer cells by inhibiting the expression of HEIH.

Key words：Sinomenine;HEIH;Migration;Invasion;Esophageal cancer

食管癌是指發(fā)生在食管上皮組織中的惡性腫瘤[1]。根據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，食管癌是全球第8常見的惡性腫瘤，也是全球第6常見的癌癥死因[2]。我國是世界上食管癌高發(fā)地之一，每年有16萬～20萬人死于食管癌[3]。盡管已有手術、化療、放療等多種方法用于食管癌治療，但患者的預后及整體生存率仍然較差，其主要原因是食管癌容易發(fā)生轉移[4]，導致腫瘤擴散，從而導致患者預后差[5]。因此，積極尋找新的抗食管癌轉移藥物，對于改善患者預后具有重要意義[6]。青藤堿（Sinomenine， SIN）為防己科防己屬植物青風藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、抗血管新生等作用，臨床上主要用于治療心律失常和類風濕性關節(jié)炎等疾病[7]。近來研究報道[8]，青藤堿具有良好的抗腫瘤作用，可以抑制多種腫瘤細胞轉移，但青藤堿對食管癌的作用尚未清楚。本研究擬探討青藤堿對食管癌細胞遷移和侵襲的作用及其機制，旨在為將青藤堿開發(fā)為抗食管癌轉移的新型藥物提供參考。

1材料與方法

1.1儀器" Axio Observer型倒置顯微鏡（德國蔡司公司），F(xiàn)orma Steri-Cycle型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司），EPOCH酶標儀（美國BioTek公司），LightCycler480 Ⅱ熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.2試劑" 青藤堿（北京索萊寶科技有限公司，批號：SS8560）;4%多聚甲醛、結晶紫染色液、CCK8試劑（碧云天生物科技有限公司，批號分別為：P0099、C0121、C0038）;Matrigel基底膠（美國BD公司，批號：356234）;Transwell小室（美國Corning公司，批號：3422）;TRIzol試劑盒、Lipofetmiane 2000（美國Invitrogen公司）;逆轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒（日本TaKaRa公司）;si-NC、si-HEIH、pcDNA、pcDNA-HEIH購自廣州銳博生物科技有限公司;RPMI 1640（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：22400071）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：11011-8611）。

1.3細胞" 人食管癌TE-1細胞（中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，批號：TCHu 89）。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng)及實驗分組" 人食管癌TE-1細胞用含10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，每隔2～3 d消化傳代后開展實驗。將正常培養(yǎng)的TE-1細胞作為對照組，將TE-1細胞接種于含25、50、100 mg/L青藤堿的培養(yǎng)液中分別標記為青藤堿25、50、100 mg/L組，將si-NC、si-HEIH分別轉染TE-1細胞后標記為si-NC組、si-HEIH組，將pcDNA、pcDNA-HEIH分別轉染TE-1細胞后加入含100 mg/L青藤堿的培養(yǎng)液標記為青藤堿100 mg/L+pcDNA組、青藤堿100 mg/L+pcDNA-HEIH組。

1.4.2 CCK8檢測細胞活力" 將TE-1細胞以每孔1×105/ml，100 μl/孔接種在96孔板中，待細胞貼壁后根據(jù)實驗分組予以相應處理24 h后，每孔加入10 μl CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度（OD值），并計算細胞活力=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。

1.4.3劃痕實驗檢測細胞遷移率" 將TE-1細胞以每孔1×105/ml，2.5 ml/孔接種在6孔板中，當細胞生長到板底90%時，用10 μl的Tip頭在板底劃痕，之后根據(jù)實驗分組予以相應處理，并加入含1%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24 h對劃痕區(qū)域進行拍照，采用Image J軟件測量劃痕距離，并計算細胞遷移率=（0 h劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.4.4 Transwell實驗檢測侵襲細胞數(shù)" 將無血清培養(yǎng)液與Matrigel基質膠按1∶8比例混合，平鋪于小室上室中，待其凝固后，用胰酶消化TE-1細胞，無血清培養(yǎng)液重懸成1×105/ml的單細胞懸液，取200 μl加入小室上室中，小室下室加入800 μl含20%血清的培養(yǎng)液并根據(jù)實驗分組予以相應處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，用棉簽擦去未穿過的細胞，顯微鏡下拍照并計算細胞數(shù)。

1.4.5 qRT-PCR檢測細胞HEIH表達" Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度。根據(jù)TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄反應得到cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增目的基因，反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl、上下游引物各1 μl、cDNA模板2 μl，ddH2O補足體系至20 μl。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算HEIH相對表達量。HEIH上游引物：5’-ATGCGAGAAGCCATGAGACC-3’，HEIH下游引物：5’-GGAACAGCTTGTGTGACCGA-3’，GAPDH上游引物：5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，GAPDH下游引物：5’-GACTCCGACCTTCACCTTCC-3’。

1.5數(shù)據(jù)處理" 采用SPSS 28.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗或Q檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1青藤堿對TE-1細胞的毒性作用" 與對照組相比，青藤堿25、50、100 mg/L組細胞活力無顯著改變（Pgt;0.05）（圖1），表明青藤堿25、50、100 mg/L對TE-1細胞無毒性作用，因此用于后續(xù)實驗。

2.2青藤堿對TE-1細胞遷移、侵襲的影響" 與對照組相比，青藤堿25、50、100 mg/L組細胞遷移率、侵襲細胞數(shù)顯著降低（Plt;0.01），見圖2A～圖2D，表明青藤堿可以抑制TE-1細胞遷移和侵襲。

2.3青藤堿對HEIH的影響" 與對照組相比，青藤堿25、50、100 mg/L組HEIH表達量顯著降低（Plt;0.01），見圖3，表明青藤堿可以抑制TE-1細胞HEIH表達。

2.4 HEIH對TE-1細胞遷移和侵襲的影響" si-NC組HEIH表達量與對照組相比無統(tǒng)計學差異，si-HEIH組HEIH表達量低于對照組和si-NC組（圖4A），表明沉默HEIH可以下調TE-1細胞HEIH表達。si-NC組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)與對照組相比無統(tǒng)計學差異;si-HEIH組細胞遷移率（圖4B、圖4C）和侵襲細胞數(shù)（圖4D、圖4E）低于對照組和si-NC組（Plt;0.01），表明下調HEIH表達可以抑制TE-1細胞遷移和侵襲。

2.5過表達HEIH逆轉青藤堿對TE-1細胞遷移和侵襲的影響" 青藤堿100 mg/L組HEIH表達量低于對照組（Plt;0.01），青藤堿100 mg/L組HEIH表達量與青藤堿100 mg/L+pcDNA組相比無統(tǒng)計學差異;青藤堿100 mg/L+pcDNA-HEIH組HEIH表達量高于青藤堿100 mg/L組和青藤堿100 mg/L+pcDNA組（Plt;0.01），表明過表達HEIH可以逆轉青藤堿抑制TE-1細胞HEIH表達的作用（圖5A）。青藤堿100 mg/L組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)低于對照組（Plt;0.01）;青藤堿100 mg/L組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)與青藤堿100 mg/L+pcDNA組相比無統(tǒng)計學差異，青藤堿100 mg/L+pcDNA-HEIH組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)高于青藤堿100 mg/L組和青藤堿100 mg/L+pcDNA組（Plt;0.01），表明過表達HEIH可以逆轉青藤堿對TE-1細胞遷移和侵襲的作用（圖5B～圖5E）。

3討論

食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。我國是世界上食管癌發(fā)病率最高的國家，盡管已有手術、化療等多種方法用于治療食管癌，但由于食管癌早期容易發(fā)生轉移引起腫瘤擴散，因此大部分患者預后較差[9]。目前，急需開發(fā)新的抗食管癌轉移藥物來改善患者預后。青藤堿是從青風藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿，近年研究發(fā)現(xiàn)青藤堿可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞轉移[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)青藤堿可以顯著降低食管癌細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)，表明青藤堿可以抑制食管癌細胞轉移，是一種潛在的抗食管癌轉移藥物，與上述研究一致。

近年來研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HEIH在多種腫瘤組織中呈過度表達，如肝癌、胃癌、乳腺癌等[13-15]。有文獻報道HEIH在食管癌組織中呈高表達，其表達水平與生存時間、腫瘤分級和TNM分期等臨床病理特征相關[16]。同時有報道顯示[17]，高表達HEIH食管癌患者預后明顯差于低表達患者。本研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA技術沉默食管癌細胞HEIH表達后，細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)明顯下降，表明沉默HEIH可以抑制食管癌細胞遷移和侵襲。

多項研究表明，青藤堿可以通過調控非編碼RNA起到抗腫瘤作用[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在青藤堿的作用下，HEIH表達顯著下降，同時食管癌細胞遷移和侵襲受到明顯抑制，而過表達HEIH可以逆轉青藤堿抑制食管癌細胞遷移和侵襲的作用，表明青藤堿通過調控HEIH表達起到抗食管癌作用。

綜上所述，青藤堿通過調控HEIH表達抑制食管癌細胞遷移和侵襲，是一種潛在的新型的抗食管癌轉移藥物。青藤堿作為一種中藥材提取的生物堿，具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點，因此其臨床應用前景非常廣闊。然而，本研究也有一些不足之處，比如，沒有開展動物實驗及臨床實驗驗證青藤堿對食管癌的作用，青藤堿調控HEIH表達的具體機制等，還需進一步研究。

參考文獻：

[1]宋春濤，于永洋，高振，等.局部晚期食管癌免疫治療的現(xiàn)狀及前景[J].實用腫瘤雜志，2023，38（2）：195-201.

[2]Huang J，Koulaouzidis A，Marlicz W，et al.Global Burden，Risk Factors，and Trends of Esophageal Cancer： An Analysis of Cancer Registries from 48 Countries[J].Cancers （Basel），2021，13（1）：141.

[3]He Y，Li D，Shan B，et al.Incidence and mortality of esophagus cancer in China，2008-2012[J].Chin J Cancer Res，2019，31（3）：426-434.

[4]Verstegen MH，Harker M，van de Water C，et al.Metastatic pattern in esophageal and gastric cancer： Influenced by site and histology[J].World J Gastroenterol，2020，26（39）：6037-6046.

[5]Zhang J，Ma W，Wu H，et al.Analysis of Homogeneous and Heterogeneous Factors for Bone Metastasis in Esophageal Cancer[J].Med Sci Monit，2019，25：9416-9425.

[6]齊冉，杜桂平，劉旭婷，等.帕博利珠單抗聯(lián)合化療一線治療晚期或轉移性食管癌的成本-效用分析[J].中國藥房，2022，33（12）：1466-1473.

[7]陳偉毅，秦春宏，陳延，等.青藤堿通過調控PI3K/AKT通路介導的上皮間質轉化抑制胰腺癌As PC-1細胞侵襲和轉移[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2022，39（11）：1419-1425.

[8]陳偉毅，洪煉哲，彭靖，等.青藤堿抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲及其與NF-κB信號通路的關系[J].中國普通外科雜志，2022，31（3）：359-368.

[9]周梓婷，顏建業(yè)，鄭智弦，等.食管癌患者血清中circAGFG1表達與預后的相關性[J].臨床檢驗雜志，2023，41（3）：200-203.

[10]Luo Y，Liu L，Zhao J，et al.PI3K/AKT1 Signaling Pathway Mediates Sinomenine-Induced Hepatocellular Carcinoma Cells Apoptosis：An in Vitro and in Vivo Study[J].Biol Pharm Bull，2022，45（5）：614-624.

[11]陳偉毅，陳延，唐峰.青藤堿通過COX-2/VEGF通路抑制胃癌MGC803細胞遷移和侵襲的研究[J].中國藥師，2020，23（12）：2337-2342.

[12]張慧敏，劉曉旭，謝佩玲，等.鹽酸青藤堿通過抑制bFGF介導的乳腺癌血管新生發(fā)揮抑瘤作用[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2021，42（6）：947-952.

[13]劉羨偉，高楠，黃蕾，等.LncRNA-HEIH、GP73、AFP在原發(fā)性肝癌中的表達及與臨床病理特征的關系[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2022，19（11）：1510-1513.

[14]Yang YJ，Luo S，Wang LS.Effects of lncRNA-HEIH on proliferation，apoptosis and invasion of gastric cancer cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2020，24（18）：9400-9407.

[15]Chen C，Gu C，Ren Q，et al.lncRNA HEIH，an indicator of high malignancy and poor prognosis，functions as an oncogene in breast cancer[J].Mol Med Rep，2020，22（4）：2869-2877.

[16]Wang D，You D，Pan Y，et al.Downregulation of lncRNA-HEIH curbs esophageal squamous cell carcinoma progression by modulating miR-4458/PBX3[J].Thorac Cancer，2020，11（7）：1963-1971.

[17]Ding X，Qi C，Min J，et al.Long non-coding RNA HEIH suppresses the expression of TP53 through enhancer of zeste homolog 2 in oesophageal squamous cell carcinoma[J].J Cell Mol Med，2020，24（18）：10551-10559.

[18]Xu Y，Jiang T，Wang C，et al.Sinomenine hydrochloride exerts antitumor outcome in ovarian cancer cells by inhibition of long non-coding RNA HOST2 expression[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol，2019，47（1）：4131-4138.

[19]Shen KH，Hung JH，Liao YC，et al.Sinomenine Inhibits Migration and Invasion of Human Lung Cancer Cell through Downregulating Expression of miR-21 and MMPs[J].Int J Mol Sci，2020，21（9）：3080.

[20]Gao G，Liang X，Ma W.Sinomenine restrains breast cancer cells proliferation，migration and invasion via modulation of miR-29/PDCD-4 axis[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol，2019，47（1）：3839-3846.

收稿日期：2023-09-16;修回日期：2023-09-30

編輯/肖婷婷

基金項目：1.國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：202212214009）;2.2022年度湖南省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：5021）;

3.湖南省自然科學基金項目（編號：2022JJ50290）;4.湖南省衛(wèi)生健康委科研課題（編號：202104081483）

作者簡介：陳中凱（2001.10-），男，湖南懷化人，本科，主要從事中藥抗腫瘤藥理研究

通訊作者：陳偉毅（1986.1-），男，湖南衡陽人，碩士，講師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤防治研究