結(jié)核分枝桿菌Rv3203蛋白的生物信息學(xué)及免疫信息學(xué)分析

摘要：目的 "運(yùn)用生物信息學(xué)及免疫信息學(xué)方法分析結(jié)核分枝桿菌（Mtb）Rv3203蛋白的結(jié)構(gòu)特征，為研究Rv3203蛋白在Mtb感染中的功能提供基礎(chǔ)。方法 "利用信息學(xué)軟件分別預(yù)測(cè)Rv3203蛋白的理化性質(zhì)、溶解度、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、相互作用蛋白、免疫原性、抗原性、毒性、致敏性，以及T、B細(xì)胞抗原表位和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，最后對(duì)Rv3203蛋白進(jìn)行密碼子優(yōu)化、計(jì)算機(jī)克隆和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 "Rv3203蛋白由224個(gè)氨基酸組成，理論等電點(diǎn)為4.68，為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的弱疏水性蛋白；無(wú)跨膜區(qū)和信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)，具有1個(gè)糖基化位點(diǎn)和11個(gè)磷酸化位點(diǎn)；與lipD、lipE、lipP、lipZ、amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204發(fā)生相互作用，參與Mtb的多種生物學(xué)過(guò)程；免疫原性為3.4211，抗原性為0.6533，無(wú)毒性，無(wú)致敏性；含5個(gè)CTL表位、1個(gè)Th表位和4個(gè)B細(xì)胞表位；二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)模型含大量的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲；經(jīng)密碼子優(yōu)化后可在大腸桿菌中克隆并高效表達(dá)；此外，Mtb的Rv3203蛋白還與Mycobacterium canettii CIPT 140010059具有高度同源性。結(jié)論 "Rv3203蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有熱穩(wěn)定性的酸性蛋白，具有免疫原性和抗原性，無(wú)毒性和致敏性，含多個(gè)T/B細(xì)胞表位，可在體外克隆并高效表達(dá)，參與Mtb的多種生物學(xué)過(guò)程及調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；Rv3203；生物信息學(xué)；免疫信息學(xué)

中圖分類號(hào)：R378.911 " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.21.005

文章編號(hào)：1006-1959（2024）21-0023-07

Bioinformatics and Immunoinformatics Analysis of Mycobacterium Tuberculosis Rv3203 Protein

YU Haiyan，REN Qin，MENG Yu，LI Guanghua，YANG Guoping

（Department of Medical Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Objective "To analyze the structural characteristics of Mycobacterium tuberculosis （Mtb） Rv3203 protein by bioinformatics and immunoinformatics methods， and to provide a basis for studying the function of Rv3203 protein in Mtb infection.Methods "The physicochemical properties， solubility， transmembrane region， signal peptide， subcellular localization， glycosylation site， phosphorylation site， interacting protein， immunogenicity， antigenicity， toxicity， allergenicity， T and B cell epitopes and secondary structure of Rv3203 protein were predicted by bioinformatics software， and the tertiary structure of the protein was modeled. Finally， the codon optimization， computer cloning and phylogenetic tree construction of Rv3203 protein were carried out.Results "Rv3203 protein was composed of 224 amino acids， and the theoretical isoelectric point was 4.68， which was a weakly hydrophobic protein with stable structure. No transmembrane region and signal peptide， located in the cytoplasm， with 1 glycosylation site and 11 phosphorylation sites; it interacted with lipD， lipE， lipP， lipZ， amiB2， amiC， bpoC， Rv0183， Rv1367c and Rv3204， and participated in various biological processes of Mtb. Immunogenicity was 3.4211， antigenicity was 0.6533， no toxicity， no sensitization; it contained 5 CTL epitopes， 1 Th epitope and 4 B cell epitopes. The secondary structure and tertiary model contained a large number of α-helices and random coils; after codon optimization， it could be cloned and efficiently expressed in E.coli; in addition， Mtb Rv3203 protein had high homology with Mycobacterium canettii CIPT 140010059.Conclusion "Rv3203 protein is an acidic protein with stable structure and thermal stability， with immunogenicity and antigenicity， non-toxicity and sensitization. It contains multiple T/B cell epitopes and can be cloned and efficiently expressed in vitro. It participates in various biological processes of Mtb and regulates the immune response of the host.

Key words：Mycobacterium tuberculosis;Rv3203;Bioinformatics;Immunoinformatics

結(jié)核病是一種主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染引起的傳染性疾病，是威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1，2]。Mtb細(xì)胞壁富含的脂質(zhì)，編碼參與脂質(zhì)/酯代謝的蛋白及酶，在細(xì)菌的生存、毒力發(fā)揮、與宿主細(xì)胞的相互作用和調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用，有利于Mtb抵御宿主惡劣的胞內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)Mtb的感染與致病。休眠期的Mtb處于代謝下調(diào)的非復(fù)制狀態(tài)，可逃避宿主的免疫應(yīng)答，并對(duì)常見(jiàn)抗結(jié)核藥物不敏感，少數(shù)的Mtb酶在潛伏感染期間保持上調(diào)，可能成為新的治療策略潛在靶點(diǎn)[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb“Lip”家族（LipC至LipZ）的LipV是由Rv3203基因編碼的一種酯酶/脂肪酶，參與Mtb的脂質(zhì)/酯代謝[5]，在Mtb進(jìn)入休眠期間和建立休眠后基因表達(dá)會(huì)上調(diào)，可能通過(guò)脂肪酶Rv3203降解三酰甘油（triacylglycerol， TAG）以釋放脂肪酸，提供Mtb生存的能量來(lái)源[6]。由于Rv3203在Mtb的休眠和再激活期間發(fā)揮關(guān)鍵的代謝作用，并對(duì)Mtb的細(xì)胞內(nèi)存活和體內(nèi)感染至關(guān)重要，具有作為研發(fā)抗Mtb感染治療靶點(diǎn)的潛力，用于結(jié)核病的預(yù)防。生物信息學(xué)技術(shù)可快速預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)和病原體的結(jié)構(gòu)和功能，以及人類免疫應(yīng)答機(jī)制，實(shí)現(xiàn)探索與了解病原體的致病原因，制定更科學(xué)的預(yù)防和治療方案，用于設(shè)計(jì)新的藥物和開(kāi)發(fā)疫苗。此外，免疫信息學(xué)的快速發(fā)展加速了靶抗原中免疫優(yōu)勢(shì)候選表位的篩選，提高疫苗生產(chǎn)效率，被廣泛用于設(shè)計(jì)針對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的疫苗[7，8]。為此本研究通過(guò)信息學(xué)軟件分析Rv3203蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能特征，旨在為深入解析Rv3203蛋白的生物學(xué)功能，闡明其在Mtb感染中的功能及以Rv3203為靶點(diǎn)的抗Mtb感染治療提供依據(jù)，并為抗結(jié)核疫苗候選優(yōu)勢(shì)抗原的篩選，以及研發(fā)含Rv3203蛋白表位的新型表位疫苗提供基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 "從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取MtbRv3203的基因序列及氨基酸序列，GeneID為888133，protein_id為NP_217719.1。

1.2方法 "使用ExpasyProtparam軟件預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)分子式、氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)（PI）、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂族指數(shù)、體外和體內(nèi)半衰期以及親水性總平均值（GRAVY）。使用Protein Sol預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的溶解度，若高于實(shí)驗(yàn)溶解度數(shù)據(jù)庫(kù)（PopAvrSol）的平均值0.45，則預(yù)測(cè)為可溶性蛋白[9]。分別使用DeepTMHMM、SingaIP-5.0 Server、PSORTb V3.0預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位。使用NetNGlyc-1.0 Server、NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)蛋白的糖基化及磷酸化位點(diǎn)。STRING在線軟件檢索與Rv3203相互作用的蛋白。使用Class Ⅰ Immunogenicity、VaxiJenv2.0和ToxinPred分別預(yù)測(cè)蛋白的免疫原性、抗原性和毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預(yù)測(cè)蛋白的致敏性[10]。用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、NetMHCpan 4.1 Server3種軟件綜合分析CTL表位，以MHC Ⅰ類分子亞型HLA-A2*0201、HLA-A3*0301和HLA-B7*0702，氨基酸長(zhǎng)度為9，預(yù)測(cè)Rv3203的CTL表位，對(duì)篩選的強(qiáng)結(jié)合表位使用Class Ⅰ Immunogenicity預(yù)測(cè)表位的免疫原性，VaxiJenv2.0預(yù)測(cè)表位的抗原性；ToxinPred預(yù)測(cè)表位的毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預(yù)測(cè)表位的致敏性，確定Rv3203的免疫顯性CTL表位。使用SYFPEITHI、NetMHCⅡpan4.0Server2種軟件綜合分析Th表位，以MHCⅡ類分子亞型HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501，氨基酸長(zhǎng)度為15，預(yù)測(cè)Rv3203的Th表位，對(duì)篩選的強(qiáng)結(jié)合表位使用Class Ⅰ Immunogenicity預(yù)測(cè)表位的免疫原性；VaxiJenv2.0預(yù)測(cè)表位的抗原性；IFNepitope預(yù)測(cè)IFN-γ誘導(dǎo)性，選擇預(yù)測(cè)陽(yáng)性表位[11]；ToxinPred預(yù)測(cè)毒性，AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預(yù)測(cè)致敏性，確定Rv3203的免疫顯性Th表位。使用ABCpred預(yù)測(cè)Rv3203蛋白的線性B細(xì)胞表位，表位長(zhǎng)度為20，閾值為0.51，并分別使用Class Ⅰ Immunogenicity、VaxiJenv2.0和ToxinPred軟件預(yù)測(cè)所篩選表位的免疫原性、抗原性和毒性；AllerTOPv.2.0和AllergenFPv.1.0預(yù)測(cè)致敏性，確定Rv3203蛋白的免疫顯性B細(xì)胞表位。使用ElliPro軟件預(yù)測(cè)構(gòu)象B細(xì)胞表位，有助于設(shè)計(jì)基于肽的疫苗和改進(jìn)B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)[12]。使用PSIPRED和Prabi軟件預(yù)測(cè)Rv3203蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]，I-TASSER（https：//zhanggroup.org//I-TASSER/）預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的3D模型，可通過(guò)模板建模得分（TM值）、建模置信分?jǐn)?shù)（C評(píng)分）和均方根偏差（RMSD）對(duì)模型進(jìn)行評(píng)分，C評(píng)分越高，模型的精度越高[14]。使用Java密碼子適應(yīng)工具（JCAT）（https：//jcat.de/），以大腸桿菌K12菌株作為宿主，輸出密碼子優(yōu)化指數(shù)（CAI）和GC含量百分比兩個(gè)參數(shù)，CAI的理想值為1，GC含量為30%～70%。使用SnapGene軟件完成計(jì)算機(jī)克隆，在pET28a（+）質(zhì)粒的SacⅠ和XbaⅠ限制位點(diǎn)之間插入Rv3203基因序列。通過(guò)NCBI-BLAST的Protein BLAST對(duì)Rv3203的蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并使用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果

2.1 Rv3203蛋白的理化性質(zhì)和溶解度分析 "Rv3203蛋白分子式為C1057H1673N291O310S7，含224個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為23 642.10 Da，PI值為4.68，不穩(wěn)定性指數(shù)為33.49，值小于40，表明該蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；脂族指數(shù)越高，蛋白的熱穩(wěn)定性越好，該蛋白脂肪指數(shù)為105.94，表明其具有較高的熱穩(wěn)定性；Rv3203蛋白在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞的體外半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌的體內(nèi)半衰期分別高于20 h和10 h，蛋白質(zhì)半衰期越長(zhǎng)表明其在細(xì)胞內(nèi)越穩(wěn)定；GRAVY為0.209，表明蛋白具有疏水性；溶解度為0.689，大于0.45，表明Rv3203蛋白為可溶性蛋白，可原核表達(dá)于大腸桿菌宿主內(nèi)獲取該蛋白。Rv3203蛋白的溶解度分析見(jiàn)圖1。

2.2 Rv3203蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) "結(jié)果顯示Rv3203蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)（圖2A），無(wú)信號(hào)肽（圖2B），可能定位于細(xì)胞質(zhì)，表明該蛋白不屬于跨膜蛋白，不是分泌蛋白。

2.3 Rv3203蛋白的糖基化及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) "預(yù)測(cè)顯示蛋白在第28位有一個(gè)糖基化位點(diǎn)（圖3A）；存在11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中含6個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖3B）；蛋白質(zhì)的磷酸化在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用，表明Rv3203蛋白參與Mtb感染期間的細(xì)胞信號(hào)傳遞。

2.4 Rv3203蛋白的相互作用蛋白分析 "結(jié)果顯示Rv3203蛋白可與lipD、lipE、lipP、lipZ、amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204等多個(gè)蛋白發(fā)生相互作用（圖4）。其中l(wèi)ipD、lipE、lipP、lipZ為脂肪酶/酯酶，屬于Mtb的Lip家族，參與Mtb的脂質(zhì)/酯質(zhì)代謝過(guò)程；amiB2和amiC為酰胺酶，參與氨基酸代謝過(guò)程；bpoC為過(guò)氧化物酶，參與多種生化代謝過(guò)程，包括脂質(zhì)代謝、氧化代謝和解毒等過(guò)程；Rv0183為可能的溶血磷脂酶，在慢性感染期間參與外源性宿主脂質(zhì)的水解；保守蛋白R(shí)v1367c與來(lái)自枯草芽孢桿菌的青霉素結(jié)合蛋白相似，可能為抗生素的作用靶點(diǎn)，與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，對(duì)臨床用藥及藥物開(kāi)發(fā)提供參考；Rv3204為一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，參與DNA的甲基化修飾過(guò)程，在基因的表達(dá)調(diào)控和許多天然化合物的合成中發(fā)揮重要作用；Rv3203與以上多種蛋白及酶相互作用，有助于揭示以Rv3203蛋白為核心的調(diào)控通路，提示Rv3203蛋白可能參與Mtb的脂質(zhì)/酯質(zhì)代謝、氨基酸代謝、氧化代謝、解毒、磷脂代謝、DNA的甲基化以及耐藥性過(guò)程。

2.5 Rv3203蛋白的免疫原性、抗原性、毒性和致敏性 "結(jié)果顯示該蛋白免疫原性為3.4211，抗原性為0.6533，無(wú)毒性，無(wú)致敏性，表明Rv3203蛋白具有良好的免疫原性和抗原性，無(wú)毒性和致敏性，可作為結(jié)核疫苗的候選免疫優(yōu)勢(shì)蛋白。

2.6 CTL表位預(yù)測(cè) "預(yù)測(cè)篩選Rv3203蛋白的CTL強(qiáng)結(jié)合表位，選擇免疫原性大于0，抗原性大于0.4，無(wú)毒性和致敏性的表位，綜合分析后篩選出5個(gè)優(yōu)勢(shì)CTL抗原表位（表1），可與抗原呈遞細(xì)胞上的MHCI分子結(jié)合形成抗原肽分子復(fù)合物，供CD8+T細(xì)胞識(shí)別后分化為CTL細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)Mtb的特異性識(shí)別和殺傷作用。

2.7 Th表位分析 "預(yù)測(cè)篩選Rv3203蛋白的強(qiáng)結(jié)合表位，選擇免疫原性大于0，抗原性大于0.4，IFN-γ誘導(dǎo)陽(yáng)性；無(wú)毒性和致敏性的表位，綜合分析后篩選出1個(gè)MHCⅡ類分子亞型為HLA-DRB1*0401，起始氨基酸位置為20，表位序列為AAPWTIDANVSALAA，SYFPEITI得分為28，NetMHCⅡpan 4.0 server等級(jí)為0.08，免疫原性為0.369 52，抗原性為1.0196，IFN-γ得分為2，誘導(dǎo)陽(yáng)性的優(yōu)勢(shì)Th表位，表明Rv3203蛋白能特異性激活T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生IFN-γ，誘導(dǎo)Th型細(xì)胞免疫保護(hù)反應(yīng)。

2.8線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) "結(jié)果顯示該蛋白含4個(gè)ABCpred得分高于0.80，免疫原性大于0，抗原性大于0.4，且無(wú)毒性和致敏性的B細(xì)胞抗原表位（表2），表明Rv3203蛋白可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。

2.9構(gòu)象B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) "結(jié)果顯示，Rv3203蛋白含125個(gè)殘基，分布在4個(gè)構(gòu)象B細(xì)胞表位中，值范圍為0.556至0.743（表3）；位于蛋白質(zhì)表面的構(gòu)象表位易與B細(xì)胞的BCR受體結(jié)合，而Rv3203蛋白含有多個(gè)構(gòu)象B細(xì)胞，表明該蛋白具有較強(qiáng)誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的能力。

2.10 Rv3203蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) "預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Rv3203蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含44.20%的α-螺旋、11.16%的延伸鏈和44.64%的無(wú)規(guī)則卷曲（圖5A）；預(yù)測(cè)的5個(gè)3D模型C評(píng)分分別為-0.34、-1.02、-0.35、-0.73和-1.68，因此選擇C評(píng)分為-0.34作為模擬Rv3203的最佳3D模型（圖5B），TM得分為0.67±0.13，RMSD為6.3±3.8？魡；以上結(jié)果表明Rv3203蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)中含有大量的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，易形成抗原表位，有利于與抗體的結(jié)合。

2.11密碼子優(yōu)化與計(jì)算機(jī)克隆 "密碼子優(yōu)化可提高蛋白的體外表達(dá)水平優(yōu)化后Rv3203蛋白的CAI值為1，GC含量為59.2%，表明該蛋白可在大腸桿菌（K12株）宿主中高效表達(dá)。將優(yōu)化的Rv3203基因序列插入pET28a質(zhì)粒中（圖6），獲得含6His標(biāo)簽序列的重組質(zhì)粒，表明Rv3203蛋白可與pET28a表達(dá)載體經(jīng)雙酶切后連接，并與載體的標(biāo)簽融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)及純化。

2.12 Rv3203蛋白的同源性及進(jìn)化分析 "H37Rv的Rv3203蛋白與Mycobacterium tuberculosis complex、Mycobacterium、Mycobacterium canettii、Mycobacterium canettii CIPT 140010059、Mycobacterium tuberculosis TRS13、Mycobacterium tuberculosis variant bovis、Mycobacterium canettii CIPT 140070010、Mycobacterium decipiens的氨基酸序列具有高度相似性（＞90%），對(duì)包括Mtb在內(nèi)的9個(gè)Rv3203蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示其與Mycobacterium canettii CIPT 140010059聚為一支，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化上彼此較近，可能來(lái)自相同的祖先。此外還發(fā)現(xiàn)，Mycobacterium decipiens與上述分枝桿菌相距較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一支（圖7）。

3討論

Mtb脂質(zhì)含量與其毒力密切相關(guān)，細(xì)胞壁中脂質(zhì)含量約占干重的60%，研究表明Mtb編碼大量參與脂質(zhì)/酯代謝的蛋白質(zhì)，與其毒力和致病性密切相關(guān)，因此干擾Mtb的脂質(zhì)/酯代謝是預(yù)防Mtb病感染的一種具有潛力的策略[4]。對(duì)Mtb脂質(zhì)/酯代謝途徑中特定脂肪酶/酯酶進(jìn)行基因功能研究可為發(fā)現(xiàn)Mtb的發(fā)病機(jī)制提供新的方法。

生物信息學(xué)方法分析顯示，Rv3203為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的酸性蛋白，且具有較高的熱穩(wěn)定性，有利于其在Mtb感染的體溫升高期間仍保持酶活性和穩(wěn)定性。Singh G等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Rv3203在酸性條件下特異性誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)構(gòu)仍保持穩(wěn)定，本研究與上述研究一致。Rv3203作為一種酸誘導(dǎo)蛋白，在Mtb抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境發(fā)揮著重要作用，有利于Mtb的存活與感染。此外，Rv3203蛋白屬于非跨膜蛋白，非分泌蛋白，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮功能；存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能參與酶的催化激活，調(diào)控Mtb細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，與多種Lip家族蛋白相互作用，如lipD、lipE、lipP、lipZ等，參與構(gòu)成Mtb的脂質(zhì)/酯質(zhì)；還與amiB2、amiC、bpoC、Rv0183、Rv1367c和Rv3204相互作用，溶血性磷脂酶Rv0183在Mtb磷脂代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可在宿主巨噬細(xì)胞細(xì)胞中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，在Mtb感染的毒力和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[16，17]。Rv3204蛋白刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）后可引發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)IL-12p40分泌，產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[18]。因此，Rv3203蛋白可能參與Mtb的脂質(zhì)/酯質(zhì)和磷脂代謝，調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，維持Mtb在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活與感染；還可能與Mtb的氨基酸代謝、氧化代謝、解毒、DNA的甲基化與耐藥性等過(guò)程有關(guān)。

免疫信息學(xué)分析可知，Rv3203蛋白具有良好免疫原性和抗原性，無(wú)毒性和致敏性，二、三級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易形成多個(gè)與抗體結(jié)合的抗原表位，誘導(dǎo)較高的免疫反應(yīng)。Mohammad O等[19]研究發(fā)現(xiàn)，古質(zhì)體-Rv3203免疫的動(dòng)物可誘導(dǎo)具有中樞和效應(yīng)記憶標(biāo)記物的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞群的增加，引起強(qiáng)烈的記憶反應(yīng)，對(duì)Mtb具有長(zhǎng)期保護(hù)作用的潛力，可彌補(bǔ)BCG免疫效力時(shí)間短暫的缺陷；還可增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞表面CD80（B7-1）和CD86（B7-2）共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞活化與抗原處理呈遞，增強(qiáng)抗原應(yīng)答信號(hào)；同時(shí)觀察到小鼠脾細(xì)胞分泌的IL-12和IFN-γ水平增加，引發(fā)比BCG和游離形式的Rv3203更顯著的Th1型免疫反應(yīng)，顯著降低小鼠肺部和脾臟中的細(xì)菌負(fù)荷，誘導(dǎo)顯著的抗結(jié)核保護(hù)性免疫應(yīng)答。這可能與Rv3203蛋白含多個(gè)免疫原性和抗原性良好，無(wú)毒性和致敏性的T細(xì)胞抗原表位，能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的CTL型細(xì)胞免疫反應(yīng)和具有免疫保護(hù)作用的Th型細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。該蛋白還含多個(gè)線性和構(gòu)象B細(xì)胞表位，可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液反應(yīng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可對(duì)這些表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步明確Rv3203蛋白在Mtb感染中介導(dǎo)的免疫應(yīng)答作用及候選疫苗表位的篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，蛋白質(zhì)在宿主中的有效克隆和表達(dá)對(duì)于疫苗的研發(fā)也至關(guān)重要，對(duì)Rv3203的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化可實(shí)現(xiàn)該蛋白在大腸桿菌（K12株）宿主中高效表達(dá)。構(gòu)建MtbRv3203基因的進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，其與Mycobacterium canettii CIPT 140010059具有較高的同源性，在進(jìn)化上相距較近，可能來(lái)自相同祖先，有助于了解疾病根源與演變，對(duì)開(kāi)發(fā)新藥物有重要指導(dǎo)意義。

綜上所述，Rv3203蛋白可在Mtb的休眠期誘導(dǎo)表達(dá)，參與Mtb的脂質(zhì)/酯代謝，對(duì)其生存至關(guān)重要，還可參與Mtb調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究利用多種生物信息學(xué)和免疫信息學(xué)軟件初步分析了Rv3203蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及功能，Rv3203蛋白的免疫學(xué)功能、致病機(jī)制，以及開(kāi)發(fā)安全、有效的以Rv3203為靶點(diǎn)的抗Mtb感染治療新的靶標(biāo)仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bagcchi S.WHO's Global Tuberculosis Report 2022[J].Lancet Microbe，2023，4（1）：e20.

[2]Yamazaki-Nakashimada MA，Unzueta A，Berenise Gámez-González L，et al.BCG：a vaccine with multiple faces[J].Hum Vaccin Immunother，2020，16（8）：1841-1850.

[3]Boom WH，Schaible UE，Achkar JM.The knowns and unknowns of latent Mycobacterium tuberculosis infection[J].Journal of Clinical Investigation，2021，131（3）：e136222.

[4]Chang DPS，Guan XL.Metabolic Versatility of Mycobacterium tuberculosis during Infection and "Dormancy[J].Metabolites，2021，11（2）：88.

[5]Yang D，He X，Li S，et al.Rv1075c of Mycobacterium tuberculosis is a GDSL-Like Esterase and Is Important for Intracellular Survival[J].J Infect Dis，2019，220（4）：677-686.

[6]Grabner GF，Xie H，Schweiger M，et al.Lipolysis：cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores[J].Nat Metab，2021，3（11）：1445-1465.

[7]王曉強(qiáng)，王文濤，劉暢，等.結(jié)核分枝桿菌fadA2蛋白的生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2023，18（10）：1141-1146.

[8]Cheng P，Jiang F，Wang G，et al.Bioinformatics analysis and consistency verification of a novel tuberculosis vaccine candidate HP13138PB[J].Front Immunol，2023，14：1154693.

[9]Hebditch M，Warwicker J.Charge and hydrophobicity are key features in sequence-trained machine learning models for predicting the biophysical properties of clinical-stage antibodies[J].Peer J，2019，7：e8199.

[10]Kanampalliwar AM.Reverse Vaccinology and Its Applications[J].Methods Mol Biol，2020，2131：1-16.

[11]Dhanda SK，Vir P，Raghava GP.Designing of interferon-gamma inducing MHC class-II binders[J].Biol Direct，2013，8：30.

[12]Cia G，Pucci F，Rooman M.Critical review of conformational B-cell epitope prediction methods[J].Briefings in Bioinformatics，2023，24（1）：bbac567.

[13]Buchan DWA，Jones DT.The PSIPRED Protein Analysis Workbench：20 years on[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W402-W407.

[14]Zhou X，Zheng W，Li Y，et al.I-TASSER-MTD：a deep-learning-based platform for multi-domain protein structure and function prediction[J].Nat Protoc，2022，17（10）：2326-2353.

[15]Singh G，Arya S，Narang D，et al.Characterization of an acid inducible lipase Rv3203 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv[J].Molecular Biology Reports，2014，41（1）：285-296.

[16]Nisa A，Kipper FC，Panigrahy D，et al.Different modalities of host cell death and their impact on Mycobacterium tuberculosis infection[J].Am J Physiol Cell Physiol，2022，323（5）：C1444-C1474.

[17]Grininger C，Leypold M，Aschauer P，et al.Structural Changes in the Cap of Rv0183/mtbMGL Modulate the Shape of the Binding Pocket[J].Biomolecules，2021，11（9）：1299.

[18]Agus R，Hidayah N，Sjafaraenan.Isolation and cloning of Rv3204 of Mycobacterium tuberculosis to Escherichia coli BL21 as vaccines tuberculosis：A preliminary Study[J].Journal of Physics Conference Series，2019，1341（2）：022010.

[19]Mohammad O，Kaur J，Singh G，et al.TLR Agonist Augments Prophylactic Potential of Acid Inducible Antigen Rv3203 against Mycobacterium tuberculosis H37Rv in Experimental Animals[J].PLoS One，2016，11（3）：e152240.

收稿日期：2023-10-31；修回日期：2023-11-08

編輯/肖婷婷