尖吻蝮蛇蛇毒酒的安全性評價研究

摘要：系統(tǒng)評價尖吻蝮蛇蛇毒酒（Deinagkistrodon acutus snake venom wine，DSVW）的出血、水腫、肌肉、肝腎毒性，為DSVW的安全生產和運用提供參考。取尖吻蝮蛇的新鮮蛇毒，加入高粱酒炮制獲得DSVW；運用小鼠模型皮下注射DSVW研究出血、水腫、肌肉毒性等急性毒性，通過口服21 d研究其對肝、腎組織的慢性毒性。結果表明， DSVW注射（5 mg/mL）的小鼠背部皮膚都沒有明顯的出血點（≤2.4 cm2），小鼠小腿增重與空白對照組無顯著差異，肌酸激酶為（0.32±0.03） U/mL與CK組（0.34±0.02） U/mL無顯著差異，DSVW無顯著的急性出血、水腫、肌肉毒性；DSVW灌胃［0.024 mg/（g·d）］的小鼠血清尿素、肌酐、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶分別為（6.04±0.83） μmol/L、（13.00±2.93） mmol/L、（36.67±9.29） U/L、（89.67±7.09）U/L，與CK組無顯著差異，且體重、腎肝質量、肝腎/體重、肝腎組織病理切片均無顯著差異，DSVW無顯著的慢性肝、腎毒性。經炮制獲得的DSVW的無出血、水腫、肌肉、肝腎毒性，為尖吻蝮蛇蛇毒酒安全生產和使用提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：尖吻蝮蛇蛇毒酒（Deinagkistrodon acutus snake venom wine，DSVW）；出血毒性；水腫毒性；肌肉毒性；肝腎毒性

中圖分類號：R996.3" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0158-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.029 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the safety evaluation of snake venom wine from Deinagkistrodon acutus

YANG Jing-li1，2，F(xiàn)ANG Xin-yue1，LI Zhi-kuan1，2，ZHANG Zhong-hua3，TAN Fa-xiang3，

DAI Kui3，LI Yu1，WANG Qing-fang1，LUO Kai2，HE Mei-jun1，2

（1. Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Enshi Comprehensive Experimental Station of National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System， Enshi" 445000，Hubei，China； 2. College of Biological and Food Engineering， Hubei Minzu University， Enshi" 445000，Hubei，China；3. Xuan’en County Zhaoliyuan Snake Industry Biotechnology Co.， Ltd.， Enshi" 445000，Hubei，China）

Abstract： The haemorrhagic， oedema， muscular， hepatic and renal toxicity of Deinagkistrodon acutus snake venom wine （DSVW） were systematically evaluated， providing reference for the safe production and application of DSVW. Fresh venom of Deinagkistrodon acutus was taken and concocted with sorghum wine to obtain DSVW； DSVW was injected subcutaneously in a mouse model to study the acute toxicity of haemorrhage， oedema， and muscular toxicity， and the chronic toxicity to liver and kidney tissues was studied by oral administration for 21 d. The results showed that none of the mice injected with DSVW （5 mg/mL） had obvious haemorrhages on the dorsal skin （≤2.4 cm2）， there was no significant difference in the weight gain of mice calves from the blank control group， the creatine kinase was （0.32±0.03） U/mL， which was not significantly different from that of the CK group （0.34±0.02） U/mL， and there was no significant acute haemorrhagic， oedema， and muscular toxicity of DSVW； the serum urea， creatinine， alanine aminotransferase and glutamine aminotransferase of DSVW gavaged ［0.024 mg/（g·d）］ mice were （6.04±0.83） μmol/L， （13.00±2.93） mmol/L， （36.67±9.29） U/L， and （89.67±7.09） U/L， respectively， which were not significantly different from those of CK group， and the body weights， renal-liver mass， liver and kidney/ body weight， liver and kidney histopathological sections were not significantly different， and DSVW did not have significant chronic hepatotoxicity or nephrotoxicity. The absence of haemorrhagic， oedema， muscular， hepatic and renal toxicity of DSVW obtained by concoction provided a theoretical basis for the safe production and use of Deinagkistrodon acutus snake venom wine.

Key words： Deinagkistrodon acutus snake venom wine； haemorrhagic toxicity； oedema toxicity； muscular toxicity； hepatorenal toxicity

收稿日期：2024-06-24

基金項目：國家中藥材產業(yè)技術體系項目（No.CARS-21）；恩施州科技計劃項目（No.XYJ2023000049；No.XYJ2023000044）

作者簡介：楊靜麗（1999-），女，河南林州人，在讀碩士研究生，研究方向為食品科學，（電話）18790785306（電子信箱）3101133474@qq.com；通信作者，何美軍（1973-），男，湖北恩施人，副研究員，博士，主要從事藥用植物學研究，（電話）15826675676（電子信箱）451014104@qq.com。

尖吻蝮蛇（Deinagkistrodon acutus），又叫蘄蛇、五步蛇，其蛇毒是一味名貴中藥材，在中國有幾千年的用藥歷史［1］。現(xiàn)代藥理學研究表明，尖吻蝮蛇蛇毒是由蛋白質、酶類、多肽分子以及其他小分子活性物質等組成的混合物，具有溶血栓、抗凝血、抗癌、止血、止痛等功效，被稱為“液體黃金”［2-5］。以尖吻蝮蛇蛇毒為原料經各種加工技術炮制獲得的尖吻蝮蛇蛇毒酒（DSVW）具有顯著的藥理功效，傳統(tǒng)用于治療風痹、驚搐、惡瘡、癩癬等疾?。?］。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)尖吻蝮蛇蛇毒屬于血液循環(huán)毒，主要含有絲氨酸蛋白酶家族、金屬蛋白酶家族、磷脂酶A2蛋白家族毒性蛋白成分，具有顯著的出血、水腫、肌肉、肝腎毒性，導致蛇傷患者嚴重的組織損傷或死亡［7-9］。其中，蛇毒金屬蛋白是最主要的出血活性蛋白，能抑制血小板聚集、水解基底膜、誘導細胞凋亡［10］。因此，以尖吻蝮蛇蛇毒為原料經各種加工技術炮制獲得的DSVW產品必須保障其毒性蛋白成分不能威脅人體健康。但是，目前市場上DSVW制品缺乏系統(tǒng)有效的安全評價標準，存在潛在的如造成人或動物組織出血、水腫、肌肉降解以及肝腎功能毒性，威脅人的健康與安全 ［11，12］。因此，以尖吻蝮蛇蛇毒為原料加工炮制DSVW，運用小鼠模型研究DSVW的出血、水腫、肌肉、肝腎毒性，系統(tǒng)評價DSVW的安全性，確保其安全生產和使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF級雄性昆明小鼠40只，體重18～22 g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號： SCXK（鄂）2020-0018。保持動物房通風良好，燈光照明每天12 h，溫度23～27 ℃，濕度60%～70%。

1.1.2 主要試劑與儀器 生理鹽水（北京普利萊基因技術有限公司，B1219）；肌酸激酶試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，A032-1-1）；PBS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，P397575）；鮮尖吻蝮蛇蛇毒（宣恩縣兆利源蛇業(yè)生物科技有限公司）；高粱酒（宣恩縣兆利源蛇業(yè)生物科技有限公司）；液體石蠟（上海滬試實驗室器材股份有限公司，P815701）；蘇木精染液（生工生物工程股份有限公司，E607317-0100）；伊紅染液（生工生物工程股份有限公司，E607321-0100）；多聚甲醛（上海源葉生物科技有限公司，R20497）；小鼠維持飼料（茂華生物科技有限公司）。

電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Q5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；全自動生化分析儀（邁瑞醫(yī)療器械有限公司）；高速離心機（德國NACHT）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Eclipse ci正置光學顯微鏡（日本尼康）；成像系統(tǒng)（日本尼康）等。

1.2 方法

1.2.1 蛇毒酒炮制 采取鮮尖吻蝮蛇蛇毒（無血混雜質），按1/50（V/V）加入50%Vol高粱白酒。浸泡、密封7 d進行炮制處理，然后裝瓶、壓蓋、輻照殺菌，獲得尖吻蝮蛇毒酒。

1.2.2 出血毒性研究 參照葉文娟等［13］的方法并稍作調整，用生理鹽水配制5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的蛇毒酒，皮下注射小鼠背部皮膚。2 h后處死小鼠，測量背側皮膚出血點的直徑。最小出血性劑量（MHD）為注射后2 h引起直徑10 mm出血點的劑量。

1.2.3 水腫毒性研究 參照肖綱［12］的方法并稍作調整，用生理鹽水配制5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的蛇毒酒皮下注射小鼠右足部，左足部皮下注射等體積的生理鹽水。注射后3 h處死小鼠，測量每只腳的重量。水腫定量為右肢相對于左肢體重增加的重量：水腫量=右肢體重-左肢體重。蛇毒的最小水腫劑量（MED）定義為注射了毒液的足部體重比對照組足部增加了120%的重量。

1.2.4 肌肉毒性研究 參照連琪［14］的方法并稍作調整，用生理鹽水配制5、2.5、1.25、0.625 mg/mL蛇毒酒皮下注射小鼠右腓腸肌。注射后3 h小鼠眼眶叢取血，在4 ℃下4 000 r/min離心10 min取血清，參考肌酸激酶（CK）測定試劑盒說明書測定酶活力。

1.2.5 肝、腎功能毒性研究 參照丁銳等［15］的方法并稍作調整，選取健康雄性昆明小鼠50只，適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為5組，每組10只：陰性組（NC）、空白組（CK）、低劑量蛇毒酒組、中劑量蛇毒酒組、高劑量蛇毒酒組。按照表1給藥，喂食喂水都不限制，持續(xù)14 d。末次給藥后1 h，小鼠眼眶叢取血，收集血樣4 ℃放置4 h。750 g離心15 min獲得血清，用全自動生化分析儀檢測尿素（Urea）、肌酐（CR）、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶。小鼠處死摘取腎臟和肝臟，小鼠腎組織和肝臟組織標本在10%中性緩沖的福爾馬林中4 ℃固定48 h以上，脫水后包埋石蠟，切片，并用蘇木精和伊紅（Hamp;E）染色，進行組織病理學研究。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”表示。Plt;0.05，表明具有顯著差異，Plt;0.01，表明具有極顯著差異。

2 結果與討論

2.1 DSVW的出血毒性

由圖1可知，不同劑量DSVW皮下注射的各組小鼠背部皮膚都沒有明顯的出血點，而未經炮制的蛇毒出現(xiàn)顯著的出血點（長2.0 cm，寬1.2 cm）。該研究結果表明，經炮制的DSVW不再具有出血毒性。

2.2 DSVW的水腫毒性

由圖2可知，不同劑量DSVW處理的小鼠小腿增重與CK組和高粱酒組的小腿增重均無顯著差異，無顯著水腫現(xiàn)象。因此，DSVW不具有水腫毒性。

2.3 DSVW的肌肉毒性

由圖3可知，不同劑量DSVW處理組的肌酸激酶分別為（0.32±0.03） U/mL、（0.33±0.01） U/mL、（0.33±0.02） U/mL、（0.33±0.02） U/mL（均在0～0.4 U/mL的正常水平范圍內），且與CK組（0.34±0.02） U/mL和高粱酒組（0.33±0.02） U/mL無顯著差異，DSVW不具有肌肉毒性。

2.4 DSVW的腎功能毒性

DSVW對小鼠腎臟組織形態(tài)學的影響見圖4a。肉眼觀察CK組小鼠腎臟外觀呈紅褐色，質地軟而富有彈性，邊緣整齊。DSVW處理組外觀顏色及質地與CK組相似。如圖4b所示，腎臟組織病理HE染色切片顯示CK組（2）染色均勻，腎小球、腎小管均結構完整，形狀正常，DSVW處理的低劑量（3）、中劑量（4）、高劑量（5）組的腎臟切片染色均勻，腎小球、腎小管形狀正常，未見炎性細胞浸潤及系膜基質細胞增生，無萎縮或擴張。DSVW對腎臟組織形態(tài)無顯著影響。

如表2所示，CK組與DSVW處理組的小鼠的體重、腎臟、腎臟/體重比均無顯著差異。不同劑量DSVW處理的低、中、高劑量組的腎功能指標尿素、肌酐含量分別為（6.04±0.83～6.34±0.97） μmol/L、（12.27±2.40～22.33±9.06） mmol/L，與CK組［（6.65±0.67） μmol/L、（19.07±4.82） mmol/L）］無顯著差異，說明DSVW不具有腎功能毒性。

2.5 DSVW的肝功能毒性

DSVW對小鼠肝組織形態(tài)學的影響見圖5a。肉眼觀察CK組和蛇毒酒處理組小鼠肝臟外觀呈紅褐色、質地軟而富有彈性、邊緣整齊，無明顯差異。如圖5b所示，陰性組（1）和CK組（2）小鼠肝臟組織學特征正常、染色均勻、細胞排列整齊、結構清晰；低劑量組（3）、中劑量組（4）和高劑量組（5）肝細胞組織學特征正常，呈放射狀分布，結構清晰，肝小葉結構完整，細胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，無病變情況。進一步證明不同劑量的蛇毒酒對小鼠肝細胞損失不明顯，無肝臟毒性。

如表3所示，CK組與DSVW處理組小鼠的體重、肝臟、肝臟/體重比均無顯著差異。不同劑量DSVW處理的低、中、高劑量組的肝功能指標谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶分別為（34.67±3.79～47.33±7.57） U/L、（82.67±13.58～127.67±22.50） U/L，與CK組［（38.67±1.15） U/L、（87.33±2.89） U/L］無顯著差異，說明DSVW不具有肝臟功能毒性。

3 小結

目前關于DSVW的安全性評價鮮有文獻報道，賀玲等［16］通過加入枸杞、50°糧食白酒等炮制獲得尖吻蝮蛇毒酒，并發(fā)現(xiàn)其具有抗疲勞、抗衰老、增強免疫力、促進飲食、增進性欲等多種藥理活性，但是未對其進行安全性評價研究。有學者研究發(fā)現(xiàn)乙醇處理能降低眼鏡蛇毒、五步蛇毒的致死量毒性，但是未研究其慢性毒性和乙醇降毒的作用機制［17，18］。本研究首次通過動物模型證實了通過高粱酒炮制的DSVW不具有出血、水腫、肌肉、肝腎毒性，為蛇毒酒安全生產和使用提供了科學依據(jù)。

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