鮟鱇魚肉多肽對小鼠急性毒性試驗(yàn)

摘要：為探討鮟鱇魚（Lophius litulon）肉多肽對小鼠的急性毒性作用，將健康的雄性清潔級ICR小鼠18只，隨機(jī)分為對照組、LPs低劑量組（2.5 g/kg）和LPs高劑量組（10 g/kg）3個(gè)組。每只小鼠按20 mL/kg進(jìn)行灌胃，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠初始體重、第7天體重及第14天體重，觀察小鼠的中毒癥狀以及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)束后小鼠眼球取血檢測其肝腎功能相關(guān)指標(biāo)，取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺觀察外觀及HE染色后組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，3組小鼠均未出現(xiàn)死亡，肝腎功能相關(guān)指標(biāo)與對照組相比無顯著差異（Pgt;0.05）。LPs高劑量組和LPs低劑量組小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺等外觀正常，HE染色后組織結(jié)構(gòu)清晰，未見到異常變化，鮟鱇魚肉多肽對小鼠無急性毒性作用。

關(guān)鍵詞：鮟鱇魚（Lophius litulon）；多肽；小鼠；急性毒性

中圖分類號：TS209" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0135-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.025 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Acute toxicity test of peptides from monkfish meat in mice

SHEN Lu-jia， SHEN Meng-ran， HE Jia-wei， TANG Jing， ZHANG Xi， YANG Zui-su

（Food and Pharmacy College， Zhejiang Ocean University， Zhoushan" 316022， Zhejiang， China）

Abstract：To investigate the acute toxicity of monkfish （Lophius litulon） polypeptides （LPs） in mice， eighteen healthy male ICR mice were randomly divided into three groups： control group， LPs low-dose group （2.5 g/kg）， and LPs high-dose group （10 g/kg）. Each mouse was administered with 20 mL/kg of LPs through gavage， and they were observed continuously for 14 days. The initial weight at the start of the experiment， weight on the 7th day， and weight on the 14th day were recorded." Signs of toxicity and mortality were also observed." At the end of the experiment， blood was collected from the mice’s eyeballs to test for liver and kidney function-related indicators. Heart， liver， kidney， spleen， and lungs were collected for external observation， and the tissues were subjected to HE staining for histological analysis." The results showed that no deaths occurred in any of the three groups of mice. Liver and kidney function-related indicators showed no significant differences compared to the control group （Pgt;0.05）. The heart， liver， kidney， spleen， and lungs of mice in the high-dose and low-dose LPs group appeared normal， and microscopic examination of tissues stained with HE revealed clear structures without abnormal changes. Therefore， Lophius litulon polypeptides had no acute toxicity in mice.

Key words： Lophius litulon；polypeptide；mouse；acute toxicity

收稿日期：2023-09-27

基金項(xiàng)目：浙江省基礎(chǔ)公益技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（LGN21D060002）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202210340028）

作者簡介：沈露佳（2002-），女，浙江紹興人，在讀本科生，專業(yè)方向?yàn)樗帉W(xué)，（電話）0580-2260600（電子信箱）shenlujia1029@163.com；通信作者，楊最素（1967-），女，浙江舟山人，教授，碩士，主要從事海洋藥物的功效研究，（電話）0580-2260600（電子信箱）yangzs87@163.com。

鮟鱇魚（Lophius litulon）又名琵琶魚、結(jié)巴魚、海鬼魚等，屬于脊索動物門（Chordata）脊椎動物亞門鮟鱇目鮟鱇科。鮟鱇魚主要分布于北太平洋西部海域，在中國沿海區(qū)域均有出產(chǎn)，是世界及中國重要經(jīng)濟(jì)魚種［1］，其在營養(yǎng)和藥用方面有很高的價(jià)值。在日本江戶時(shí)代，鮟鱇魚就被視為最高級的貢品，有“東部吃鮟鱇、西部吃河豚”的美譽(yù)［2］。鮟鱇魚作為食品加工原料被加工成新型食品，因其口感風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值廣泛受到人們歡迎［3］。目前，中國正在大力發(fā)展鮟鱇魚食品加工產(chǎn)業(yè)，在鮟鱇魚精深加工方面不斷加強(qiáng)開發(fā)力度。前期研究發(fā)現(xiàn)，鮟鱇魚肉是富含高蛋白、低脂肪、不飽和脂肪酸及有益礦物元素豐富的優(yōu)質(zhì)肉類［4］。以鮟鱇魚肉為原料，通過酶解方法制備的小于1 ku的鮟鱇魚肉多肽（Lophius litulon polypeptides，LPs）具有很好的抗氧化活性，LPs可能是生物活性肽的理想來源［5］。LPs通過調(diào)節(jié)AMPK和Nrf2途徑提高肝臟的抗氧化能力，以緩解高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝病的進(jìn)展［6］；同時(shí)，LPs通過降低高脂腎損傷小鼠模型的炎癥細(xì)胞因子水平，調(diào)節(jié)腸道生態(tài)失調(diào)，緩解腎臟的脂質(zhì)毒性［7］。因此，認(rèn)為LPs具有潛在的藥用價(jià)值，是值得開發(fā)的海洋多肽化合物。有關(guān)LPs安全性評價(jià)方面的研究鮮見報(bào)道，本研究以LPs為原料，以小鼠為試驗(yàn)對象進(jìn)行急性毒性研究，以期為LPs的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 CF16RXⅡ型高速低溫離心機(jī)（日本Hitachi公司）；BSA124S型電子天平（德國Satorius AG公司）；SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices 公司）；RLPHR 1-4LD型冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）；Leica切片機(jī)（德國萊卡公司）、CX31型光學(xué)顯微鏡及CCD攝像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.1.2 試劑 LPs（自制）；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、血清總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）、甘油三脂（TG）、堿性磷酸酶（ALP）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 18只雄性清潔級ICR小鼠購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，6周齡，體重為22～24 g，小鼠飼養(yǎng)在浙江海洋大學(xué)SPF級動物房（SYXK（浙）2019-0031）?？刂剖覝兀?0～25 ℃）和濕度（40%～45%），受控環(huán)境（12 h/12 h 光/暗循環(huán)）自由獲取無菌水和顆粒飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 LPs的制備 LPs的制備參考文獻(xiàn)［5］，鮟鱇魚肉預(yù)處理后勻漿，用95%乙醇溶液脫脂2 h，在料液比1∶5（m/V）、中性蛋白酶（2 000 U/g）條件下45 ℃消化5 h，將水解液煮沸10 min后使酶失活，然后使用超濾膜分離水解液，截獲分子質(zhì)量小于或等于" " 1 ku的多肽液，再利用超濾膜去除游離氨基酸，冷凍干燥得到小于1 ku的鮟鱇魚肉多肽（LPs），儲存在 -20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LPs對小鼠的急性毒性評估 按照《食品安全性毒理學(xué)評估程序和方法》GB 15193.3—2014（中國）進(jìn)行。禁食4 h后，將18只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為3組：對照組、LPs低劑量組（2.5 g/kg）和LPs高劑量組（10 g/kg），對照組給予相同體積的蒸餾水。每只小鼠按20 mL/kg劑量的LPs混懸液在12 h內(nèi)經(jīng)口灌胃。在給藥后0.5、1、2、4、6、10 h監(jiān)測小鼠的一般行為變化。試驗(yàn)期間觀察并記錄各組小鼠的飲食量、行為精神狀態(tài)、死亡情況等。

1.2.3 體質(zhì)量和臟器指數(shù)計(jì)算 記錄小鼠的初始體重、第7天和第14天的體重。給藥第14天，小鼠經(jīng)麻醉后眼球采血，處死解剖后取心臟、肝臟、脾臟、腎臟和肺臟稱重，分別計(jì)算各臟器的臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.4 血液生化指標(biāo)測定 小鼠眼球采血后室溫下靜置1～2 h后12 000 r/mim離心3 min，取上清液

-20 ℃保存。按照試劑盒操作說明書檢測AST、ALT、TP、ALP、CRE、BUN、TG和TC的含量。

1.2.5 臟器病理學(xué)觀察 取小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺等臟器進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)觀察，分別取1 cm3大小的組織，置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，采用常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚度切片、脫蠟至水，以HE染色后中性樹膠封片、光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。采用單因素方差分析（ANOVA），用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化及死亡率

試驗(yàn)期間小鼠均自由進(jìn)食、飲水，未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，試驗(yàn)處理組的小鼠生理狀態(tài)與對照組相似，無腹瀉、倦怠、嗜睡等現(xiàn)象發(fā)生，未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)中毒癥狀或死亡。試驗(yàn)期間小鼠體重均正常增長，如表1所示，LPs低劑量組、LPs高劑量組與對照組相比差異無顯著性（Pgt;0.05）。

2.2 小鼠主要臟器指數(shù)變化情況

小鼠臟器指數(shù)的影響結(jié)果如表2所示。LPs低劑量組、LPs高劑量組的心臟、脾臟、肺、肝臟、腎臟臟器指數(shù)與對照組相比，均無顯著差異（Pgt;0.05），因此，初步判斷LPs不會造成小鼠各臟器的病變。

2.3 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果

各組別小鼠的血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果如表3所示。由表3可知，LPs低劑量組、LPs高劑量組中AST、ALT、TP、ALP、CRE、BUN、TG、TC與對照組相比均無顯著差異（Pgt;0.05），說明LPs在小鼠的急性毒性試驗(yàn)中不會對小鼠的肝、腎功能造成損傷。

2.4 臟器病理學(xué)觀察結(jié)果

肉眼觀察各組別小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟的大體結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖1所示。3組小鼠各臟器均未出現(xiàn)明顯的腫大、萎縮、出血、充血、水腫、壞死及其他病理改變。各臟器HE染色結(jié)果如圖2所示。LPs處理組小鼠的心臟結(jié)構(gòu)中心肌細(xì)胞呈短柱狀，之間有豐富的毛細(xì)血管，未見心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和水腫反應(yīng)。肝臟中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇和肝索圍繞中央靜脈排列，肝細(xì)胞未見異常變化。脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓與紅髓分界清楚，脾索、脾竇及脾內(nèi)淋巴小結(jié)均清晰可見。肺組織中肺內(nèi)支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)未見滲出，肺間質(zhì)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。腎皮質(zhì)內(nèi)腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管未見水腫或壞死變化。說明LPs對小鼠的重要臟器無明顯的毒副作用。

3 討論與小結(jié)

近年來，從海洋生物及加工副產(chǎn)物中制備生物活性肽已成為研究熱點(diǎn)，除了重要的營養(yǎng)價(jià)值外，生物活性肽還具有顯著的生物活性和藥理功能，包括抗氧化、抗炎、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等，使海洋肽成為設(shè)計(jì)創(chuàng)新的保肝護(hù)腎、抗衰老、免疫增強(qiáng)、降血脂等藥物的分子基礎(chǔ)［8］。LPs是海洋生物活性肽的一種，可作為慢性病的補(bǔ)充劑或保肝、護(hù)腎藥物進(jìn)行研發(fā)。

為判斷藥物是否能進(jìn)行臨床應(yīng)用必須進(jìn)行藥物臨床前安全性評價(jià)，對于評估藥物臨床研究的風(fēng)險(xiǎn)因素和開發(fā)價(jià)值是重要的參考依據(jù)［9］。急性動物毒性試驗(yàn)是判斷藥物對機(jī)體毒副作用的第一步，經(jīng)觀察試驗(yàn)動物發(fā)生的各種中毒表現(xiàn)及程度，從而獲得藥物的半數(shù)致死量（LD50）及相關(guān)參數(shù)［10］。在預(yù)試驗(yàn)中無小鼠死亡，故無法計(jì)算LPs的LD50，因此采用最大耐受量測定法，觀察動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)［11］。本試驗(yàn)中選擇的低劑量組（2.5 g/kg）是一般人群日常使用量（14 mg/kg）的178倍，而高劑量組（10 g/kg）也未引起小鼠的生活狀態(tài)改變和死亡，且重要臟器的形態(tài)結(jié)構(gòu)也未發(fā)生變化，因此，LPs對小鼠的半數(shù)致死劑量（LD50）gt;10 g/kg，遠(yuǎn)超過人體的日常使用劑量，說明LPs是安全的，沒有毒性作用。

血液學(xué)參數(shù)的變化是毒性評估的一個(gè)具體指標(biāo)，對機(jī)體毒性有很高的預(yù)測價(jià)值［12，13］。肝臟和腎臟在藥物代謝、生物轉(zhuǎn)化和排泄中起重要作用，是藥物毒副作用的主要靶器官。藥物性的肝腎毒性是目前制約藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用的最大障礙［14，15］。肝腎功能的血液生化指標(biāo)是作為藥物急性毒性評價(jià)的重要指標(biāo)［16］。通過檢測與肝功能相關(guān)的特異性酶（ALT、AST、ALP）、蛋白質(zhì)合成能力（TP）及脂質(zhì)代謝水平（TG、TC）的含量，腎功能相關(guān)的（BUN、CRE）水平，發(fā)現(xiàn)LPs對肝、腎功能無顯著影響，說明LPs沒有對小鼠肝、腎健康產(chǎn)生不利影響。

通過觀察小鼠的生活狀態(tài)、臟器指數(shù)、臟器形態(tài)學(xué)及肝腎和血液指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量的LPs在試驗(yàn)期間未引起小鼠死亡，形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能均無顯著影響，初步證明了LPs的安全性，后期有必要評價(jià)其潛在的致突變性和致畸性，以期為LPs的研發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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