自然狀態(tài)下黃連與土壤環(huán)境主要因子的相互作用

摘要：采集自然狀態(tài)下生長(zhǎng)的黃連（Coptis chinensis Franch）根周圍的3個(gè)土壤樣本，以其附近空白區(qū)域土壤作為對(duì)照，對(duì)土壤樣本理化性質(zhì)、可培養(yǎng)微生物數(shù)量、微生物類群與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與對(duì)照土壤相比，黃連根周圍土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量、有效鉀含量、可培養(yǎng)真菌數(shù)量極顯著提高；土壤全氮含量、可培養(yǎng)細(xì)菌總量整體上顯著提高；硝態(tài)氮水平極顯著降低；可培養(yǎng)放線菌數(shù)量整體上變化不顯著；土壤原核微生物數(shù)量下降，病原真菌數(shù)量增加。

關(guān)鍵詞：黃連（Coptis chinensis Franch）； 理化因子； 微生物類群； 自然狀態(tài)； 土壤環(huán)境； 相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)：S567.5+2" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）12-0094-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.017 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The interaction between Coptis chinensis and major soil environmental factors

in natural state

WANG Qian1， FANG Zhi-wei 2， LI Shang-ren3， WANG Wen-juan4， WU Gao-ling1， WANG Zhi-yong1

（1.College of Biotechnology/Hubei Province South Characteristic Agricultural Industry Technology Research Institute， Xianning Vocational Technical College， Xianning" 437100，Hubei，China；2.Institute of Systems Biology/College of Life Science， Jianghan University，Wuhan" 430056， China；

3.Xianning Public Testing Center， Xianning" 437100， Hubei， China；4.College of Public Health and Health Professions， Hubei University of Science and Technology， Xianning" 437100， Hubei，China）

Abstract： Three soil samples around the roots of Coptis chinensis in the natural state were collected， and the surrounding blank areas were also collected as the control. The physical and chemical properties， cultivable microbial quantity， microbial groups， and community structure of these soil samples were analyzed. The results showed that， compared to the control soil， the pH， organic matter content， available phosphorus content， available potassium content， and the number of cultivable fungi in the soil around Coptis chinensis roots were significantly increased. The total nitrogen content and total cultivable bacteria in the soil were significantly increased compared to the control soil on the whole. The nitrate nitrogen level significantly decreased compared to the control soil. The number of cultivable actinomycetes did not show significant changes on the whole. The number of soil prokaryotic microorganisms decreased， while the number of pathogenic fungi increased.

Key words： Coptis chinensis Franch； physicochemical factors； microbial group； natural state； soil environment； correlation analysis

收稿日期：2024-08-27

基金項(xiàng)目：中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展基金項(xiàng)目（Z135050009017-429）；咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)課題（2022Y038）

作者簡(jiǎn)介：王 潛（1994-），男，湖北咸寧人，主要從事園藝園林技術(shù)研究，（電話）18672330646（電子信箱）919700025@qq.com；并列第一作者，方治偉（1984-），男，河南開封人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事生物信息學(xué)研究，（電話）13554678690（電子信箱）304734978@qq.com；李尚仁（1982-），男，湖北陽新人，醫(yī)藥工程師，主要從事藥品檢查研究，（電話）18972810653（電子信箱）229057897@qq.com；通信作者，王志勇（1967-），男，湖北咸寧人，教授，碩士，主要從事應(yīng)用生物技術(shù)研究，（電話）13508649407（電子信箱）472027278@qq.com。

黃連（Coptis chinensis Franch）是毛茛科黃連屬多年生植物，屬于《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》中的三級(jí)保護(hù)藥材，別名味連，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后各朝代重要醫(yī)藥典籍均有記載，認(rèn)為其性寒、味苦，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，有清熱、燥濕、解毒、瀉火等功效。用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、黃疸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、心悸不寧、血熱吐衄、目赤、牙痛、消渴、癰腫疔瘡；外治濕疹、濕瘡、耳道流膿。歷版《中華人民共和國(guó)藥典》所述黃連分別稱“味連”“雅連”“云連”，均為多年生草本植物，以干燥根莖入藥。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，宋代以前古方書中有312萬多方劑，約5%的方劑中有黃連。據(jù)《全國(guó)中成藥品種目錄》統(tǒng)計(jì)，以黃連作原料的中成藥品種有108種［1］。

目前國(guó)內(nèi)黃連人工栽培已有一定規(guī)模，如重慶市石柱土家族自治縣已建GAP示范基地，是國(guó)內(nèi)最大的黃連生產(chǎn)、銷售基地。但黃連育苗移栽后需5～7年成熟，其產(chǎn)量也受諸多因素制約，而且黃連與其他中藥材一樣存在連作障礙［2］，因此嚴(yán)重制約了黃連的人工栽培。

通過研究自然條件下黃連與土壤理化因子及微生物間的相互作用，能更好地反映黃連的真實(shí)生長(zhǎng)需求，并更好地指導(dǎo)黃連人工栽培，從而減少對(duì)野生黃連的消耗，進(jìn)而更好地保護(hù)野生黃連資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理 采樣時(shí)間為2022年5月。采樣地點(diǎn)為湖北省咸寧九宮山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，具體地點(diǎn)為東經(jīng)114°36′3″，北緯29°23′1″，海拔1 085 m。采樣區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，四季分明；晝夜溫差較大，盛夏多風(fēng)；年均氣溫11.7 ℃，降雨量大，年降雨量約1 681 mm，相對(duì)濕度較大。

由于野生黃連數(shù)量有限，在采樣區(qū)選擇3個(gè)約100 m2的區(qū)域進(jìn)行土壤樣品的采集，每個(gè)區(qū)域約生長(zhǎng)80株野生黃連，采樣時(shí)沿南北方向按“S”形路線，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)選擇生長(zhǎng)4年以上、大小規(guī)格相近的黃連根周圍土壤作為研究對(duì)象（直徑約10 cm，分別編號(hào)為1-1、2-1、3-1），以采樣區(qū)中無黃連著生處相應(yīng)的土壤為對(duì)照（分別編號(hào)為1-0、2-0、3-0），采集土樣，采樣深度為0～15 cm。采集黃連根周圍土樣后，隨即用周圍土壤將采樣坑還原，并對(duì)黃連澆足定根水，盡量保證對(duì)黃連生長(zhǎng)影響最小。土樣充分混合后立即風(fēng)干至濕度為20%～30%，過2 mm篩，盡量在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定分析［3］。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～20 g，無菌水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

2）改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15～20 g，無菌水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

3）高氏一號(hào)培養(yǎng)基?？扇苄缘矸?0 g，NaCl 0.5 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂15～20 g，無菌水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.1.3 試劑及儀器設(shè)備

1）主要試劑。重鉻酸鉀、硫酸亞鐵、硝酸鉀、氯化鈉、硼酸均為分析純，硫酸（優(yōu)級(jí)純），均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；二硝基酚指示劑、氯化鉀（分析純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒（Fast DNA? Spin Kit for soil，116560，MP Biomedicals，USA）；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209，天根生化科技有限公司）；2×SG Green qPCR Mix （with ROX，Q1002，SinoGene Scientific Co.，Ltd.）；DL2000 DNA marker （3427A，TaKaRa Bio Inc.）；Qubit? dsDNA Assay Kit in Qubit? 2.0 Flurometer（Life Technologies，CA， USA）；NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina? （NEB， USA）。

2）主要儀器設(shè)備。pH計(jì)（FE20型）、電子分析天平（XS105DU型），METTLER TOLEDO；全自動(dòng)凱氏定氮儀（K9860型），濟(jì)南海能儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2450型）、原子吸收分光光度計(jì)（AA7000型），SHIMADZU；培養(yǎng)箱（GXZ型），寧波東南儀器有限公司；超聲波破碎儀（Covaris M220型），江蘇肯爾菲實(shí)驗(yàn)儀器貿(mào)易有限公司；生物分析儀（Agilent 2100型），安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；NovaSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，Illumina Inc.，USA；定量PCR儀（CFX Manager），Bio-Rad Laboratories；電泳儀（DYY-3C型）、凝膠成像儀（WD-9413A型），北京六一生物科技有限公司；臺(tái)式離心機(jī)（MedifugeTM型），賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)分析 土壤pH的測(cè)定采用電極法；土壤有機(jī)質(zhì)（OM）的測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法；土壤全氮（TN）的測(cè)定采用凱氏定氮法；土壤硝態(tài)氮（NO3-N）的測(cè)定采用紫外分光光度法；土壤有效磷（A-P）的測(cè)定采用氟化銨-鹽酸提取-鉬銻抗比色法；土壤速效鉀（A-K）的測(cè)定采用醋酸銨提取-原子吸收分光光度法；土壤含水量的測(cè)定采用常規(guī)的烘干稱重和風(fēng)干稱重的方法［4］。

1.2.2 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測(cè)定 對(duì)各采樣點(diǎn)的混合土樣，參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［5］，以稀釋平板計(jì)數(shù)法利用“1.1.2”項(xiàng)的培養(yǎng)基分別測(cè)定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。

1.2.3 土壤微生物類群及多樣性分析 考慮到各樣品在同一片區(qū)域微生物類群及多樣性存在相似性，本研究選擇1-0、1-1這一組樣品，先采用CTAB法提取總DNA［6］，然后送北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序，采用NCBI-nt庫(kù)構(gòu)建物種分類特征數(shù)據(jù)庫(kù)，后采用Kraken2軟件估算物種豐度，并計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)［3］。

1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件、Excel軟件進(jìn)行各數(shù)據(jù)的方差分析、單因素分析、相關(guān)性分析，利用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然狀態(tài)下黃連根周圍土壤理化因子的變化

從表1可以看出，黃連根周圍土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量、有效鉀含量比對(duì)照土壤極顯著提高，土壤全氮含量比對(duì)照土壤顯著或極顯著提高；但是黃連根周圍土壤硝態(tài)氮含量比對(duì)照土壤極顯著降低。

自然條件下土壤有效磷和有效鉀的來源主要是土壤難以利用磷和鉀的分解。在黃連生長(zhǎng)的條件下，黃連會(huì)通過根部分泌部分有機(jī)物質(zhì)，這些有機(jī)物質(zhì)能與土壤難溶性磷鉀礦物質(zhì)發(fā)生作用，促進(jìn)其有效成分的釋放，進(jìn)而提高了土壤中有效磷、有效鉀的含量。黃連根周圍因黃連生長(zhǎng)產(chǎn)生的枯枝落葉及根系分泌物的產(chǎn)生，使得土壤有機(jī)質(zhì)含量與總氮含量均比對(duì)照高。研究表明，黃連在生長(zhǎng)過程中通過多種途徑向土壤中釋放小檗堿、黃連堿等多種生物堿［7］，因此黃連根周圍的土壤pH提高。

2.2 可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)結(jié)果

由圖1可以看出，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均顯著增加，可培養(yǎng)真菌數(shù)量均極顯著增加，可培養(yǎng)放線菌數(shù)量變化除樣品2-0與2-1外均不顯著。

微生物的活動(dòng)通常與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，由于黃連生長(zhǎng)使其根周圍土壤有機(jī)質(zhì)含量增加顯著，因此細(xì)菌和真菌數(shù)量增加也顯著，放線菌數(shù)量變化雖多數(shù)樣品不顯著，但均呈增加趨勢(shì)。

2.3 各檢測(cè)數(shù)據(jù)間相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果（表2）顯示，pH與有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分含量呈負(fù)相關(guān)，與微生物數(shù)量呈正相關(guān)。不同類型土壤pH與有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分含量之間相關(guān)性不同。郭明全等［8］對(duì)攀枝花煙區(qū)750個(gè)土壤樣本的pH與土壤養(yǎng)分間的關(guān)系研究表明，土壤pH與速效磷、速效鉀存在顯著的負(fù)相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)、堿解氮呈顯著正相關(guān)。趙藝等［9］對(duì)內(nèi)江市白馬鎮(zhèn)的土壤研究顯示，土壤pH與土壤速效磷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與土壤緩效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與水解性氮含量相關(guān)性不明顯。這可能是不同土壤及其生境特點(diǎn)所致。本研究中采樣點(diǎn)海拔較高，氣候、土壤濕潤(rùn)，因此呈現(xiàn)出特有的結(jié)果。采樣點(diǎn)酸堿度不高，因此微生物的活動(dòng)利于酸堿度的穩(wěn)定。有機(jī)質(zhì)含量與pH、全氮、硝態(tài)氮、有效磷含量呈負(fù)相關(guān)，與有效鉀含量及微生物數(shù)量呈正相關(guān)，原因也大體如此。

一般植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收呈一定的相對(duì)比例，因此全氮含量與速效養(yǎng)分的含量呈正相關(guān)，速效養(yǎng)分含量之間均呈正相關(guān)。全氮、硝態(tài)氮含量與有機(jī)質(zhì)含量、微生物數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)樽匀粻顟B(tài)下微生物比較活躍的活動(dòng)消耗了土壤中的氧氣，導(dǎo)致通氣變差，反硝化作用上升，引起氮素?fù)p失。該結(jié)果與黃連的生長(zhǎng)環(huán)境一致，表明黃連喜歡濕潤(rùn)環(huán)境，土壤含水量需在50%以上才可以保證黃連生長(zhǎng)良好［10］。自然條件下，有機(jī)質(zhì)來源少，有機(jī)質(zhì)含量低時(shí)微生物的活動(dòng)相對(duì)較弱，反硝化作用弱，氮素含量以及硝態(tài)氮反而會(huì)增加。

不同土壤有效磷含量與微生物量的相關(guān)性有一些差別。土壤有效磷含量高促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致微生物總量增加。程偉［11］的研究顯示，黑鈣土土壤有效磷含量與微生物量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的特性，這是因?yàn)槲⑸锏拇罅糠敝诚牧送寥乐杏邢薜乃傩Я祝狙芯拷Y(jié)果與之一致。

2.4 微生物類群與多樣性分析

測(cè)序結(jié)果僅保留相對(duì)豐度大于0.02%的類群用于后續(xù)分析，分析結(jié)果見表3。

由表3可以看出，1號(hào)采樣區(qū)對(duì)照土壤與根際土壤檢測(cè)到的原核微生物從門到科的數(shù)量差別不大，但檢測(cè)到的屬和種數(shù)量均多于黃連根際土壤。對(duì)照土壤與根際土壤檢測(cè)到的真菌從門到種的數(shù)量差別不大，種的數(shù)量較屬、科、目少，其原因可能是檢測(cè)到的真菌類群數(shù)量較大，許多真菌種的相對(duì)豐度較小，但1個(gè)屬多個(gè)豐度較小的真菌加和起來導(dǎo)致屬、科、目的相對(duì)豐度反而較大。根周圍土壤與對(duì)照區(qū)原核微生物與真菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均差別不大。

黃連主要病害包括黃連白粉病、根腐病、白絹病和炭疽?。?2］。從宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中可以搜索到引起白粉?。鄄际习追劬˙lumeria graminis）］、根腐病［金黃尖鐮孢（Fusarium oxysporum）］的2種病原菌，且根際土壤中的相對(duì)豐度較大；未發(fā)現(xiàn)白絹病和炭疽病的病原菌，可能是自然狀態(tài)下因海拔較高，這些病原菌的傳播受到一定影響，未能到達(dá)該區(qū)域。另有研究表明，食酸菌屬的細(xì)菌數(shù)量在發(fā)病根際土壤增加，很可能與黃連病害發(fā)生有關(guān)［13］。宏基因組分析中也檢測(cè)到食酸菌屬的多個(gè)種，但根際土壤與對(duì)照土壤食酸菌類豐度差別不大（表4）。

主要反硝化細(xì)菌，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）、脫氮硫桿菌（Thiobacillus denitrificans）均可見，且豐度均較高，根際土壤與對(duì)照土壤相對(duì)豐度差別不大。

3 討論與小結(jié)

3.1 自然條件下黃連生長(zhǎng)與土壤理化因素的相互作用及其對(duì)人工栽培的啟示

土壤理化性質(zhì)與植物發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、土壤微生物群落組成等密切相關(guān)。其中pH、有機(jī)質(zhì)含量、主要營(yíng)養(yǎng)元素含量等直接影響植物生態(tài)平衡，間接改變環(huán)境微生物的活性及群落多樣性。根系分泌物堆積會(huì)直接改變土壤多種理化性質(zhì)，如酚酸、生物堿等物質(zhì)的分泌會(huì)改變土壤酸堿度，改變土壤有效營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，導(dǎo)致植物根系微生物數(shù)量、類群及多樣性的變化。許多陸生植物生長(zhǎng)過程中土壤硝態(tài)氮的變化與土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀含量變化相似，都比對(duì)照高［14］。本研究中由于自然條件下黃連生長(zhǎng)環(huán)境濕度較大，土壤含水量較高，黃連生長(zhǎng)環(huán)境中存在較多的反硝化細(xì)菌（與宏基因組分析結(jié)果一致），另外黃連在生長(zhǎng)過程中會(huì)向環(huán)境釋放生物堿，且自然條件下沒有人為施用速效氮肥，即使在土壤全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量均增加時(shí)，土壤硝態(tài)氮含量依然顯著下降。因此黃連人工栽培時(shí)要特別注意這個(gè)特殊現(xiàn)象，既要保持黃連生長(zhǎng)對(duì)土壤水分與空氣濕度的需求，又要注意控制水分，避免水分過多引起反硝化作用，使黃連生長(zhǎng)所需速效氮不足，引起黃連生長(zhǎng)緩慢。栽培實(shí)踐中要少量多次施用速效的硝態(tài)氮，同時(shí)注意配合其他速效營(yíng)養(yǎng)的施用。

3.2 自然條件下黃連生長(zhǎng)與土壤微生物間的相互作用及其對(duì)人工栽培的啟示

在生長(zhǎng)過程中，植物與土壤微生物之間相互作用，有益和有害微生物通常處于動(dòng)態(tài)平衡。一些植物特別是外來入侵植物在其生長(zhǎng)過程中與土壤微生物間存在比較顯著的相互促進(jìn)關(guān)系［15］。本研究結(jié)果顯示，在自然條件下，黃連連作時(shí)會(huì)導(dǎo)致病原真菌豐度增加，有益菌在競(jìng)爭(zhēng)中往往表現(xiàn)出弱勢(shì)，進(jìn)而嚴(yán)重影響后茬植物的生長(zhǎng)發(fā)育，形成連作障礙。

土壤環(huán)境中既存在對(duì)植物生長(zhǎng)有益的微生物，也存在對(duì)植物生長(zhǎng)有害的微生物。因此，從人工栽培的角度出發(fā)，分離篩選有益的對(duì)黃連生長(zhǎng)具有促進(jìn)與保護(hù)作用的微生物并應(yīng)用到黃連栽培中具有重要意義。

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