花椒精油成分分析及其對四種植物病原真菌的抗菌作用

摘要：采用索氏提取法制備花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）精油，利用菌絲生長速率法評價花椒精油對尖鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schltdl）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schwabe）、盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides Penz. amp; Sacc.）和茄鏈格孢菌（Alternaria solani）菌絲生長的抑制活性，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）探究花椒精油的物質(zhì)組成。結(jié)果表明，花椒精油對禾谷鐮孢菌、尖鐮刀菌、盤長孢狀刺盤孢和茄鏈格孢菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）分別為1.552、2.243、6.064、7.078 mg/mL。GC-MS分析顯示，花椒精油中的主要成分為萜類化合物，包括乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-檸檬烯和桉葉油醇等。

關(guān)鍵詞：花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）精油；成分分析；植物病原真菌；抗菌作用

中圖分類號：S482.2+92；R284.1" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0062-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.011 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Zanthoxylum bungeanum essential oil composition analysis and its antifungal activity on four kinds of plant pathogenic fungi

LI Cheng-zhao1，2， LIU Yu-jie1，2， WANG Wei-feng1，3， MENG Xian-hua1，3， CAO Yong-hong4， SU Qun5，

WANG Jun1，2， YANG Jun-li3

（1.Yantai Zhongke Research Institute of Advanced Materials and Green Chemical Engineering， Yantai" 264000， Shandong，China；2.Shandong Laboratory of Advanced Materials and Green Manufacturing at Yantai，Yantai" 264000， Shandong，China；3.Lanzhou Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province， Lanzhou" 730000，China；4.Zanthoxylum Bungeanum Research Institute， Longnan Economic Forest Research Institute， Longnan" 746000，Gansu，China；5.Baoyuan Bio-Agri Science amp; Technology （Shandong） Co.， Ltd.， Yantai" 264000，Shandong，China）

Abstract： Zanthoxylum bungeanum essential oil was extracted using the Soxhlet method. The effects of Zanthoxylum bungeanum essential oil on Fusarium oxysporum， Fusarium graminearum， Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria solani were evaluated by the mycelial growth rate method. The composition of Zanthoxylum bungeanum essential oil was analyzed using gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results showed that Zanthoxylum bungeanum essential oil exhibited antifungal activity Fusarium graminiearum， Fusarium oxysporum， Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria solani， with median effect concentration（EC50） of 1.552， 2.243， 6.064， 7.078 mg/mL， respectively. GC-MS analysis revealed that the principal constituents of Zanthoxylum zanthoxylum essential oil were terpenoids including linalyl acetate， linalool， D-limonene and eucalyptol.

Key words： Zanthoxylum bungeanum essential oil； composition analysis； plant pathogenic fungi； antifungal activity

收稿日期：2024-09-12

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32270419）；山東省自然科學(xué)基金資助項目（ZR2021MB089；ZR2023MC040）；煙臺先進(jìn)材料與綠色制造山東省實驗室項目（E1R03SXM04）；煙臺開發(fā)區(qū)科技領(lǐng)軍項目（2022RC005）；隴南市科技計劃項目（2022-S˙QKJ-03）

作者簡介：李承釗（1997-），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，（電話）19553582293（電子信箱）lichengzhao1997@163.com；通信作者，楊軍麗（1983-），山西陽泉人，研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，（電子信箱）yangjl@licp.cas.cn；王 君（1991-），山東濟(jì)南人，助理研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，（電話）17863829607（電子信箱）licpwangjun@163.com。

植物病害是為害全球農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，每年因植物病害造成的全球農(nóng)作物減產(chǎn)量高達(dá)30%～50%。引起植物病害的病原體主要包括真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲等［1］，其中植物真菌病害占植物病害的70%～80%［2］。茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、尖鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schltdl）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schwabe）、盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides Penz. amp; Sacc.）是中國常見的植物病原真菌，尖鐮刀菌、禾谷鐮孢菌、盤長孢狀刺盤孢菌被國際著名期刊《Molecular Plant Pathology》雜志評為分子植物病理學(xué)中的十大病原真菌［3］。

茄鏈格孢菌是早疫病的致病菌，該病原菌主要在作物開花結(jié)果期或地下莖塊膨大期侵染番茄、馬鈴薯等經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物的莖、葉、果實，可造成農(nóng)作物減產(chǎn)20%以上，嚴(yán)重時甚至造成農(nóng)作物絕收，給糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大損失［4，5］。茄鏈格孢菌主要通過產(chǎn)生細(xì)交鏈格孢菌酮酸（TeA）毒素，誘導(dǎo)活性氧在葉綠體中爆發(fā)，引起葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致大量活性氧擴(kuò)散到整個細(xì)胞中，進(jìn)一步誘導(dǎo)膜脂過氧化、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器解體、細(xì)胞核濃縮和DNA斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織壞死，最終殺死植物［6］。禾谷鐮孢菌是一種重要的流行性、毀滅性真菌病害，廣泛存在于土壤和綠色植物殘體上，可侵染小麥、玉米等多種禾谷類作物，誘導(dǎo)赤霉病和根腐病等植物病害的發(fā)生，導(dǎo)致糧食作物大幅減產(chǎn)甚至絕收［7］。此外，禾谷鐮孢菌在感病子粒中會產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮類（Zearalenone，ZEN）等多種毒素，嚴(yán)重影響食品安全，威脅人畜的生命健康［8］。盤長孢狀刺盤孢是炭疽病的主要致病菌，具有寄主范圍廣泛、危害性強(qiáng)的特點(diǎn)［9］。盤長孢狀刺盤孢作為一類半生物營養(yǎng)型真菌病原體，主要采用生物營養(yǎng)和壞死營養(yǎng)的策略感染植物，可侵染農(nóng)作物的多個部位，特別是接近成熟的果實，僅在農(nóng)作物采后的儲存、運(yùn)輸和銷售過程就可造成農(nóng)作物產(chǎn)量損失40%～80%，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大損失［10］。尖鐮刀菌是枯萎病的致病菌，主要通過引起植物維管的枯萎誘導(dǎo)甜瓜、番茄、棉花和香蕉等作物維管束褐變、發(fā)育遲緩、根部腐爛、落葉和植物死亡［11］。

化學(xué)防治依然是目前防治植物真菌病害的主要手段。但由于化學(xué)殺菌劑的長期不合理使用，導(dǎo)致的“3R”問題（抗性resistance、再增猖獗resurgence、殘留residue）越來越不容忽視。因此，尋求和開發(fā)新型、高效、綠色的殺菌劑迫在眉睫。植物在不斷進(jìn)化的過程中會產(chǎn)生一些具有抵御病蟲害侵?jǐn)_的次生代謝物質(zhì)［12］。利用這些具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物開發(fā)的植物源殺菌劑與傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑相比，具有選擇性強(qiáng)、作用靶標(biāo)專一、對非靶標(biāo)生物相對安全、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［13］。因此，開發(fā)新型植物源殺菌劑對促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展和糧食安全具有重要意義。

植物精油具有顯著的抗植物病原菌活性，也是一類抗植物病原菌研究比較廣泛的植物提取物，其中萜類化合物被認(rèn)為是植物精油中起抗菌作用的主要活性物質(zhì)［14］?；ń罚╖anthoxylum bungeanum Maxim.）精油是植物精油，因其獨(dú)特的風(fēng)味和藥用價值而受到廣泛關(guān)注［15-17］。研究表明，花椒精油表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，Prieto等［18］的研究發(fā)現(xiàn)Zanthoxylum monophyllum、Zanthoxylum fagara和Zanthoxylum rhoifoliu精油對尖鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。Zanthoxylum pseudodumosu精油能夠抑制茄鏈格孢菌的生長［19］，Gong等［20］使用水蒸氣蒸餾法對陜西省所產(chǎn)的花椒進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)花椒精油對15種植物病原菌表現(xiàn)出抗菌活性，鮮見其他省份的花椒精油對植物病原菌抗菌活性的研究。甘肅省是中國花椒的主要產(chǎn)區(qū)之一，為了深入探討甘肅省產(chǎn)花椒資源的生物活性，尋求具有抗植物病原菌作用的植物源活性物質(zhì)，對甘肅省產(chǎn)花椒的精油進(jìn)行了提取并對精油的抗植物病原真菌活性進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 植物與病原菌來源

花椒樣品于2018年6月采自甘肅省隴南市，由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所楊軍麗研究員鑒定為花椒的果皮。樣品（HJ-TS-201806）保存于煙臺先進(jìn)材料與綠色制造山東省實驗室。

茄鏈格孢菌（ACCC 36023）購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，尖鐮刀菌（CFCC 7880）、盤長孢狀刺盤孢（CFCC 82113）和禾谷鐮孢菌（CFCC 50580）購自中國林業(yè)微生物保藏管理中心。

1.2 試驗儀器

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，7890A-5975C型），美國安捷倫科技有限公司；霉菌培養(yǎng)箱（MJL-250型），天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺（HVS-1300-U型），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 花椒精油提取

稱取干燥、粉碎的花椒果皮10 g，裝入濾紙筒內(nèi)，將濾紙筒置于索氏提取器抽提筒內(nèi)，按料液比為1∶13（m/V）加入石油醚，水浴加熱，控制加熱溫度為75 ℃，加熱90 min，提取3次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液蒸干，得到花椒精油。

1.4 抗植物病原菌活性檢測

將花椒精油與二甲基亞砜（含量應(yīng)低于2.5‰，以避免對試驗的影響）混合溶解后，取一定體積與無菌熔融狀態(tài)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）混合，將花椒精油的濃度配制為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/mL。將含有花椒精油的PDA置于" "60 mm一次性培養(yǎng)皿（10 mL）中，待培養(yǎng)基凝固后，使用打孔器在培養(yǎng)基上制成6 mm孔洞，接種6 mm試驗菌株的菌餅。每個處理重復(fù)3次，空白對照組加入除花椒精油外的溶液作為對照。將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 d后測量各菌落直徑，按照式（1）計算抑制率（I）。

[I=（C-d）-（T-d）C-d×100%]" " " "（1）

式中，C為空白對照組平均菌落直徑；T為試驗組平均菌落直徑；d為菌餅直徑（6 mm）。

1.5 GC-MS檢測

1.5.1 樣品預(yù)處理 使用二氯甲烷與花椒精油樣品按照1∶10（V/V）的比例進(jìn)行混合，3 000 r/min離心" "5 min后取上清液，并使用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后直接上樣，進(jìn)行GC-MS測試。

1.5.2 GC-MS條件設(shè)定 色譜柱為HP-5MS型（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；起始溫度60 ℃保持nbsp; " " 2 min，以3.5 ℃/min的速度升至180 ℃，以10 ℃/min的速度升至310 ℃保持50 min；氣化室溫度250 ℃；傳輸線溫度240 ℃；載氣為氦氣；載氣流量1.0 mL/min；分流比50∶1；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：EI 源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿150 ℃；掃描模式為Scan；掃描質(zhì)荷比（m/z）為35～500；溶劑延遲3 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 9.5軟件處理數(shù)據(jù)，以濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)建立回歸曲線，并計算花椒精油對各供試菌種的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗植物病原菌活性

采用菌絲生長速率法探究不同濃度的花椒精油對4種植物病原真菌生長的抑制作用，結(jié)果（圖1、圖2、圖3）表明，花椒精油對禾谷鐮孢菌、尖鐮刀菌、盤長孢狀刺盤孢和茄鏈格孢菌的EC50分別為1.515、2.257、5.713、5.912 mg/mL。從EC50結(jié)果可以看出，花椒精油對禾谷鐮孢菌菌絲生長的抑制作用較強(qiáng)，對茄鏈格孢菌菌絲生長的抑制作用較弱。

2.2 GC-MS 結(jié)果分析

花椒精油進(jìn)行GC-MS檢測的離子流如圖4所示，利用NIST（美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院）數(shù)據(jù)庫對保留時間進(jìn)行檢索，從而完成對化合物的定性分析，在數(shù)據(jù)庫中取可信度在90%以上的結(jié)果進(jìn)行匯總，匯總結(jié)果如表1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含量排在前4位的化合物是乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-檸檬烯和桉葉油醇，4種化合物均屬于萜類化合物。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，花椒精油對4種植物病原真菌均有一定的抗菌活性，其中，花椒精油對禾谷鐮孢菌生長的抑制作用較強(qiáng)，EC50為1.515 mg/mL，對茄鏈格孢菌生長的抑制作用較弱，EC50為5.912 mg/mL。采用GC-MS對花椒精油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含量較多的揮發(fā)性物質(zhì)均為萜類化合物，分別是乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-檸檬烯和桉葉油醇。其中芳樟醇、D-檸檬烯、桉葉油醇被報道具有抗植物病原真菌活性［21-23］，檸檬烯也因其具有低毒、低殘留等特點(diǎn)被作為植物源農(nóng)藥而越來越受到重視［24］。所以，推測甘肅省產(chǎn)花椒精油中發(fā)揮抗植物病原真菌活性的化合物可能是萜類化合物中的乙酸芳樟酯、芳樟醇、D-檸檬烯和桉葉油醇。本研究制備的花椒精油與報道的利用陜西省產(chǎn)花椒制備的精油相比，兩者在抗植物病原菌活性和化學(xué)組成上相差較大。從陜西省產(chǎn)花椒中提取的精油對茄子根腐病菌和谷物根腐病菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性［20］，雖然其主要化學(xué)成分也是萜類化合物（萜品烯-4-醇、1，8-桉葉油素、松油醇、乙酸松油酯等），但具體的物質(zhì)組成與本研究制備的花椒精油相比差異較大。

不同產(chǎn)地來源的花椒資源由于生長環(huán)境的不同，其精油中所含有的化學(xué)成分也不盡相同［25］，這也導(dǎo)致了不同產(chǎn)地的花椒對植物病原真菌的抑制作用也有所差異。本研究結(jié)果表明，甘肅省產(chǎn)花椒中提取的花椒精油對4種植物病原真菌具有抗菌作用，豐富了花椒精油的生物活性，為植物源農(nóng)藥的開發(fā)與研究奠定了基礎(chǔ)。下一步將在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討花椒精油中發(fā)揮抗植物病原真菌作用的活性化合物和作用機(jī)制，以期從花椒資源中發(fā)現(xiàn)物質(zhì)基礎(chǔ)明確、作用機(jī)制清晰的抗植物病原真菌先導(dǎo)化合物，為植物源殺菌劑的研究提供科學(xué)支撐和物質(zhì)保障。

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