化肥減量配施有機肥對木薯生長及根際土壤細菌菌群的影響

關鍵詞：木薯；化肥減量；有機肥；根際土壤；細菌多樣性；菌群結構

中圖分類號：S533；S154.3 文獻標志碼：A

木薯（Manihot esculenta Crantz）塊根淀粉含量較高，是世界第六大糧食作物，是全球近10 億人的主要食糧，也是我國工業(yè)乙醇、淀粉、變性淀粉及飼料的重要原料[1]。近年來，我國木薯原料大部分依賴進口，是第一大木薯原料進口國和消費國。造成這樣的缺口主要是缺乏與高產優(yōu)質木薯新品種配套的栽培技術，肥料施用不科學，連作時間長，且收獲經濟效益低，限制了木薯的推廣與利用。在農作物生產中，為了獲取更高的產量，存在重用化肥，導致土壤板結、肥力下降、土壤微生物的多樣性及酶活性降低等諸多負面影響[2-4]。因此，調整與優(yōu)化木薯施肥方式迫在眉睫，而減少化肥施用量，增加有機肥或添加土壤修復劑將是今后種植木薯的必然趨勢。

化肥減施配施生物有機肥模式已廣泛地應用在各種農作物的種植端，配施有機肥或生物有機肥可以改善根際土壤微生物群落的多樣性和群落結構，提高農作物產量和提升農產品品質，促進農作物生長，改善農業(yè)生態(tài)環(huán)境[5-7]。關于化肥減施配施有機肥研究主要集中在探討對土壤肥力[8-10]、土壤酶活性[11-12]、作物生長發(fā)育及產量[13-15]、土壤微生物多樣性及菌群[16-18]的影響等方面。在木薯中關于化肥減量配施有機肥對其生長發(fā)育、酶活性、根際土壤微生物多樣性及群落結構的研究還未見報道。目前在木薯研究中僅見化肥減施雖能改變木薯根際微生物多樣性和群落結構，但會導致木薯根際微生物的多樣性和豐度都下降[19-20]的相關報道；而在木薯中化肥減量配施有機肥的根際土壤細菌多樣性及群落結構的變化尚未見相關報道。

本研究以木薯品種華南12 號（SC12）為研究對象，采用高通量測序平臺Illumina Nova 6000對木薯根際土壤進行16S rRNA 高通量測序分析，分析未施肥、施有機肥、常規(guī)施肥配施有機肥和化肥減施配施有機肥的不同模式對木薯根際土壤細菌多樣性和群落結構的影響，結合土壤理化性質，分析木薯生長及產量情況，闡明土壤細菌與環(huán)境因子的相互作用對木薯生長發(fā)育的影響，為木薯生產科學施肥、改善土壤生態(tài)環(huán)境、促進木薯提質增效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2022年在海南省儋州市紅星隊國家木薯種質資源圃進行，試驗地地理位置位于109°30'E，19°30'N。屬熱帶季風氣候， 年降雨量為900～2000 mm。試驗前基地土壤養(yǎng)分含量如下：有機質為10.99 g/kg，速效鉀為26.42 mg/kg，有效磷為3.47 mg/kg，堿解氮為21.99 mg/kg。試驗所用氮肥為尿素（N 46.2%），磷肥為鈣鎂磷肥（P₂O₅ 18%），鉀肥為硫酸鉀（K₂O 52%），商品活性有機肥（N+P₂O₅+K₂O≥5%，有機質≥80%，總腐殖酸≥30 g/kg，腐殖質≥300g/kg，元泰豐（包頭）生物科技有限公司生產。供試木薯品種為華南12 號。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗共設4 個處理：（1）CK（未施肥）；（2）T₁（有機肥）；（3）T₂（常規(guī)施肥+有機肥）；（4）T₃（化肥減施+有機肥）?；蕼p施為在常規(guī)施肥基礎上減氮25%+減磷50% ， 常規(guī)施肥用量： N 90 kg/hm2 、P₂O₅ 90 kg/hm²、K₂O 90 kg/hm²；化肥減施用量：N 67.5 kg/hm²、P₂O₅ 45 kg/hm²、K₂O 90 kg/hm²，有機肥用量均為1500 kg/hm²。木薯種植后2個月離種莖基部15～30cm 處穴施1 次肥料。每個試驗區(qū)面積36 m²，3次重復，共12 個試驗區(qū)。每個小區(qū)種植6行，每行6株，36株/小區(qū)，株行距1.0 m×1.0 m。小區(qū)間隔50cm，重復間隔100cm。木薯于2022 年5 月種植，2023年3月收獲。其他管理同一般常規(guī)栽培。

1.2.2 項目測定 （1）樣品收集及處理。木薯根際土壤樣品采集于2023年3月在海南省儋州市國家木薯種質資源圃進行，具體參照CAI 等[20]的方法。采樣時使用的工具、采集袋或其他物品均已滅菌。設置10個采樣點，按照“S”型取樣，用無菌毛刷將附著在木薯塊根表面的土壤刷于報紙上，用1 mm 土壤篩去雜質，將所有樣品混勻作為該試驗小區(qū)的木薯根際土樣。采集的木薯土壤樣品做好標記后，一份用于土壤有機質（OM）、堿解氮（AN）、速效鉀（AK）、有效磷（AP）等指標測定；另一份置于干冰中用于細菌16SrRNA 高通量測序分析。

（2）農藝性狀和產量測定。2023年3月收獲木薯，分別用卷尺和游標卡尺測定各個試驗小區(qū)的木薯株高和莖粗；各小區(qū)分別選取木薯10株，統(tǒng)計并記錄各小區(qū)木薯的薯條數(shù)和鮮薯重，以實收的10株木薯鮮薯重換算成每公頃鮮薯產量。

（3）土壤pH和養(yǎng)分測定。測定土壤pH、OM、AN、AK 和AP 含量，具體參照鮑士旦[21]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將采集的樣品送至廣東美格基因科技有限公司進行16S rRNA 高通量測序。原始測序數(shù)據(jù)（rawreads）通過質控得到最后的有效數(shù)據(jù)（clean tags）。利用美格云平臺（http：//cloud.magigene.com/）進行細菌Alpha多樣性和Beta多樣性分析。采用Microsoft" Excel 2003處理數(shù)據(jù)和繪制表格。采用Kruskal-Wallis test 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 化肥減量配施有機肥能促進木薯生長和產量增加

測定各處理下收獲期木薯的植物學性狀（株高、薯條數(shù)、莖粗等）和產量。結果表明，施肥處理后木薯在株高、莖粗、薯條數(shù)和鮮薯產量均顯著高于CK 處理的木薯（表1）。以上結果表明，不同施肥處理在一定程度上促進了木薯的生長，并提高其產量，尤其是在化肥減量（減25% N 和減50% P）的基礎上配施有機肥不但不會對木薯生長造成不良影響，還能顯著增加木薯的產量。

2.2 不同施肥處理木薯根際土壤樣品的高通量測序

利用高通量測序技術分析12個不同施肥處理的木薯根際土壤樣品，統(tǒng)計每個處理（CK、T₁、T₂、T₃）樣品通過測序得到的相關指標如表2所示。每個樣品測序的覆蓋度均大于0.992，結果表明構建的測序文庫涵蓋了木薯土壤樣品中99%以上的細菌菌群。同時，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，樣品的稀釋曲線也是升高后慢慢趨于平緩（圖1），這說明高通量測序的深度和獲得的數(shù)據(jù)量足以覆蓋樣品中細菌菌群的多樣性，可以用于后續(xù)的研究。

2.3 化肥減量配施有機肥等處理木薯根際土壤細菌α-多樣性指數(shù)分析

對各處理木薯根際土壤的OTU和α-多樣性指數(shù)進行分析（表3）。與CK 處理相比，T₁、T₂、T₃處理土壤中OTUs、細菌類群的豐度（Chao1和ACE）均呈現(xiàn)下降的趨勢，但T3 是施肥處理組中細菌豐度最高的。與CK 處理相比，不同處理根際土壤的Simpson 指數(shù)隨著有機肥或化肥的施用呈現(xiàn)出升高的趨勢，而Shannon 指數(shù)隨著有機肥或化肥的施用均呈現(xiàn)出下降的趨勢。研究結果表明，施有機肥或化肥會在一定程度上改變根際土壤中微生物的豐度和多樣性，化肥減施配施有機肥雖然在細菌豐度和多樣性上均有所降低，但其豐度和多樣性最接近未施肥的土壤。

2.4 木薯根際土壤細菌OTU韋恩圖分析

木薯根際土壤細菌共同的OTUs 有885 個（圖2）。與CK 處理相比，不同施肥方式下的每個樣本特有OTUs 的數(shù)量少，分別是1600 個（T₁）、413 個（T₂）、1371 個（T₃）。與CK 處理相比，在各施肥處理中特有的OTUs 的數(shù)量均呈現(xiàn)減少的趨勢，與總OTUs 數(shù)量減少表現(xiàn)一致。結果說明，各施肥處理改變了木薯根際土壤細菌類群的豐度。

2.5 化肥減量配施有機肥等處理下木薯根際土壤細菌群落的Beta多樣性分析

對各施肥處理下木薯根際土壤細菌群落進行主坐標分析（PCoA），結果表明主成分1（PCoA1）和主成分2（PCoA2）的貢獻率分別為62.10%和25.00%。如圖3 所示，樣本CK 和T₃距離較近，聚集在一起，說明這2 個樣本細菌類群組成結構相似；樣本T₁和T₂距離較近，說明這2 個樣本的細菌類群組成結構相似。

為了進一步了解PCoA 的結果，對不同樣本進行聚類分析，結果如圖4 所示，細菌群落結構組成分成兩大類，即T₁和T₂被聚為一個分支，T₃和CK 被聚為一個分支，說明CK 和T₃在細菌群落組成結構上有較高相似度。結果表明化肥減施配施有機肥的細菌群落結構和多樣性組成介于常規(guī)施肥配施有機肥和未施肥之間，不同施肥處理能夠顯著改變細菌的群落結構和多樣性。

2.6 化肥減量配施有機肥等處理下木薯根際土壤細菌群落組成

細菌16S rRNA高通量測序獲得序列經注釋后，統(tǒng)計每個處理樣本中細菌相對豐度及群落結構組成。在門水平下，細菌菌落相對豐度如圖5所示， 變形菌門（ Proteobacteria） 、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）是木薯根際土壤樣本的優(yōu)勢細菌菌門。與CK 的木薯根際土壤細菌群落相比，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在施肥組處理中的含量呈現(xiàn)升高的趨勢。酸桿菌門（Acidobacteria）在T₁和T₂施肥處理后的含量明顯下降，但在T₃中變化不大；厚壁菌門（Firmicutes）在T1 處理后的含量有所增加，但在T2 和T3 處理中呈現(xiàn)下降的趨勢；綠彎菌門（Chloroflexi）在T₁、T₂、T₃ 處理下的含量呈現(xiàn)下降趨勢。放線菌門（Actinobacteria）經各施肥處理后（T₁、T₂、T₃）的含量均明顯增加（Plt;0.05）。T₁、T₂、T₃處理的木薯根際土壤中放細菌門分別增加6.3倍、3.5倍、2.4倍。結果表明，有機肥或化肥施用并未改變主要細菌的類群，但提高了木薯根際土壤中有益細菌類群的相對豐度。

在屬水平上，相對豐度大于0.5%的共有14個屬。黃桿菌屬（Flavobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和馬賽菌屬（Massilia）是木薯根際土壤細菌群落的主要菌屬（相對豐度大于10%）（圖6）。與CK 處理相比，黃桿菌屬、不動桿菌屬和馬賽菌屬的含量在T₁、T₂ 和T₃ 處理中均呈現(xiàn)顯著增加。在各施肥處理中，主要菌屬的含量也有顯著差異。黃桿菌屬在T₁、T₂ 處理下的含量相似，但與T3 處理下的含量有明顯差異，分別是T₃處理下的4.3倍和4.9 倍。類似的結果也在馬賽菌屬中觀察到，T₁、T₂ 處理下的含量是T₃處理的19.4倍和5.4倍。然而不動桿菌屬在T₂和T₃ 處理下的含量顯著高于T₁處理，分別是T1處理下含量的3.9倍和2.62 倍。

2.7 化肥減量配施有機肥等處理下木薯根際土壤環(huán)境因子的冗余性分析

利用RDA 分析土壤環(huán)境因子如何影響木薯根際土壤細菌群落結構。選擇pH、SOM、AN、AP 和AK等5個環(huán)境因子進行冗余性分析，結果如圖7所示，在門水平上，RDA1解釋了72.40%，RAD2解釋了18.50%，共解釋了90.90%以上。速效鉀、pH、速效磷對土壤細菌落結構有著重要影響，其中速效鉀影響最大，且速效鉀含量與速效磷、堿解N、有機質、pH 均呈正相關。

3 討論

土壤根際微生物組成及豐度受土壤質量[22-23]、宿主植物[20， 24-25]和種植模式[26-27]等因素影響。本研究利用高通量測序分析化肥減量配施有機肥如何影響和改變木薯根際土壤細菌多樣性及菌群結構。結果表明化肥減量配施有機肥的木薯根際土壤中，在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）是木薯根際土壤樣本的優(yōu)勢細菌菌門，與前人報道的在間作或輪作下木薯根際土壤的優(yōu)勢菌門一致[9， 25， 27-28]。因此，推測在南方酸性土壤中宿主植物木薯通過分泌根系代謝物富集特定的微生物，導致南方木薯根際土壤下所富集細菌類群結構組成相似，只是在多樣性和豐度上有所不同，這說明木薯根際土壤細菌的類群主要受宿主植物影響和調配，而種植模式（間作或輪作）或施肥方式只能在一定程度上改變其多樣性和豐度。

本研究中，化肥減量配施有機肥的木薯根際土壤中，細菌菌群的多樣性及豐度均顯著高于施有機肥、常規(guī)施肥配施有機肥處理，這結果與靳曉拓等[8]、陸海飛[29]、孫家駿等[30]的報道一致。蔡杰等[19]研究發(fā)現(xiàn)化肥減施的木薯根際土壤中，細菌多樣性和豐度均顯著低于未施肥和常規(guī)施肥處理，導致這種結果是由于未添加有機肥處理。本研究中，單施有機肥、常規(guī)施肥配施有機肥和化肥減施配施有機肥都能提高有益細菌放線菌門的豐度，與王慶等[6]、姜蓉等[7]、蔡杰等[19]的研究結果一致。研究表明，土壤中放線菌數(shù)量的增加可以提高對土壤有機質利用率，同時還能抑制一些土傳病害，促進土壤健康發(fā)展[31]。同時，本研究在屬水平上也發(fā)現(xiàn)擬桿菌門的黃桿菌屬在T1、T2 和T3 處理下的豐度顯著增加。研究表明，黃桿菌屬參與土壤中有機物的分解，對維持土壤肥力有積極作用[32]。然而，黃桿菌屬的豐度在T3處理中呈現(xiàn)最低，這可能跟減少氮和磷肥施用有關。相關研究表明，黃桿菌屬能夠通過其代謝活動參與氮、磷循環(huán)[33-34]。Candidatus Solibacter 是分解有機質、利用碳源的細菌屬[35]。本研究中，在T1 和T2 處理下Candidatus Solibacter 的豐度顯著低于T3 處理。綜上，合理配施有機肥不僅能為土壤提供大量的有機質及養(yǎng)分，還能在一定程度上還增加土壤有益細菌的數(shù)量，改善土壤細菌菌群結構[36]，幫助其吸收轉化養(yǎng)分，為植物生長創(chuàng)造優(yōu)良的環(huán)境，減輕作物的連作障礙[37]。

合理施肥或配施有機肥能夠提高農作物產量，提升農產品品質，促進作物生長，改善農業(yè)生態(tài)環(huán)境。本研究中，不同施肥處理均能顯著促進木薯生長發(fā)育，增加木薯產量。與未施肥處理相比，化肥減施配施有機肥能夠顯著增加木薯株高和莖粗，獲得較高的木薯產量。這可能與配施有機肥增加了土壤中有益微生物多樣性有關，從而改變土壤細菌的菌落結構，促進土壤向健康發(fā)展。但化肥減量配施不同有機肥對木薯產量及品質的連續(xù)影響及其機制有待進一步深入研究。隨著化肥減量施肥的倡導，在其基礎上合理配施有機肥，在木薯主產區(qū)生產中，逐步實現(xiàn)有機肥替代化肥，實現(xiàn)化肥零增長，發(fā)展綠色、可持續(xù)的木薯產業(yè)，促進木薯產業(yè)提質增效，具有非常重要的力量意義和應用價值。

4結論

與未施肥相比，化肥減量配施有機肥處理不僅能顯著增加木薯株高和莖粗，還能提高木薯產量。與單施有機肥和常規(guī)施肥配施有機肥的木薯根際土壤相比，化肥減量配施有機肥的木薯根際土壤細菌的多樣性和豐度有顯著差異?；蕼p量配施有機肥處理木薯根際土壤中優(yōu)勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和綠彎菌門，這與已報道的木薯根際土壤細菌優(yōu)勢菌門一致?；蕼p施配施有機肥增加了擬桿菌門、變形菌門及放線菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門和厚壁菌門的相對豐度。冗余性分析結果表明速效鉀是影響木薯根際土壤細菌群落的主要效應因子，與速效磷、堿解N、有機質、pH 等指標呈現(xiàn)正相關。