木薯MeMinD的互作蛋白篩選

關(guān)鍵詞：木薯；MeMinD；MeNAPRT2；酵母雙雜交；質(zhì)體

中圖分類號：S533 文獻標志碼：A

植物質(zhì)體（葉綠體、淀粉體等）的分裂由一系列蛋白協(xié)同完成[1]。MinD 參與質(zhì)體分裂的精細調(diào)控，在質(zhì)體形態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用。MinD有2 個重要的結(jié)構(gòu)域：MinC 和MinE 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。MinC 基因所編碼的MinC 蛋白是細胞分裂抑制因子，在MinD 的ATPase 活性催化下，與其相互作用并結(jié)合形成復(fù)合物MinCD，之前，充當“鐘擺”功能的MinE 在兩極之間來回移動，驅(qū)動MinCD復(fù)合物來回振蕩，使Z 環(huán)只能在中部進行組裝，促進質(zhì)體可以均等分裂成2 個[2]。當MinD 過量表達，會讓復(fù)合物MinCD 遍布質(zhì)體所有位點，抑制Z環(huán)形成，從而抑制質(zhì)體分裂；而MinD 的減少或缺失，使Z 環(huán)的形成不局限在中部，形成偏離中心或多個FtsZ 環(huán)，質(zhì)體分裂發(fā)生在不適當?shù)奈恢肹3-4]。

目前關(guān)于質(zhì)體的研究多以葉綠體為對象，過量表達擬南芥AtMinD 會導(dǎo)致葉綠體增大[5]，而減少AtMinD 表達量或缺失該基因的突變體，引起葉綠體不對稱分裂[4]。將AtMinD 在煙草過表達，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠體大，且數(shù)目減少[6]。這些結(jié)果都進一步證實了MinD 在質(zhì)體分裂中的關(guān)鍵作用。淀粉體是木薯塊根淀粉積累的場所，葉綠體是葉片臨時性淀粉合成和降解的細胞器。前期，本實驗室克隆了木薯的MeMinD 基因，異源表達于大腸桿菌可導(dǎo)致菌體的分裂位點錯位和絲狀形成，亞細胞定位分析表明MeMinD 可定位于葉綠體[7]。通過基因編輯敲除MeMinD 基因，突變體木薯的葉綠體和淀粉體顯著增大（待發(fā)表）。以上結(jié)果表明MeMinD 蛋白參與調(diào)控木薯質(zhì)體的分裂，然而與MeMinD 蛋白協(xié)同調(diào)控木薯質(zhì)體分裂的相關(guān)蛋白尚未明確。本研究將MeMinD 構(gòu)建至pGBKT7 載體，進行酵母雙雜交文庫篩選實驗，挖掘與MeMinD 互作的質(zhì)體分裂相關(guān)蛋白，為解析木薯質(zhì)體分裂調(diào)控機制提供新的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

華南8 號木薯（SC8， Manihot esculenta Crantz）、木薯cDNA 文庫、酵母雙雜交質(zhì)粒pGBKT7、pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7-lam、pGBKT7-p53由本實驗室提供；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)、酵母菌AH109 感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp（SD/T）、SD/-Trp-Leu（SD/TL）、SD/-Trp-Leu-His-Ade（SD/TLHA）、X-α-Gal 購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-MeMinD的構(gòu)建與毒性檢測 將酶切純化的誘餌載體pGBKT7（BD）載體與純化MeMinD 基因片段進行同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，進行菌落PCR，篩選陽性單克隆，構(gòu)建酵母雙雜交載體pGBKT7-MeMinD。

提取pGBKT7-MeMinD 重組質(zhì)粒和pGBKT7（BD）空載質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，將陽性克隆用SD/T 液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，將OD600 控制在0.8～1.0，再將菌液按1、10^–1、10^–2、10^–3、10^–4濃度梯度進行稀釋，分別點在SD/T 平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落生長情況。

1.2.2 自激活檢驗將 pGBKT7-MeMinD 質(zhì)粒與pGADT7（BD）空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入AH109 酵母菌株，將陽性酵母液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，分別點在SD/TL、SD/TLHA、SD/TLHA+X-α-Gal 三種平板上培養(yǎng)，觀察實驗組（pGADT7+pGBKT7-MeMinD）和對照組（陽性對照：pGBKT7-p53+pGADT7-T，陰性對照：pGBKT7-lam+pGADT7-T）的酵母菌在3 種平板上的生長情況，以此確定MeMinD 蛋白是否存在自激活現(xiàn)象。

1.2.3 MeMinD互作蛋白篩選 參照仇婷婷[8]的方法進行酵母雙雜交文庫篩選MeMinD 的候選互作蛋白。將變藍的酵母菌斑進行PCR 檢測，PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，再利用NCBI Blast 軟件進行序列比對，篩選出木薯MeMinD 可能互作的蛋白并進行功能注釋。

1.2.4 酵母雙雜交點對點驗證 設(shè)計候選互作蛋白的基因擴增引物（表1），克隆其編碼區(qū)并連接到pGADT7 載體。PCR 篩選陽性克隆并測序驗證。將候選互作蛋白基因的pGADT7 重組質(zhì)粒與pGBKT7-MeMinD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)AH109 酵母菌株，進行酵母雙雜交點對點驗證，篩選MeMinD 的互作蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-MeMinD的構(gòu)建

以SC8 木薯cDNA為模板，PCR 擴增MeMinD的編碼區(qū)序列。電泳檢測結(jié)果顯示擴增片段與預(yù)期大?。?87 bp）一致（圖1）。將MeMinD 基因片段與線性化的pGBKT7 載體重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取5 個單菌落進行菌落PCR 鑒定，獲得4 個陽性克隆并進行測序驗證（圖2）。提取測序正確的pGBKT7-MeMinD 誘餌載體，用于后續(xù)酵母雙雜交文庫篩選。

2.2 毒性檢測和自激活檢測

將pGBKT7-MeMinD 和pGBKT7空載分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH109，將菌液稀釋不同濃度（1、10^–1、10^–2、10^–3、10^–4）后在SD/TL 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pGBKT7-MeMinD 和pGBKT7空載的酵母菌生長狀態(tài)無差異（圖3），說明MeMinD對AH109 酵母菌無毒性，可進行后續(xù)實驗。

將pGBKT7-MeMinD 和pGADT7 空載共轉(zhuǎn)酵母菌株進行自激活檢測。在SD/TL 培養(yǎng)基上，共轉(zhuǎn)pGBKT7-MeMinD 和pGADT7 空載的酵母菌、陽性對照（pGBKT7-p53+pGADT7-T）和陰性對照（pGBKT7-lam+pGADT7-T）的酵母菌在SD/TL培養(yǎng)基上均能正常生長，但在SD/TLHA 和SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上只有陽性對照的酵母菌生長，且陽性對照在SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上的酵母菌落變藍。此結(jié)果表明MeMinD 蛋白不具有自激活活性，可用于酵母雙雜交篩選木薯cDNA 文庫（圖4）。

2.3 MeMinD互作蛋白篩選

將本實驗室前期制備的木薯酵母雙雜交質(zhì)粒文庫大規(guī)模轉(zhuǎn)化到含有誘餌載體pGBKT7-MeMinD 的AH109 酵母感受態(tài)。轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于SD/TLHA 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得單克隆酵母菌，并分別點在SD/TLHA+X-α-Gal 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（圖5）。將變藍的陽性菌落用于PCR擴增插入片段并測序，最終獲得8 個候選互作蛋白（表2）。這些蛋白功能涉及卡爾文循環(huán)、細胞代謝、NAD（P）H 再生和細胞熱耐受等多種生物學(xué)過程。

2.4 MeMinD 互作蛋白點對點驗證

根據(jù)候選蛋白的注釋結(jié)果，挑選出4個候選蛋白進行酵母雙雜交點對點驗證，包括MeFBA1-1、MeFBA1-2、MeNAPRT2、MeALDH2B4。以SC8 木薯品種cDNA 為模板，PCR 擴增出4 個候選互作蛋白基因的CDS 序列，將其分別構(gòu)建到pGADT7 載體。將誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)酵母。結(jié)果顯示，pGBKT7-MeMinD+pGADT7-MeFBA1-1、pGBKT7-MeMinD+pGADT7-MeFBA1-2、pGBKT7-MeMinD+pGADT7-MeALDH2B4、pGBKT7-MeMinD+pGADT7-MeNAPRT2 以及對照組在SD/TL 上均可以長出菌斑并正常生長（圖6），說明質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母成功。酵母雙雜交驗證結(jié)果顯示，僅有pGBKT7-MeMinD+pGADT7-MeNAPRT2 能在SD/TLHA 上生長出菌斑且在SD/TLHA+X-α-Gal 上變藍，表明在酵母細胞內(nèi)MeMinD 與MeNAPRT2 蛋白存在相互關(guān)系。

3討論

淀粉體和葉綠體均屬于質(zhì)體，由前質(zhì)體發(fā)育而來，具有相似的分裂機制。植物質(zhì)體的分裂過程，包括FtsZ 蛋白組裝形成Z 環(huán)，MinD1 和MinE1互作形成復(fù)合體，Min 復(fù)合體與ARC3 蛋白協(xié)同調(diào)控Z 環(huán)精準定位于質(zhì)體的中部，Z 環(huán)形成后招募更多的質(zhì)體分裂相關(guān)蛋白，Z 環(huán)在多種蛋白的作用下引導(dǎo)質(zhì)膜收縮，最終導(dǎo)致質(zhì)體分裂。過量或減少擬南芥AtMinD1 的表達都會影響葉綠體的分裂，從而影響葉綠體的大小[9]。

木薯塊根富含的淀粉和葉片臨時性淀粉的合成和貯存均在質(zhì)體完成，挖掘鑒定木薯質(zhì)體分裂相關(guān)基因的功能，解析淀粉體和葉綠體的分裂機制將有助于提高木薯產(chǎn)量和淀粉品質(zhì)。GENG 等[10]克隆了木薯FtsZ 蛋白的3 個基因，MeFtsZ1、MeFtsZ2-1 和MeFtsZ2-2。MeFtsZ 蛋白均能定位在葉綠體中，并形成Z 環(huán)結(jié)構(gòu)。MeFtsZ2-1 和MeFtsZ2-2 在塊根的表達量顯著高于MeFtsZ1。過表達MeFtsZ2-1 和MeFtsZ2-2 的擬南芥葉綠體增大，數(shù)目減少。WANG 等[11]克隆了木薯MeMinE基因，MeMinE-GFP 在木薯原生質(zhì)體中的瞬時表達表明，MeMinE 蛋白位于葉綠體中。MeMinE蛋白在木薯葉肉細胞原生質(zhì)體中的過表達，可導(dǎo)致葉綠體分裂異常，葉綠體數(shù)目減少，面積變小。KE 等[7]克隆了木薯的MeMinD 基因，該基因在葉片中的表達量較高，MeMinD 定位于葉綠體，在大腸桿菌異源表達可導(dǎo)致菌體的分裂位點錯位和絲狀形成。通過基因編輯敲除MeMinD 基因，突變體木薯的葉綠體和淀粉體顯著增大（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。解析MeMinD 參與調(diào)控木薯質(zhì)體分裂的機制，將有助于利用分子生物技術(shù)培育高產(chǎn)、高淀粉木薯新品種。

目前，與MeMinD 蛋白互作，協(xié)同調(diào)控木薯質(zhì)體分裂的蛋白尚未明確。本研究采用酵母雙雜交技術(shù)對MeMinD 進行了互作蛋白的篩選，發(fā)現(xiàn)MeMinD 與MeNAPRT2 存在互作關(guān)系。NAPRT2（nicotinate phosphoribosyl transferase 2）在植物中參與煙酸（nicotinic acid）的磷酸核糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，這是煙酸轉(zhuǎn)化為NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）途徑中的關(guān)鍵步驟[12]。NAD 是細胞內(nèi)重要的輔酶，參與多種代謝過程，包括能量代謝和信號傳導(dǎo)[13-15]。NAD+（NAD 的氧化形式）在氧化還原反應(yīng)中接受電子和質(zhì)子，形成NADH。NADH隨后在電子傳遞鏈中將電子傳遞給氧氣，最終產(chǎn)生ATP。MinD 蛋白是一種ATPase，通過ATP 的水解，MinD 蛋白能夠在質(zhì)膜上形成動態(tài)的極性模式，與MinE 和MinC 蛋白相互作用，共同調(diào)控質(zhì)體的分裂過程。MeMinD 與MeNAPRT2 的互作表明能量代謝可能參與木薯質(zhì)體的分裂過程。水稻OsNAPRT1 基因突變會導(dǎo)致植株矮化，葉片過早枯萎[16]。目前，尚無NAPRT2 參與質(zhì)體分裂的研究報道。后續(xù)將通過雙分子熒光互補試驗進一步驗證MeMinD 與MeNAPRT2 的互作關(guān)系，利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)探究其在木薯質(zhì)體分裂過程中的功能。