利用轉(zhuǎn)錄組分析揭示植物光合作用效率的分子機制

摘 要：選取高效光合作用植物和對照組，在控制條件下進行培養(yǎng)，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對其進行深度分析。通過RNA提取、質(zhì)控與差異基因篩選，結(jié)合光合效率測定，深入探討光合作用相關(guān)基因的表達和功能。結(jié)果表明，與對照組相比，高效光合作用植物中關(guān)鍵光合作用基因顯著上調(diào)，涉及光反應(yīng)和碳固定的代謝通路。構(gòu)建了這些基因的功能富集網(wǎng)絡(luò)，揭示了其與光合效率間的密切關(guān)聯(lián)。試驗發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為強化植物光合作用提供了新思路，展示了轉(zhuǎn)錄組分析在提高光合作用效率中的潛力，為未來通過基因調(diào)控或育種策略提升植物生產(chǎn)力奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：光合作用效率；轉(zhuǎn)錄組分析；差異表達基因；代謝通路；基因調(diào)控

中圖分類號：Q943.2 文獻標志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）09–00-03

光合作用是植物將光能轉(zhuǎn)化為化學能的核心過程，對植物的生長和生物質(zhì)積累至關(guān)重要[1-2]。通過光合作用，植物固定大氣中的CO2，并合成有機化合物，為地球上的食物鏈提供基本的物質(zhì)和能量來源。高效的光合作用不僅有助于農(nóng)作物的增產(chǎn)，還能通過增加碳固定緩解全球變暖。盡管科學家在提高光合作用效率方面作了大量研究，但整體效率仍受到光合器官、代謝途徑和環(huán)境條件等因素的限制。最新的研究聚焦于提高光捕獲效率和優(yōu)化碳同化過程[3-4]。一些研究通過基因編輯和分子育種的方式，嘗試提高光合效率，但廣泛應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)錄組分析為揭示光合作用相關(guān)基因的活性提供了一種高效的工具[5-6]。

通過識別差異表達基因和分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可深入理解光合作用的分子機制，并識別出與高效光合作用相關(guān)的基因標志[7]。相比傳統(tǒng)方法，轉(zhuǎn)錄組分析能夠處理大量生物樣本和復雜數(shù)據(jù)，有助于發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法難以檢測的潛在調(diào)控因素，推動光合作用研究的創(chuàng)新和進步。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用擬南芥和水稻作為實驗植物。擬南芥是植物分子生物學的經(jīng)典模型，因其生命周期短、基因組小且易于遺傳操作而被廣泛使用。水稻則是全球重要的糧食作物，因其基因組已被完整解碼，為功能基因研究奠定了基礎(chǔ)。擬南芥材料來自中國科學院植物研究所，水稻種子由國際水稻研究所（IRRI）提供。為保證無病蟲害，所有材料在種植前均進行了消毒處理。植物栽培在經(jīng)過消毒處理的溫室中，溫度設(shè)定為22±1 ℃，濕度控制在60%±5%，以模擬擬南芥的最佳生長環(huán)境。將植物種植于高溫滅菌處理后的無菌土壤中，輔以適量有機肥以補充營養(yǎng)。光照條件設(shè)為16 h/d的LED燈光強度[200 μmoL/（m2·s）]，并有8 h的黑暗周期，以模擬自然晝夜循環(huán)，促進光合作用等生理活動。植物使用純凈的無離子水灌溉，施加專門配制的營養(yǎng)液1次/周，營養(yǎng)液中有氮、磷、鉀及其他微量元素，以滿足植物的全面營養(yǎng)需求。植物生長通過定期觀察和記錄進行監(jiān)控，關(guān)鍵生長階段進行必要取樣，確保個體健康生長，為實驗提供可靠數(shù)據(jù)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

在植物生長至6周齡時采集樣本，選取每株植物的中心葉片以保證實驗結(jié)果的一致性和可比性。采集在潔凈環(huán)境中進行，使用無菌鑷子避免污染。樣本迅速轉(zhuǎn)移至預冷的1.5 mL RNase-free離心管中，并立即冷凍在液氮中，隨后儲存于-80 ℃冰箱中，以維持RNA的穩(wěn)定性，直到進行RNA提取和后續(xù)分析。RNA提取采用TRIzol Reagent并嚴格遵循標準操作流程，確保樣品的純凈度。濃度和純度通過NanoDrop"2000評估，A260/A280比值需在1.8～2.0。同時，使用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA的完整性指數(shù)（RIN），要求RIN值在8.0以上，以確保樣品適合后續(xù)測序。轉(zhuǎn)錄組文庫使用Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit構(gòu)建，通過聚A尾部富集技術(shù)提取mRNA，再進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，完成文庫構(gòu)建后進行嚴格質(zhì)量控制。使用Illumina NovaSeq 6000平臺，以150 bp雙端讀取模式進行高通量測序，每個樣本測序深度為30 Gb，確保檢測的廣泛性與深度。這種策略提高了數(shù)據(jù)準確性，為基因表達分析和轉(zhuǎn)錄變異檢測提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。

FastQC生成的報告包括堿基質(zhì)量分布、讀長分布、GC含量、序列重復性和接頭污染檢查等。這些報告幫助識別數(shù)據(jù)中的偏差和問題區(qū)域。然后，利用Trimmomatic軟件去除接頭序列和低質(zhì)量讀段。設(shè)置滑動窗口和修剪長度等參數(shù)，確保過濾后數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，要求Q30質(zhì)量得分的序列比例超過90%，以增強后續(xù)分析的可靠性和準確性。質(zhì)控后的高質(zhì)量序列使用Hisat2進行比對。Hisat2以其高效的比對速度和對復雜基因組數(shù)據(jù)的優(yōu)化處理能力而被選用。擬南芥和水稻的參考基因組（TAIR10和IRGSP-1.0）用于比對，確保至少95%以上的讀段成功定位。比對完成后，使用StringTie進行轉(zhuǎn)錄組組裝和數(shù)量化。StringTie不僅組裝已知轉(zhuǎn)錄本，還能識別新的轉(zhuǎn)錄本變體，提供高分辨率的基因表達分析。使用DESeq2進行差異表達基因的統(tǒng)計分析。DESeq2通過負二項分布模型處理RNA-seq計數(shù)數(shù)據(jù)，以確保統(tǒng)計結(jié)果的可靠性。篩選差異基因的標準為Fold Change＞2且P＜0.05，以識別顯著表達變化的基因。DAVID數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達基因進行功能注釋。DAVID提供的GO分類和KEGG通路分析幫助識別基因參與的生物學過程和信號傳導途徑，揭示潛在的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點，為試驗進一步探索奠定基礎(chǔ)。

1.4 光合作用效率測定

1.4.1 光合速率測定方法

使用LI-6400XT便攜式光合作用分析儀測量植物的凈光合速率。在光合作用最旺盛的時段進行測量，以確保數(shù)據(jù)的準確性和代表性。測量條件嚴格控制為光照強度1 500 μmoL/（m2·s），CO2濃度穩(wěn)定于400 μL/L。為減少個體差異帶來的數(shù)據(jù)誤差，每日測定同一植物的相同葉位葉片。通過這種嚴格的測量方法，能夠獲得高精度的光合速率數(shù)據(jù)。

1.4.2 數(shù)據(jù)采集與分析

在光照期間多次測量光合速率，采用下式計算光合速率：

（1）

式（1）中，?[CO2]（?μL/L）為光照期間CO2濃度的變化量，V（mL/min）為氣流量，A（cm2）為葉面積。對每個處理組的光合速率數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA），選擇顯著性水平P＜0.05判斷組間差異，并應(yīng)用Tukey’s HSD進行兩兩比較，鑒別出顯著的處理效果差異。結(jié)果以試驗技術(shù)重復的平均值與標準誤（Mean±SE）報告，提高可讀性和透明度。分析這些處理結(jié)果，探討不同基因條件對光合作用效率提高的潛力。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達基因分析

2.1.1 高效光合作用植物與對照組的基因表達差異

在此次試驗中，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出573個差異表達基因（DEGs），其中320個基因在高效光合作用植物中上調(diào)，而253個基因在對照組中上調(diào)。在高效光合作用植物中，上調(diào)基因主要集中于光合作用路徑。例如，光反應(yīng)中心蛋白psaA和psbA在高效光合作用植物中分別高出對照組2.5倍和3.1倍。此外，有68個編碼碳固定相關(guān)酶的基因，如RuBisCO小亞基和碳酸酐酶基因顯示顯著上調(diào)，其中，RuBisCO小亞基基因的表達增加了2.8倍。這表明在高效光合作用植物中與光合作用直接相關(guān)的基因被廣泛激活，使得光合作用效率更高。

2.1.2 關(guān)鍵代謝途徑的識別

利用KEGG路徑富集分析，識別出14條顯著富集于光合作用和碳固定的代謝途徑（P＜0.01）。在高效光合作用植物中，三羧酸循環(huán)（TCA cycle）中的檸檬酸合成酶和蘋果酸脫氫酶的基因表達分別增加2.3、2.6倍。這說明細胞內(nèi)能量供給的加強直接促進了光合作用效率的提高。在光合電子傳遞鏈中，質(zhì)體醌/酶復合體及超氧化物歧化酶（SOD）的基因顯著上調(diào)（增幅達2.7倍），這些結(jié)果暗示在高光效的環(huán)境中，抗氧化防御系統(tǒng)被激活以應(yīng)對光合過程中產(chǎn)生的活性氧，從而保護細胞免受氧化損傷。通過這些分析，識別出關(guān)鍵的代謝途徑和基因，這些途徑和基因?qū)夂献饔眯实奶岣呔哂兄匾耐苿幼饔谩?/p>

2.2 功能注釋與代謝通路分析

2.2.1 參與光合作用的關(guān)鍵基因

功能注釋結(jié)果顯示，在鑒定出的差異基因中，有80個基因編碼的蛋白與光系統(tǒng)的核心功能相關(guān)，如葉綠體ATP合成酶等。這些基因在高效光合植物中的表達顯著高于對照組。尤其是葉綠體外膜蛋白（OEP）家族中的基因，這些基因涉及光合復合體的穩(wěn)定性和跨膜運輸機制，其表達水平在高效光合作用植物中高達3.5倍的上調(diào)。這表明這些基因在提高光合效率和穩(wěn)定光合作用機制中扮演著重要角色。

2.2.2 基因功能富集分析

GO分析揭示了一些功能類別的顯著富集，包括光合作用（GO：0015979）、色素代謝（GO：0042440）和光合電子傳遞（GO：0009767）。此外，相關(guān)于抗逆脅的功能類別，尤其是植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑，也顯示出顯著的富集（P＜0.01）。這表明光合作用效率的調(diào)控涉及復雜的多層次網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，光依賴反應(yīng)部件如側(cè)磷酸酯轉(zhuǎn)移酶的基因表現(xiàn)出顯著的表達調(diào)控，這可能在光響應(yīng)調(diào)節(jié)中扮演中心角色。這些基因和途徑的識別提供了關(guān)鍵的目標，進一步解析了調(diào)控光合作用和環(huán)境適應(yīng)的機制。

2.3 光合作用效率與基因表達的相關(guān)性

2.3.1 特定基因表達水平與光合效率的關(guān)系

在測量的光合速率（Pn）中，高效光合作用植物顯示出顯著提升的數(shù)值[平均（20.4±0.8）-μmol CO2/m2/s]，與對照組相比提高了約35%。相關(guān)性分析表明，關(guān)鍵基因如psaA、psbA和rpL14的表達水平與光合速率之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（R2=0.76，P＜0.05）。這些基因的上調(diào)與光合作用速率的提高密切相關(guān)，表明它們的增強表達能夠有效地推動光合作用效能的提升。

2.3.2 代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)高效光合作用植物中涉及73種基因的代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點之間的關(guān)聯(lián)增強。尤其是在糖代謝和能量代謝相關(guān)的激酶通路中，這種增強尤為明顯。網(wǎng)絡(luò)分析顯示關(guān)鍵途徑（如糖酵解中的6-磷酸果糖激酶）的平均路徑長度相較對照組縮短了15%，這表明在光合變動期間的能量流動變得更高效且更集中。此網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化提示這些植物在轉(zhuǎn)錄水平上的優(yōu)化提高了其在動態(tài)環(huán)境中的光合反應(yīng)適應(yīng)性。這一發(fā)現(xiàn)指出了潛在的新目標，這些目標可以被用于植物的培育和改良，以提高光合作用效率和適應(yīng)性。

3 討論

3.1 光合作用相關(guān)基因的功能及其調(diào)控機制

在研究中，光合作用效率的提高與若干關(guān)鍵基因的上調(diào)表達緊密相關(guān)。這些基因包括光反應(yīng)中心如psaA和psbA，它們的高表達有助于提高光捕獲效率和電子傳遞速率。此外，編碼碳固定過程關(guān)鍵酶（如RuBisCO）的基因上調(diào)為碳同化提供了更高效的底物轉(zhuǎn)換能力。此外，抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的顯著表達強化了植物在高能量轉(zhuǎn)換過程中對氧化應(yīng)激的響應(yīng)能力，這可能通過調(diào)控干擾素響應(yīng)機制和ROS清除網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)。解析這些基因的功能及其在磷酸化和跨膜離子輸送中的調(diào)節(jié)機制，將有助于理解光合作用的全面動態(tài)調(diào)節(jié)。

3.2 轉(zhuǎn)錄組分析在提高植物光合作用效率中的潛力

轉(zhuǎn)錄組分析提供了一種系統(tǒng)全面的方法，可以揭示出影響光合效率的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與傳統(tǒng)方法相比，它更能有效捕捉到動態(tài)環(huán)境下基因的瞬態(tài)表達變化和復雜的基因互動網(wǎng)絡(luò)。通過識別差異表達基因和富集分析，轉(zhuǎn)錄組學為研究提供了深入代謝通路的視角，并揭示了可通過基因上調(diào)來增強植物光合功能的潛在路徑。未來，這種分子水平的分析可用于指導高級育種和基因編輯措施，以培育更高性能的植物品種，這可能在應(yīng)對全球氣候變化和糧食安全方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

4.1 主要發(fā)現(xiàn)

研究通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示了高效光合作用植物中一系列與光合功能密切相關(guān)的基因差異表達情況。主要發(fā)現(xiàn)psaA、psbA等一些關(guān)鍵基因顯著上調(diào)，直接支持更高效的光反應(yīng)過程，這與光合效率的提高呈正相關(guān)。差異表達基因主要集中在光合作用途徑、碳固定和抗氧化防御系統(tǒng)，表明這些途徑在提高光合性能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)展示了涉及多種關(guān)鍵代謝路徑的協(xié)同增強關(guān)系，這些路徑的強化可能為更好地能量轉(zhuǎn)換和代謝適應(yīng)提供可能。

4.2 轉(zhuǎn)錄組分析對提高植物光合作用效率的應(yīng)用前景

轉(zhuǎn)錄組學揭示了植物光合作用效率提高過程中多層次的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用高通量的基因測序技術(shù)，能夠獲取植物在不同環(huán)境條件下動態(tài)的基因表達信息，這不僅有助于理解光合調(diào)控的基礎(chǔ)機制，還能為培育高性能植物品種提供理論支持。

未來，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析與現(xiàn)代分子育種技術(shù)，如CRISPR/Cas9基因編輯，將能夠精準地調(diào)控這些關(guān)鍵基因的表達，從而系統(tǒng)性地提高植物的光合效率。此外，這一方法亦可用于篩選和開發(fā)適應(yīng)性更強的作物品種，助力應(yīng)對全球氣候變化和糧食安全的挑戰(zhàn)。因此，轉(zhuǎn)錄組學不僅為光合生物學研究提供了深刻見解，還在推動農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)應(yīng)用方面展現(xiàn)出巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

參考文獻

[1] Mehmood S S .利用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組比較分析揭示不同油菜品種低溫應(yīng)答機制[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2021.

[2] 楊曉慧，朱政財，徐放，等.不同花色木棉轉(zhuǎn)錄組功能注釋與分析[J].北京林業(yè)大學學報，2022，44（3）：1-11.

[3] 盧柏亦，蔣哲，鄢柳慧，等.水稻幼苗響應(yīng)褐飛虱和稻癭蚊的轉(zhuǎn)錄組分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2022，53（3）：628-640.

[4] 安惠韜，王茜，王瑞剛.植物葉片懸浮培養(yǎng)的研究[J].林業(yè)科技，2024，49（1）：29-33.

[5] 張有來.篤斯越橘VuLhca4和VuLhca5基因的克隆及在非生物脅迫中的作用研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2023.

[6] 王吉秀，李想，李祖然，等.小花南芥與玉米間作對Pb化學形態(tài)及富集特征的影響[J].環(huán)境工程學報，2018，12（12）： 3456-3467.

[7] 于修遠，徐啟玉，尹世嬌，等.擬南芥HHP2基因?qū)g皮部蔗糖裝載的調(diào)控功能[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2024，52（8）：122-132，142.

收稿日期：2024-07-11

作者簡介：黨莉（1980—），女，山西五臺人，講師，研究方向為植物生理及分子生物學。