BALF Xpert MTB/RIF和 PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在涂陰肺結(jié)核診斷中的價(jià)值

【摘要】 目的：對比支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）結(jié)核分枝桿菌（MTB）/利福平（RIF）耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（Xpert MTB/RIF）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在涂陰肺結(jié)核診斷中的價(jià)值。方法：納入2021年6月—2023年1月于江西省胸科醫(yī)院接受治療的肺結(jié)核患者共200例，所有患者均留取BALF送檢，進(jìn)行Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測。以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)確診涂陰肺結(jié)核的占比情況，并計(jì)算Xpert MTB/RIF與PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)兩種檢測方法的陽性率、與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致性，并評估兩種檢測方法對涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值。結(jié)果：Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結(jié)核的陽性率（76.50%）與PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（69.50%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=2.486，P=0.115）。200例肺結(jié)核患者中確診為涂陰肺結(jié)核有137例，占比68.50%；Xpert MTB/RIF的符合率（94.89%）高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（74.45%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。Xpert MTB/RIF診斷涂陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度均高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Plt;0.05）。結(jié)論：Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)均可用于涂陰肺結(jié)核診斷中，其中Xpert MTB/RIF的診斷價(jià)值更高，可輔助臨床早期診斷篩查。

【關(guān)鍵詞】 支氣管肺泡灌洗液 結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù) PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù) 涂陰肺結(jié)核

Value of BALF Xpert MTB/RIF and PCR-Reverse Dot Blot Hybridization Technique in the Diagnosis of Smear Negtive Pulmonary Tuberculosis/LI Qiuhong， LI Zanhua， CHEN Yanling， WU Yuqing， CHEN Siyu. //Medical Innovation of China， 2024， 21（30）： 138-142

[Abstract] Objective： To compare the diagnostic value of Xpert Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin （Xpert MTB/RIF） and polymerase chain reaction （PCR）-reverse dot blot hybridization technique in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in smear negtive pulmonary tuberculosis. Method： A total of 200 patients with pulmonary tuberculosis who received treatment in Jiangxi Chest Hospital from June 2021 to January 2023 were included. All patients were retained BALF for inspection， and they were detected by Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique. Using the results of pathological examination as the gold standard， the proportion of confirmed smear negtive pulmonary tuberculosis was counted， and the positive rates of Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique were calculated， and the consistency with the gold standard results were calculated， and the diagnostic value of the two detection methods for smear negtive pulmonary tuberculosis were evaluated. Result： There was no significant difference in the positive rate of Xpert MTB/RIF （76.50%） in detecting smear negtive pulmonary tuberculosis compared with PCR-reverse dot blot hybridization technique （69.50%）

（字2=2.486， P=0.115）. Among 200 patients with pulmonary tuberculosis， 137 cases （68.50%） were diagnosed as smear negtive pulmonary tuberculosis. The coincidence rate of Xpert MTB/RIF （94.89%） was higher than that of PCR-reverse dot blot hybridization technique （74.45%）， the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value and accuracy of Xpert MTB/RIF were higher than those of PCR-reverse dot blot hybridization technique （Plt;0.05）. Conclusion： Both Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique can be used in the diagnosis of smear negtive pulmonary tuberculosis， among which Xpert MTB/RIF has a higher diagnostic value and can assist in early clinical diagnosis and screening.

[Key words] BALF Xpert MTB/RIF PCR-reverse dot blot hybridization technique Smear negtive pulmonary tuberculosis

First-author's address： Department of Respiratory Medicine， Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.30.032

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生健康委科技計(jì)劃項(xiàng)目（202211258）

①江西省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科 江西 南昌 330006

②江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科 江西 南昌 330006

通信作者：李贊華

肺結(jié)核屬于呼吸系統(tǒng)疾病的一種，因肺組織、支氣管、胸膜等部位受到結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致，具有較強(qiáng)傳染性，列為我國乙類傳染病。相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，我國肺結(jié)核發(fā)病具有季節(jié)性和循環(huán)周期性，高密度地區(qū)和人群流動性較大的地區(qū)分布廣[1]。其起病緩慢，早期癥狀不明顯，部分患者屬于非活動性肺結(jié)核或潛伏感染，痰涂片檢測結(jié)果顯示涂陰性，不易診斷[2]。因此需提高臨床診斷準(zhǔn)確性。常規(guī)檢查方式如鏡檢、病原菌培養(yǎng)均存在一定局限性[3]，且痰涂片無法有效區(qū)分MTB和非MTB，也無法區(qū)分菌體活性[4]。其次MTB培養(yǎng)耗時(shí)長，一般為6～8周，一定程度上會延誤診療時(shí)間。MTB/利福平（RIF）耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（Xpert MTB/RIF）與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)作為新型的檢測技術(shù)，兼具耗時(shí)短、敏感度高的優(yōu)勢。相關(guān)研究證實(shí)，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）Xpert MTB/RIF對肺結(jié)核具有較高診斷價(jià)值[5]。PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)也被臨床證實(shí)對痰標(biāo)本中MTB藥性檢測效果顯著[6]。當(dāng)前少有研究對以上兩種檢測方法診斷涂陰肺結(jié)核的價(jià)值進(jìn)行對比分析?；诖?，本研究擬對比分析PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)和Xpert MTB/RIF對涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究樣本選自江西省胸科醫(yī)院2021年6月—2023年1月收治的200例肺結(jié)核的初診患者。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年滿18周歲，符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②入組前未曾進(jìn)行抗結(jié)核治療；③認(rèn)知水平及精神正常。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往接受肺部手術(shù)；②合并心、腎等重要器官功能不全；③包裹性胸腔積液，形成胸膜纖維板。納入的患者中男131例，女69例，平均（52.76±17.19）歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或患者家屬知情同意本研究。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 用一次性無菌瓶收集BALF，每份標(biāo)本要求收集20 mL左右，回收率大于等于30%。分別進(jìn)行PCR反向點(diǎn)雜交檢測、Xpert MTB/RIF檢測。

1.2.2 Xpert MTB/RIF檢測 （1）吸取1 mL BALF，加入4%氫氧化鈉溶液與異丙醇，于渦旋振蕩器搖晃20 s，室溫下靜置約15 min，待充分液化后，吸取混合液2～4 mL，采用Xpert MTB/RIF檢測儀進(jìn)行分析，評估樣本中MTB的載量、利福平耐藥存在性，所用試劑盒源于瑞典賽沛公司。（2）排除質(zhì)量控制探針，當(dāng)剩余探針數(shù)目≥2根出現(xiàn)熒光，則提示MTB感染。當(dāng)MTB對利福平耐藥，所有探針不可同時(shí)出現(xiàn)熒光。

1.2.3 PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù) （1）BALF的處理：若灌洗液中不含痰和血，僅需離心處理（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心時(shí)間15 min），若灌洗液中含痰或血，則先進(jìn)行液化處理，過程同Xpert MTB/RIF檢測，然后離心，設(shè)置參數(shù)同上，摒除上清液，取灌洗液1.2～1.5 mL離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心時(shí)間5 min），吸取上清液，加入1 mL洗液充分混勻，離心處理（離心參數(shù)同上）。整個(gè)過程需密切關(guān)注顏色變化；之后吸取50 μL裂解液，與沉淀物一并混合搖勻，水浴加熱10 min，離心處理2 min，轉(zhuǎn)速同上，取上層清液，采用PCR擴(kuò)增儀（江蘇圣極基因科技有限公司，蘇械注準(zhǔn)20192221303）對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。（2）根據(jù)靶基因序列，對MTB的rpoB基因進(jìn)行定位，以此為模板獲取擴(kuò)增引物，擴(kuò)增得到382bp的DNA片段。（3）PCR擴(kuò)增條件：A，150℃，擴(kuò)增120 s→95 ℃，擴(kuò)增600 s；B，95 ℃，擴(kuò)增45 s→←64 ℃，1 min，20 cycles；C，95 ℃，擴(kuò)增0.5 min→←56 ℃，擴(kuò)增0.5 min→←68 ℃，45 s，30 cycles；D，68 ℃，擴(kuò)增300 s。（4）嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行加樣、擴(kuò)增、雜交、洗膜和顯色操作。（5）根據(jù)膜條上不同位點(diǎn)的顯示結(jié)果，得到相應(yīng)病原菌。

1.2.4 金標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[7]，至少三次痰涂片與一次結(jié)核菌培養(yǎng)為陰性，經(jīng)支氣管或肺部組織病理檢查確診為涂陰肺結(jié)核（陽性）。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較兩種檢測方法的陽性率。（2）比較兩種檢測方法診斷涂陰肺結(jié)核的一致性。統(tǒng)計(jì)200例患者中被確診為涂陰肺結(jié)核的例數(shù)，與Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)診斷結(jié)果進(jìn)行一致性對比。（3）比較兩種檢測方法的診斷價(jià)值。分析Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對涂陰肺結(jié)核的診斷效果，計(jì)算敏感度、特異度、準(zhǔn)確度等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行字2檢驗(yàn)；一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75，表明一致性較好，0.4lt;Kappa值lt;0.75，表明一致性中等，0lt;Kappa值≤0.4，表明一致性較差。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法的陽性率比較

200例患者中，經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結(jié)核陽性153例，陰性47例，陽性率為76.50%；經(jīng)PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測涂陰肺結(jié)核陽性139例，陰性61例，陽性率為69.50%。Xpert MTB/RIF檢測陽性率高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，但兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=2.486，P=0.115）。

2.2 兩種檢測方法診斷結(jié)果與確診結(jié)果比較

200例肺結(jié)核患者中，金標(biāo)準(zhǔn)確診涂陰肺結(jié)核有137例，占比68.50%，其中Xpert MTB/RIF符合率為94.89%（130/137），Kappa值為0.627，PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)符合率為74.45%（102/137），Kappa值為0.158。Xpert MTB/RIF符合率明顯高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.988，P=0.014）。

2.3 兩種檢測方法診斷涂陰肺結(jié)核的價(jià)值

Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對涂陰肺結(jié)核均有一定診斷價(jià)值。Xpert MTB/RIF敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測值及陽性預(yù)測值均高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Plt;0.05）。見表1、表2。

3 討論

肺結(jié)核是一種因MTB感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病，具有較強(qiáng)傳染性，能夠通過飛沫傳播，相關(guān)資料顯示，患者年齡、職業(yè)、病原學(xué)檢查結(jié)果均是影響延遲就診的重要因素[8]。截至2019年，全球約有1 000萬新發(fā)肺結(jié)核患者，我國新發(fā)與復(fù)發(fā)肺結(jié)核患者高達(dá)83.3萬例，且總體感染趨勢并未下降[9]。在早期階段，肺結(jié)核潛伏期較長，且缺乏特異性表現(xiàn)，經(jīng)結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室檢查，結(jié)果可能顯示為陰性，即涂陰肺結(jié)核，不僅會延誤治療，導(dǎo)致病情加重，還會形成傳染源，加大結(jié)核防控難度與潛在風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。因此，盡早精準(zhǔn)診斷涂陰肺結(jié)核對抗癆治療意義重大。對此臨床已有諸多研究，如耐藥基因檢測[12]、外周血單核細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合T-SPOT.TB輔助檢測[13]等。本次研究主要探討PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)及Xpert MTB/RIF檢測對涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值。

相關(guān)研究表明，Xpert MTB/RIF檢測陽性率高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)[14-15]。本研究中，兩種方法的檢測陽性率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。Xpert MTB/RIF作為一種分子信標(biāo)檢測方法，其通過檢測MTB中DNA特定基因序列，進(jìn)而判斷是否存在MTB感染，相較于長時(shí)間的痰標(biāo)本檢測，該方法僅需2 h即可獲得最終診斷結(jié)果，有研究證實(shí)Xpert MTB/RIF檢測還可用于評估RIF耐藥性[16-18]。本次研究中，200例肺結(jié)核患者中，確診為涂陰肺結(jié)核的患者共137例，占比68.50%，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)確診結(jié)果一致性高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)。Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結(jié)核的特異度、敏感度等均較高，與前人結(jié)果一致[19]，故可判斷XpertMTB/RIF檢測較PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測具有更優(yōu)的診斷價(jià)值。此外，近年來還有研究探討Xpert MTB/RIF檢測與抗酸染色等其他檢測聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值[20]，由此可見Xpert MTB/RIF檢測具有廣泛應(yīng)用前景。

綜上所述，Xpert MTB/RIF診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，可作為涂陰肺結(jié)核的早期診斷方法。但目前其檢測價(jià)格偏高，期待價(jià)格更低廉，特異度、準(zhǔn)確度更高的檢測方法出現(xiàn)。此外，本研究樣本量偏少，期待未來擴(kuò)大樣本量，得出更精準(zhǔn)的結(jié)論。

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（收稿日期：2024-08-09） （本文編輯：陳韻）