• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    通過加權基因共表達網(wǎng)絡和LASSO分析識別兒童呼吸道合胞病毒的診斷基因

    2024-12-31 00:00:00董海麗王國勝谷雙龍宋南萍
    上海醫(yī)藥 2024年19期
    關鍵詞:中性粒細胞

    摘 要 目的:運用生物信息學方法挖掘兒童呼吸道合胞病毒(RSV)的診斷標志物,為RSV的靶向治療提供依據(jù)。方法:從GEO中獲得RSV的基因表達數(shù)據(jù)集。運用差異表達分析、免疫浸潤分析、WGCNA和LASSO確定RSV的關鍵生物標志物。同時,繪制ROC曲線對關鍵基因的診斷性能進行評估。結(jié)果:共識別出592個差異基因和10種差異浸潤的免疫細胞,例如中性粒細胞。WGCNA和LASSO分析篩選出7個關鍵的生物標志物,包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、BST1、CAMP。此外,ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)這些基因具有較高的診斷價值。結(jié)論:篩選的7個基因可作為RSV的診斷生物標志物。

    關鍵詞 呼吸道合胞病毒 診斷基因 中性粒細胞 加權基因共表達網(wǎng)絡分析

    中圖分類號:R446.9; R725.1 文獻標志碼:A 文章編號:1006-1533(2024)19-0063-09

    引用本文 董海麗, 王國勝, 谷雙龍, 等. 通過加權基因共表達網(wǎng)絡和LASSO分析識別兒童呼吸道合胞病毒的診斷基因[J]. 上海醫(yī)藥, 2024, 45(19): 63-71.

    Identification of diagnostic genes related to respiratory syncytial virus in children based on WGCNA and LASSO algorithms

    DONG Haili, WANG Guosheng, GU Shuanglong, SONG Nanping

    (Department of Pediatrics, Zhengzhou 460 Hospital, Zhengzhou 450000, China)

    ABSTRACT Objective: The diagnostic biomarkers of respiratory syncytial virus (RSV) in children were explored by bioinformatics analysis to provide basis for targeted therapy of RSV. Methods: Gene expression profiles of RSV were obtained from the GEO database. Differential expression analysis, immune infiltration analysis, WGCNA and LASSO were applied to identify the key biomarkers of RSV. Meanwhile, ROC curve was utilized to evaluate the diagnostic performance of key genes. Results: A total of 592 differentially expressed genes and 10 differential immune cells (such as neutrophils) were identified between RSV and healthy samples. Further, WGCNA and LASSO analysis screened out seven key biomarkers, including ADM, LTF, UBE2J1, PDK4, S100A4, BST1, and CAMP. In addition, ROC curve showed that these genes had high diagnostic value. Conclusion: The identified seven biomarkers may serve as diagnostic biomarkers for RSV.

    KEY WORDS respiratory syncytial virus; diagnostic genes; neutrophils; weighted gene co-expression network analysis

    呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是全球兒童呼吸道感染的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計,每年有210萬5歲以下的兒童因RSV感染需要門診治療或住院,并且在全世界28 d至6個月的嬰兒中,RSV疾病的總死亡率負擔為1/28[2-3]。因此,迫切需要有效的RSV預防策略來解決這一重大公共衛(wèi)生問題和負擔。帕利珠單抗廣泛的用于預防嬰兒RSV疾病[4]。盡管其藥效已經(jīng)得到證實,但是尚未引進國內(nèi)臨床應用[5]。迄今為止,RSV疫苗仍然處于開發(fā)階段。此外,診斷RSV感染的有效方法也十分有限。所以,了解RSV感染的分子發(fā)病機制對于指導未來的診斷和治療至關重要。目前,已有研究旨在尋找RSV的診斷標志物,揭示其潛在的分子機制[6-7]。但是,識別RSV診斷生物標志物的相關研究仍然缺乏。本研究利用一系列生物信息學分析旨在探討與RSV中免疫浸潤細胞相關的關鍵生物標志物。本工作將有望為提高RSV患者的診斷以及治療靶點的開發(fā)提供幫助。

    1 材料和方法

    1.1 表達譜數(shù)據(jù)的收集和預處理

    從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中下載6個兒童RSV芯片數(shù)據(jù)集,包括GSE188427、GSE105450、GSE103842、GSE103119、GSE80179、GSE77087。其中,GSE188427包括353個樣本,來自于51個健康志愿者和302個RSV患者的全血樣本,在本研究中作為訓練集。其余數(shù)據(jù)集作為模型驗證數(shù)據(jù)集。另外,使用R語言中的affy包對下載的數(shù)據(jù)進行預處理,并使用rma函數(shù)進行歸一化處理。

    1.2 基因差異表達分析

    通過limma包對健康和RSV患者中的基因進行差異表達分析,計算基因相應的P值和logFC值。同時,利用FDR方法對P值進行多重檢驗校正,得到P-adjust(Benjamini-Hochberg校正)。差異表達基因(differential expressed genes,DEGs)的閾值為:P-adjust<0.05和|logFC|>1.2。

    1.3 GSEA功能分析

    為了探索疾病組和正常組之間的差異調(diào)節(jié)通路,使用GSEA(V4.3.2)對DEGs進行功能富集分析,包括GO-BP、KEGG和Reactome。顯著富集的閾值為P-adjust<0.05。

    1.4 免疫微環(huán)境分析

    基于患者和對照樣本的基因表達數(shù)據(jù),利用CIBERSORT對樣本中22種免疫細胞的比例進行計算。隨后,運用Wilcox檢驗比較了兩組間免疫細胞浸潤水平的差異。

    1.5 WGCNA分析

    使用WGCNA篩選與RSV有關的關鍵基因。通過篩選中位數(shù)絕對偏差(median absolute deviation,MAD)排名前75%且MAD值>0.01的基因進行共表達分析(13 963個基因)。隨后,計算每個模塊與差異的免疫細胞浸潤程度之間的相關性。獲得與免疫細胞最相關的模塊后(又稱為hub模塊),將模塊基因與DEGs取交集,從而得到與免疫細胞浸潤相關的關鍵基因用于后續(xù)分析。

    1.6 關鍵基因的功能富集分析

    利用DAVID 2021對這些基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。選取P-adjust<0.05作為顯著富集的閾值。

    1.7 診斷基因篩選

    運用R4.3.1語言中的glmnet包(V4.1-7)從關鍵基因中篩選診斷基因。首先,進行單因素logistic回歸分析,選取P<0.05的基因進行后續(xù)分析。接下來,利用LASSO分析來篩選RSV的診斷基因。LASSO回歸分析在R軟件中運行10次K交叉驗證,用于對包含的變量進行居中和歸一化處理,然后選擇最佳的l值。

    1.8 列線圖的構(gòu)建

    通過rms包繪制包括診斷基因的列線圖來判斷RSV患病的風險率,并且繪制校正曲線來驗證模型的準確性。

    1.9 外部數(shù)據(jù)集驗證

    在5個驗證隊列中,對診斷基因在健康對照和RSV樣本中的表達水平進行比較。隨后,利用pROC包繪制診斷基因的ROC曲線,通過計算AUC值評估基因的預測性能。

    2 結(jié)果

    2.1 DEGs篩選和GSEA富集分析

    在RSV和對照中共篩選到592個DEGs,包括453個上調(diào)和139個下調(diào)基因。GSEA結(jié)果揭示這些基因主要富集在380個GO-BP類目,57個KEGG通路和149個Reactome通路。圖1展示了NES排名前5的結(jié)果。

    2.2 RSV和健康對照患者呈現(xiàn)不同的免疫景觀

    10種免疫細胞的浸潤水平在兩組中有顯著差異(圖2A和2B)。在RSV樣本中,活化樹突狀細胞(activated dendritic cells)、M0型巨噬細胞(M0 macrophages)、活化肥大細胞(activated mast cells)、中性粒細胞(neutrophils)、活化CD4記憶T細胞(activated T cells CD4 memory)的豐度遠高于對照樣本,而native B細胞(native B cells)、嗜酸性粒細胞(eosinophils)、靜息肥大細胞(resting mast cells)、靜息自然殺傷細胞(resting NK cells)、天然CD4 T細胞(native T CD4 cells)的豐度低于對照樣本。

    2.3 利用WGCNA識別關鍵模塊

    如圖3A所示,當軟閾值為6時(對應的R2為0.75),滿足網(wǎng)絡的無標度拓撲,且平均連通性高。通過基因相關性構(gòu)建層次聚類樹狀圖,共識別出20個相似的基因模塊(圖3B)。隨后,以免疫浸潤程度作為表型,分析模塊特征值與10種差異免疫細胞之間的相關性。包含991個基因的“MEYellow”模塊與中性粒細胞具有較強的相關性,皮爾森相關系數(shù)為0.84(圖3C)。因此認為“MEYellow”模塊為hub模塊,其中包含的基因用于后續(xù)分析。

    2.4 RSV中關鍵差異基因的篩選和功能富集分析

    將DEGs和“MEYellow”模塊基因整合,得到232個重疊的基因(圖4A)。對這些關鍵基因進行功能富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示,基因主要影響細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cytokine production)(GO-BP)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)(GO-CC)、模式識別受體活性(pattern recognition receptor activity)(GO-MF)(圖4B~D)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)基因在中性粒細胞胞外陷阱的形成(neutrophil extracellular trap formation)等通路中顯著富集(圖4E)。

    2.5 RSV中診斷基因的鑒定

    為了進一步識別核心的診斷基因,基于lambda值進行了LASSO回歸分析。共識別出7個RSV中最具代表性的診斷基因,包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、 BST1、CAMP(圖5A~C)。隨后,基于這7個診斷生物標志物,建立了預測RSV的列線圖模型(圖5D)。校準曲線顯示疾病的預測概率和實際發(fā)生概率之間的誤差很小,表明列線圖對RSV患者的預測準確性較高(圖5E)。

    2.6 生物標志物的驗證

    利用5個外部驗證數(shù)據(jù)集對7個特征基因的表達和診斷效能進行驗證(圖6)。與對照組相比,RSV組中7個基因的mRNA水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,尤其是S100A4、CAMP、ADM、BST1(均P<0.05)。在5個數(shù)據(jù)集中,診斷基因聯(lián)合模型的AUC值均大于0.9,表明模型具有較高的分類性能。此外,還對每個基因進行了ROC分析。在5個驗證集中,ADM、UBE2J1、S100A4、BST1、CAMP的AUC值均大于0.7。這些結(jié)果表明篩選的特征標志物在RSV中顯示出良好的診斷效能。

    3 討論

    有證據(jù)表明天然免疫應答的不同組成部分參與RSV感染的控制,且適當?shù)墓逃忻庖邞鹪赗SV感染的消退中具有重要的作用[8-9]。所以,RSV的免疫病理學機制的研究有助于疫苗的研發(fā)。

    本研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞在RSV中的浸潤水平顯著增加。已有研究報道了RSV感染與中性粒細胞之間的相關性。臨床研究發(fā)現(xiàn),RSV感染后,約80%浸潤的細胞是中性粒細胞,并且其強烈的內(nèi)流是RSV誘導的急性下呼吸道感染的氣道炎癥的常見特征[10-11]。另外,RSV感染中的中性粒細胞氣道炎癥會導致黏液生成過多、上皮損傷和氣道重塑,進而引起肺功能損傷和肺部疾病[12]。因此,在RSV感染期間靶向中性粒細胞可能是改善患兒的不良肺部預后的潛在治療方法。后續(xù)的分析中,本研究重點關注了中性粒細胞相關的關鍵基因。

    結(jié)合WGCNA和LASSO回歸分析,最終確定了7個具有診斷性能的生物標志物,包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、BST1、CAMP。ROC分析發(fā)現(xiàn)這些基因均具有良好的診斷性能。氣道ADM的異常表達可能導致上皮和黏膜功能失調(diào),與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有關,并可能是預測社區(qū)獲得性肺炎死亡率的一個關鍵的生物標志物[13-14]。UBE2J1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上可降解錯誤折疊的蛋白質(zhì),其過表達可增強登革熱病毒感染,并且該基因可通過影響泛素化過程在重癥COVID-19患者中起關鍵作用[15-16]。S100A4在炎癥過程中發(fā)揮重要作用。已有證據(jù)表明其與淋巴細胞計數(shù)呈正相關,因此該基因參與哮喘氣道炎癥的發(fā)病機制[17]。BST1可抑制中性粒細胞通過內(nèi)皮層的浸潤,發(fā)揮抗炎特性[18]。CAMP(又稱為LL-37)具有抗菌、細胞趨化和炎癥反應調(diào)節(jié)功能[19]。RSV感染后可誘導氣道上皮細胞表達LL-37,并且該基因可能是先天性宿主抵抗RSV感染的重要靶點[20]。LTF編碼的蛋白在中性粒細胞的次級顆粒中發(fā)現(xiàn),具有已知的抗病毒活性,包括RSV[21]。兒童膿毒癥心肌病患者的血清中PDK4水平顯著升高,并且與疾病的嚴重程度和器官損傷密切相關[22]。總而言之,這些研究證實篩選出來的基因均與炎癥相關的疾病有關,可間接或直接地參與RVS的發(fā)生。

    本研究還發(fā)現(xiàn)基因主要富集在“中性粒細胞胞外陷阱的形成”通路中。在RSV患兒的氣道中觀察到大量的中性粒細胞募集,而激活的中性粒細胞可釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap,NETs)[23]。研究發(fā)現(xiàn)NETs能夠捕獲RSV,從而阻止病毒顆粒與靶細胞結(jié)合,防止感染。然而,NETs的大量產(chǎn)生會阻塞氣道并損害肺功能,從而加重嬰幼兒感染的炎癥癥狀[24]。因此,必須嚴格調(diào)控NETs的形成[25]。然而,NETs在RVS感染下的有益和有害影響之間的界限仍未揭示,所以尋找一種靶向NETs及其相關蛋白的理想療法是亟待解決的一個挑戰(zhàn)。

    我們的工作首次利用WGCNA結(jié)合LASSO方法識別了RSV的特異性診斷生物標志物,加深了對其發(fā)病機制的認識。然而,這些發(fā)現(xiàn)均是通過生物信息學分析得到的,還需要通過體內(nèi)和體外實驗來探索這些基因在RSV中的具體作用。

    參考文獻

    [1] Weinberg GA. Respiratory syncytial virus mortality among young children[J]. Lancet Glob Health, 2017, 5(10): e951-e952.

    [2] Li Y, Wang X, Blau DM, et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in children younger than 5 years in 2019: a systematic analysis[J]. Lancet, 2022, 399(10340): 2047-2064.

    [3] Hall CB, Weinberg GA, Blumkin AK, et al. Respiratory syncytial virus-associated hospitalizations among children less than 24 months of age[J]. Pediatrics, 2013, 132(2): e341-e348.

    [4] Garegnani L, Styrmisdóttir L, Roson Rodriguez P, et al. Palivizumab for preventing severe respiratory syncytial virus(RSV) infection in children[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2021, 11(11): CD013757.

    [5] 李秀東. 小兒呼吸道合胞病毒感染性肺炎防治研究進展[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報, 2015, 36(26): 3990-3991.

    [6] Dapat C, Kumaki S, Sakurai H, et al. Gene signature of children with severe respiratory syncytial virus infection[J]. Pediatr Res, 2021, 89(7): 1664-1672.

    [7] Li L, Ni YA, Song Z, et al. Identification of pathogenic genes and transcription factors in respiratory syncytial virus[J]. BMC Pediatr, 2021, 21(1): 27.

    [8] Kim HY, Yun KW, Cheong HJ, et al. Respiratory syncytial virus infection and the need for immunization in Korea[J]. Expert Rev Vaccines, 2023, 22(1): 327-340.

    [9] Luo J, Qin H, Lei L, et al. Virus-like particles containing a prefusion-stabilized F protein induce a balanced immune response and confer protection against respiratory syncytial virus infection in mice[J]. Front Immunol, 2022, 13: 1054005.

    [10] Jones AC, Anderson D, Galbraith S, et al. Personalized transcriptomics reveals heterogeneous immunophenotypes in children with viral bronchiolitis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2019, 199(12): 1537-1549.

    [11] 劉金玲, 陳志敏. 呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎患兒中性粒細胞活化及蛋白酶平衡的研究[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2009, 89(6): 397-399.

    [12] Tahamtan A, Besteman S, Samadizadeh S, et al. Neutrophils in respiratory syncytial virus infection: from harmful effects to therapeutic opportunities[J]. Br J Pharmacol, 2021, 178(3): 515-530.

    [13] Hagner S, Welz H, Kicic A, et al. Suppression of adrenomedullin contributes to vascular leakage and altered epithelial repair during asthma[J]. Allergy, 2012, 67(8): 998-1006.

    [14] Torres A, Ramirez P, Montull B, et al. Biomarkers and community-acquired pneumonia: tailoring management with biological data[J]. Semin Respir Crit Care Med, 2012, 33(3): 266-271.

    [15] Feng T, Deng L, Lu X, et al. Ubiquitin-conjugating enzyme UBE2J1 negatively modulates interferon pathway and promotes RNA virus infection[J]. Virol J, 2018, 15(1): 132.

    [16] Huang J, Li R, Cheng J, et al. Transcriptome analysis of peripheral blood mononuclear cells response in patients with severe COVID-19 reveals crucial genes regulating protein ubiquitination[J]. Med Sci Monit, 2022, 28: e937532.

    [17] Huang X, Qu D, Liang Y, et al. Elevated S100A4 in asthmatics and an allergen-induced mouse asthma model[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(6): 9667-9676.

    [18] Wang LJ, Huang YC, Lin PY, et al. BST-1 as a serum protein biomarker involved in neutrophil infiltration in schizophrenia[J]. World J Biol Psychiatry, 2022, 23(7): 537-547.

    [19] Zhang L, Wu WKK, Gallo RL, et al. Critical role of antimicrobial peptide cathelicidin for controlling Helicobacter pylori survival and infection[J]. J Immunol, 2016, 196(4): 1799-1809.

    [20] Currie SM, Findlay EG, Mchugh BJ, et al. The human cathelicidin LL-37 has antiviral activity against respiratory syncytial virus[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e73659.

    [21] Van Der Strate BW, Beljaars L, Molema G, et al. Antiviral activities of lactoferrin[J]. Antiviral Res, 2001, 52(3): 225-239.

    [22] Chen T, Ye L, Zhu J, et al. Inhibition of pyruvate dehydrogenase kinase 4 attenuates myocardial and mitochondrial injury in sepsis-induced cardiomyopathy[J]. J Infect Dis, 2023, 25: jiad365.

    [23] Funchal GA, Jaeger N, Czepielewski RS, et al. Respiratory syncytial virus fusion protein promotes TLR-4-dependent neutrophil extracellular trap formation by human neutrophils[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0124082.

    [24] Cortjens B, De Boer OJ, De Jong R, et al. Neutrophil extracellular traps cause airway obstruction during respiratory syncytial virus disease[J]. J Pathol, 2015, 238(3): 401-411.

    [25] Porto BN, Stein RT. Neutrophil extracellular traps in pulmonary diseases: too much of a good thing?[J]. Front Immunol, 2016, 7: 311.

    猜你喜歡
    中性粒細胞
    中性粒細胞/淋巴細胞比值、淋巴細胞/中性粒細胞比值與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動及狼瘡腎炎的關系
    不同類型突發(fā)性聾患者外周血相關細胞比值和 治療療效的關系探討
    布魯桿菌感染患者外周血中性粒細胞/淋巴細胞比值和血小板/淋巴細胞比值的臨床意義
    紅細胞分布寬度和中性粒細胞/淋巴細胞比值在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應用價值
    小細胞肺癌患者化療后中性粒細胞減少與含鉑類方案化療療效的相關性研究
    術前NIR比值對非肌層浸潤性膀胱癌術后的預后評估價值
    奧曲肽對急性胰腺炎患者外周血中性粒細胞凋亡和炎癥因子的影響
    中性粒細胞和淋巴細胞與鼻咽癌療效的相關性研究
    活性氧自由基在試驗性乳腺炎大鼠發(fā)病機制中的作用
    中性粒細胞/淋巴細胞比率對小兒熱性驚厥的價值
    两个人免费观看高清视频| 亚洲国产精品成人综合色| 免费在线观看成人毛片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 少妇粗大呻吟视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| www.www免费av| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜精品在线福利| 黄片大片在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 日韩有码中文字幕| 久久久久久久久中文| 白带黄色成豆腐渣| 99国产精品一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 长腿黑丝高跟| 亚洲 国产 在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 两个人的视频大全免费| 久热爱精品视频在线9| 久久久久性生活片| 两性夫妻黄色片| 一级作爱视频免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产欧美日韩一区二区三| 人成视频在线观看免费观看| 日韩欧美在线二视频| 亚洲一区中文字幕在线| 一二三四在线观看免费中文在| 国产一区二区在线观看日韩 | 欧美日韩乱码在线| 久久亚洲真实| 麻豆av在线久日| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美成人午夜精品| 国产午夜福利久久久久久| 好男人电影高清在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成+人综合+亚洲专区| 看免费av毛片| 人人妻人人看人人澡| 91九色精品人成在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产黄片美女视频| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲熟女毛片儿| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利欧美成人| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久国产成人免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲成人久久性| www.999成人在线观看| 成人手机av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产爱豆传媒在线观看 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产主播在线观看一区二区| 麻豆国产av国片精品| 怎么达到女性高潮| 身体一侧抽搐| 国产精品av久久久久免费| 性欧美人与动物交配| 99国产精品一区二区三区| 99re在线观看精品视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黄色a级毛片大全视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天堂√8在线中文| 国产真实乱freesex| 99精品在免费线老司机午夜| 我的老师免费观看完整版| 国产精品一区二区三区四区久久| 好男人在线观看高清免费视频| 一级毛片女人18水好多| ponron亚洲| 午夜福利免费观看在线| e午夜精品久久久久久久| 特级一级黄色大片| 一a级毛片在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 天堂影院成人在线观看| 一区二区三区激情视频| 嫩草影院精品99| 一本一本综合久久| 又黄又粗又硬又大视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 五月玫瑰六月丁香| bbb黄色大片| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲国产看品久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久人妻av系列| 我的老师免费观看完整版| 久久精品综合一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 一本综合久久免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| videosex国产| a在线观看视频网站| 精品第一国产精品| www.自偷自拍.com| 欧美在线一区亚洲| 两个人看的免费小视频| 免费看a级黄色片| 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久久久久久久久| 久久香蕉精品热| АⅤ资源中文在线天堂| 日本一区二区免费在线视频| 欧美性长视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 在线观看日韩欧美| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日本熟妇午夜| 一级黄色大片毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品久久久久久精品电影| 久久久久久国产a免费观看| www.www免费av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 久久人人精品亚洲av| 变态另类丝袜制服| 老鸭窝网址在线观看| xxxwww97欧美| 国产精品野战在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲国产看品久久| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲成av人片免费观看| √禁漫天堂资源中文www| 久久这里只有精品中国| 日韩高清综合在线| 国产精品亚洲美女久久久| 国产一区二区在线观看日韩 | 在线永久观看黄色视频| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩东京热| 免费av毛片视频| 在线观看日韩欧美| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人av教育| 一本综合久久免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲精品av在线| 午夜a级毛片| 一本久久中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品一及| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产av一区在线观看免费| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产视频内射| 一区二区三区激情视频| 岛国在线免费视频观看| 中文字幕久久专区| 欧美黑人精品巨大| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99热只有精品国产| 国产成人欧美在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久热在线av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜免费激情av| 人人妻人人看人人澡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 热99re8久久精品国产| 曰老女人黄片| 国产黄a三级三级三级人| 国产97色在线日韩免费| 老汉色∧v一级毛片| 日本免费a在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人国产一区最新在线观看| 日本 欧美在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 99久久精品国产亚洲精品| 久热爱精品视频在线9| 色综合站精品国产| 日韩欧美国产在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲最大成人中文| 国产一区二区激情短视频| 亚洲avbb在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国语自产精品视频在线第100页| 宅男免费午夜| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久人人精品亚洲av| 亚洲五月婷婷丁香| 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 天堂影院成人在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产男靠女视频免费网站| 十八禁人妻一区二区| 一本综合久久免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 妹子高潮喷水视频| 1024视频免费在线观看| 国产午夜精品论理片| 国产成年人精品一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文亚洲av片在线观看爽| 叶爱在线成人免费视频播放| 真人做人爱边吃奶动态| 久久久久久久久久黄片| 欧美成人免费av一区二区三区| 不卡一级毛片| 精品久久久久久久末码| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久久久午夜电影| xxx96com| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 动漫黄色视频在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 在线a可以看的网站| 极品教师在线免费播放| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 免费看日本二区| 国产爱豆传媒在线观看 | www.自偷自拍.com| 成人手机av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| avwww免费| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一夜夜www| 日日夜夜操网爽| 黄色女人牲交| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲人成电影免费在线| 黄色 视频免费看| 人成视频在线观看免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品一及| 亚洲第一电影网av| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 狂野欧美激情性xxxx| 精品国产亚洲在线| 日韩大码丰满熟妇| 精品福利观看| 岛国在线免费视频观看| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利在线在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产激情久久老熟女| 国产野战对白在线观看| xxxwww97欧美| 日本五十路高清| 久久九九热精品免费| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av熟女| 亚洲av五月六月丁香网| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩欧美三级三区| 九色国产91popny在线| 在线观看一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 嫩草影视91久久| 国产av又大| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久国内视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲九九香蕉| 欧美日本视频| 成在线人永久免费视频| 91九色精品人成在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲人成网站高清观看| 宅男免费午夜| 国产久久久一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美又色又爽又黄视频| 热99re8久久精品国产| 两个人的视频大全免费| 一级作爱视频免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美日韩一级在线毛片| 男人舔女人的私密视频| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 妹子高潮喷水视频| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 麻豆国产97在线/欧美 | 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品一区二区三区四区久久| 中出人妻视频一区二区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 露出奶头的视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 丁香六月欧美| 国产三级在线视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产野战对白在线观看| www.www免费av| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品成人免费网站| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线观看日韩欧美| 国产午夜精品论理片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品电影一区二区在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 婷婷亚洲欧美| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲免费av在线视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 十八禁网站免费在线| 国产亚洲欧美98| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲无线在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| www.自偷自拍.com| 麻豆av在线久日| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲,欧美精品.| 国产97色在线日韩免费| 欧美三级亚洲精品| 国产高清有码在线观看视频 | 波多野结衣高清无吗| 俺也久久电影网| 香蕉久久夜色| 天堂动漫精品| 国产97色在线日韩免费| 黄色 视频免费看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 婷婷丁香在线五月| 欧美黑人精品巨大| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线永久观看黄色视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 88av欧美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲无线在线观看| 无限看片的www在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品久久视频播放| 日本黄大片高清| 后天国语完整版免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| av欧美777| 成人三级做爰电影| 国产免费av片在线观看野外av| 级片在线观看| 88av欧美| 精品高清国产在线一区| 国产黄色小视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久中文字幕一级| 欧美日韩精品网址| 久久九九热精品免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久性生活片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕av在线有码专区| 99国产综合亚洲精品| 搞女人的毛片| 久久精品成人免费网站| 国产高清视频在线播放一区| 国产97色在线日韩免费| 久久这里只有精品中国| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美乱妇无乱码| 精品电影一区二区在线| 少妇的丰满在线观看| 一区福利在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲中文av在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 狠狠狠狠99中文字幕| av免费在线观看网站| 国模一区二区三区四区视频 | 哪里可以看免费的av片| 欧美极品一区二区三区四区| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产乱人伦免费视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 欧美成人午夜精品| 国产高清有码在线观看视频 | 欧美日本视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 两个人看的免费小视频| 久久亚洲精品不卡| 精品欧美一区二区三区在线| av中文乱码字幕在线| 一进一出抽搐动态| 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美日韩黄片免| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 岛国在线免费视频观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av美国av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 1024香蕉在线观看| svipshipincom国产片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 特大巨黑吊av在线直播| 精品久久久久久久久久久久久| 美女午夜性视频免费| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品日产1卡2卡| 精品国产美女av久久久久小说| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久热在线av| 中文字幕熟女人妻在线| 婷婷精品国产亚洲av| 俺也久久电影网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 特大巨黑吊av在线直播| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产午夜精品论理片| 中亚洲国语对白在线视频| 国产99白浆流出| 美女 人体艺术 gogo| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美久久黑人一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲欧美日韩高清专用| av中文乱码字幕在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 十八禁网站免费在线| 国产亚洲精品一区二区www| 久久精品91无色码中文字幕| 999久久久国产精品视频| 免费在线观看亚洲国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲avbb在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 日韩国内少妇激情av| 麻豆av在线久日| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久久久久成人av| 久久久久久久久久黄片| 国产午夜精品论理片| 在线观看午夜福利视频| 欧美又色又爽又黄视频| 在线播放国产精品三级| av有码第一页| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一级作爱视频免费观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产高清有码在线观看视频 | 精品久久久久久久末码| www.自偷自拍.com| 国产精品永久免费网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产乱人伦免费视频| av福利片在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产激情欧美一区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品1区2区在线观看.| bbb黄色大片| 国产高清激情床上av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 大型av网站在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久性生活片| 国产精品,欧美在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩大码丰满熟妇| 久久人人精品亚洲av| 欧美久久黑人一区二区| 日本免费a在线| 妹子高潮喷水视频| 婷婷丁香在线五月| 国产黄a三级三级三级人| 色老头精品视频在线观看| av福利片在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 色播亚洲综合网| 亚洲 国产 在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 九九热线精品视视频播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 女警被强在线播放| 国产不卡一卡二| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品 国内视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线播放国产精品三级| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产99白浆流出| 精品午夜福利视频在线观看一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩精品中文字幕看吧| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久精品国产综合久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费在线观看日本一区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 手机成人av网站| 亚洲人与动物交配视频| 两个人免费观看高清视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美在线黄色| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品久久国产高清桃花| 最好的美女福利视频网| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 999久久久国产精品视频| 黄色丝袜av网址大全| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲成人国产一区在线观看| 不卡av一区二区三区| bbb黄色大片| 国产精品,欧美在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久9热在线精品视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品影院久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久亚洲真实| 亚洲乱码一区二区免费版| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美在线一区亚洲| 亚洲真实伦在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美色视频一区免费| 亚洲 国产 在线| 国产成人欧美在线观看| 国产精品一及| 亚洲中文日韩欧美视频| 搡老妇女老女人老熟妇| av免费在线观看网站| 一级作爱视频免费观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 天堂影院成人在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美精品亚洲一区二区| 香蕉国产在线看| 色在线成人网|