玉米抗莠去津相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測

關(guān)鍵詞：玉米；莠去津；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因；分子標記

中圖分類號：S513：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0028-08

玉米（Zea mays L.）作為主要的糧食、飼料和能源作物，在保證國家糧食安全和民生發(fā)展方面發(fā)揮著不可替代的作用。玉米生長受雜草危害嚴重，雜草與玉米在地上激烈爭奪光照資源，并影響通風，在地下爭奪養(yǎng)分與水分，嚴重影響玉米的生長發(fā)育。此外，雜草還是一些病蟲害的傳播媒介，易引發(fā)蚜蟲、病毒病等病蟲害?；瘜W除草是當前玉米生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的除草方式，具有效果好、成本低等優(yōu)勢。然而，目前玉米生產(chǎn)中使用的除草劑種類繁多，如酰胺類、磺酰脲類、磺酰胺類、脲類、苯氧羧酸類和有機雜環(huán)類等，它們的作用方式、除草效果以及殘留等存在一定差異。莠去津（atrazine）作為三嗪類除草劑，屬選擇性內(nèi)吸傳導型除草劑，苗前、苗后均可使用，其通過抑制Di蛋白的活性，干擾光合作用過程中的電子傳輸系統(tǒng)，從而阻礙植物生長發(fā)育，達到除草效果。由于莠去津的殺草功效好且價格較低，在世界各地迅速得到了應(yīng)用和推廣，成為使用最廣泛使用的除草劑之一。莠去津一般在玉米3～5葉期、雜草2～4葉期時施藥，對玉米較為安全。但是，不同玉米材料對莠去津也存在藥害差異，有的材料抗性較好，而有的材料則表現(xiàn)出藥害較重的現(xiàn)象，如噴施莠去津后呈褪綠斑、變黃、部分苗葉緣皺縮、葉片卷縮成筒狀等癥狀。而對造成這種抗性差異的遺傳機制的認知還存在局限。因此，解析玉米種質(zhì)抗莠去津差異的遺傳機制，選育出有耐／抗除草劑內(nèi)源基因的玉米種質(zhì)資源，可減少莠去津除草劑對玉米雜交后代的藥害程度。在保證除草效果的基礎(chǔ)上，篩選出耐除草劑玉米種質(zhì)資源并深入解析其遺傳基礎(chǔ)對玉米抗莠去津除草劑種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

迄今為止，連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析方法均被證明是復雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)解析的有效方法。國內(nèi)外學者利用上述兩種分析方法對作物抗除草劑性狀進行QTL（quantitative trait locus，數(shù)量性狀基因座）定位研究。通過QTL連鎖定位，Bhoite等以小麥W7984×Westonia重組自交系為材料，苗期使用三嗪類除草劑處理，以相對葉綠素含量為評價指標，共檢測到4個QTLs，其中4A染色體上2個，2D染色體和1A染色體上各1個；Javid等以豌豆Kaspa×PBA的重組自交系為材料，在除草劑脅迫條件下，以豌豆受藥害綜合評級為表型，檢測到16個抗莠去津除草劑相關(guān)QTLs；張銳劍以CA19×浙粳22重組自交系群體F_4：5的158個株系為材料，在三葉期噴濃度為2g/L的草甘膦溶液，以枯死時間、存活率和枯死指數(shù)3個性狀作為評價指標，共檢測到3個耐草甘膦相關(guān)QTLs。但是，針對玉米抗莠去津差異QTL定位的研究較少。

本研究以包含234份玉米自交系關(guān)聯(lián)群體為材料，基于前期包含56000個SNPs（single nucle-otide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）芯片的基因型鑒定結(jié)果和該群體抗莠去津表型評價數(shù)據(jù)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析，規(guī)模化鑒定控制玉米抗莠去津相關(guān)性狀變異的QTNs（ quantitative trait nu-cleotides，數(shù)量性狀遺傳位點）。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學分析方法，挖掘相關(guān)候選基因，為解析玉米抗莠去津變異的遺傳基礎(chǔ)提供理論支持，為培育抗除草劑玉米種質(zhì)資源提供科學支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料和田間設(shè)計

試驗選用包含234份玉米自交系的關(guān)聯(lián)群體為材料，其中溫帶自交系96份，熱帶自交系138份，均種植于貴陽市花溪區(qū)貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所溫室大棚內(nèi)。玉米種子播于蛭石和營養(yǎng)土按照1：1比例混合的基質(zhì)內(nèi)，每份自交系播5粒種子，重復3次。溫室培養(yǎng)條件為：晝、夜溫度分別為30、26℃，自然光照。玉米二葉期噴施生產(chǎn)上常用的38%莠去津除草劑（12mL/L），對照組噴施清水。

1.2葉綠素含量（SPAD）測定及分析

根據(jù)《除草劑防治轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米田雜草田間藥效實驗準則》，于噴藥后第15天，使用攜便式葉綠素儀檢測每株幼苗第2片葉的葉綠素含量。

利用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS Statistics 27.0.1軟件進行基本描述、方差等數(shù)據(jù)分析。

1.3關(guān)聯(lián)群體抗藥性調(diào)查與分析

噴施莠去津后15天，按照除草劑藥害癥狀分級標準（表1）進行藥害分級調(diào)查，根據(jù)抗性評價分級標準（表2）確定玉米對莠去津的抗藥級別。玉米受害率計算公式為：X（%）=[∑（N×S）/（T×M）]×100。其中：X為受害率，N為同級受害株數(shù)；S為級別值；T為總株數(shù)；M為最高級別。

1.4基因型鑒定與分析

基因型鑒定工作項目組前期已經(jīng)完成。即采用CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計進行DNA濃度和純度檢測。將質(zhì)檢合格的DNA原液一部分稀釋至100ng/μL送康普生物（北京）科技有限公司進行基因型數(shù)據(jù)測定，一部分-20℃保存?zhèn)溆?。利用MaizeSNP50芯片對關(guān)聯(lián)群體進行基因型鑒定，剔除數(shù)據(jù)缺失頻率gt;20%、最小等位基因頻率lt;5%的SNP標記，剔除無明確位置的SNP標記，獲得高質(zhì)量的SNP標記，用于全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.5全基因組關(guān)聯(lián)分析

結(jié)合已有的基因型和表型評價結(jié)果，使用R軟件GAPIT（genome associated prediction integrat-ed tool）程序包，對SPAD以及玉米受害率進行全基因組掃描，顯著性閾值設(shè)置為Plt;0.001。根據(jù)項目組前期的研究結(jié)果，該群體的平均LD（link-age disequilibrium，連鎖不平衡）距離為50kb。根據(jù)Wu等描述的方法，參照各SNP在基因組中的物理位置，利用MaizeGDB（https：//www.maizegdb.org/genome/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Uniprot（https：//www.uniprot.or）等數(shù)據(jù)庫，對顯著性SNP位點上、下游各50kb區(qū)段內(nèi)的基因進行候選基因篩選及功能注釋。

2結(jié)果與分析

2.1噴施莠去津?qū)τ衩兹~片葉綠素含量的影響

由表3可見，玉米噴施莠去津處理組與對照組SPAD值有較大差異，組間變異系數(shù)為4.05%。從直方圖擬合曲線上看，關(guān)聯(lián)群體處理與對照的SPAD均符合正態(tài)分布。方差分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)聯(lián)群體噴藥處理組與對照組葉綠素含量呈極顯著差異（圖1）。

2.2玉米幼苗莠去津抗性鑒定結(jié)果

玉米對莠去津除草劑抗感數(shù)量和比例均呈偏正態(tài)分布趨勢（圖2），其中，高抗的材料較少，感的材料較多，其次分別為中抗、抗以及高感材料。受害率≤10%的高抗材料有20份，占8.55%：受害率gt;10%～30%的抗性材料有40份，占17.09%：受害率gt;30%～50%的中抗材料54份，占比23.08%：受害率gt;50%～70%的感的材料有91份，占38.89%；受害率gt;70%的高感的材料有29份，占12.39%。48.72%的材料表現(xiàn)出中抗及以上，感及高感材料共占51.28%。

2.3玉米葉片SPAD值及玉米受害率全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（圖3、圖4）顯示，共檢測到62個莠去津藥害脅迫下與SPAD值和受害率顯著相關(guān)的QTNs。與SPAD值相關(guān)的顯著QTNs有35個，分別位于玉米的1、3、4、5、6、7、8、9號染色體上，其中1號染色體上有10個，3號和6號染色體上各有5個，4號染色體上有8個，5、8號和9號染色體上各有2個，7號染色體上有1個。與玉米受害率顯著相關(guān)的QTNs位點有27個，分別位于玉米的1、2、3、4.8、9、10號染色體上，其中1號染色體上有7個，2、8、9號染色體上各有3個，3號染色體上有2個，4號染色體上有5個，10號染色體上有4個。其中PZE-104041162和PZE-104041163為兩性狀中均定位到的QTNs位點。

2.4玉米抗莠去津相關(guān)候選基因預(yù)測

針對鑒定出的62個玉米抗莠去津除草劑相關(guān)性狀顯著性QTNs位點，分別在目標位點上、下游各50 kb范圍內(nèi)篩選候選基因。結(jié)合基因功能注釋，共挖掘出57個與玉米抗莠去津相關(guān)的候選基因，其中，與SPAD值相關(guān)的基因23個，與玉米受害率相關(guān)的基因34個，含未知功能基因19個。其中，候選基因GRMZM2C030768由共定位QTNsPZE-104041162和PZE-104041163共同篩選到，編碼SWI/SNF及基質(zhì)相關(guān)的肌動蛋白依賴性染色質(zhì)亞家族A成員3-樣3調(diào)節(jié)因子：候選基因GRMZM2C311465編碼超敏反應(yīng)蛋白2（HIR2），GRMZM2C017536編碼DUF4378結(jié)構(gòu)域蛋白，GRMZM2G172826編碼細胞色素P45071A1，GRMrZM2G129431編碼鋅指相關(guān)蛋白，GRMZM2G334791編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（SAPK4）、GRMZM2G177878編碼SR01蛋白，這些基因主要參與植物生長發(fā)育、植物免疫、植物激素信號傳導的調(diào)節(jié)，生物脅迫以及非生物脅迫響應(yīng)過程等；GRMZM2C064962、GRMZM2C457309、GRMZM2G157010等19個功能基因未知。各候選基因信息見表4。

3討論與結(jié)論

本研究共鑒定出62個與玉米抗莠去津除草劑相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的QTNs（Plt;0.001），分析獲得相關(guān)候選基因57個。其中候選基因GRMZM2G311465編碼HIR2蛋白，參與植物免疫反應(yīng)、花青素合成、生物脅迫以及非生物脅迫應(yīng)答等過程。Nadimpalli等在玉米中發(fā)現(xiàn)Zm-HIR2與植物抗病反應(yīng)相關(guān)，參與植物防御；在擬南芥中，AtHIR2參與RPS2復合物的形成、RPS2介導的ETI反應(yīng)，以及對丁香假單胞菌的抗性：在蘋果中，MdHIR2與MdJA22互作可增強JAZ蛋白的穩(wěn)定性從而抑制花青素的合成。候選基因GRMZM2G017536在擬南芥中參與脫落酸信號傳導調(diào)控，Koops等發(fā)現(xiàn)其參與擬南芥的激素調(diào)控應(yīng)答，不僅多方面調(diào)控植物發(fā)育，還參與植物對溫度、干旱、滲透和鹽脅迫的應(yīng)答。候選基因GRMZM2G172826編碼細胞色素P45071A1，植物細胞色素P450主要參與生物合成與生物解毒途徑。CYP71A1的首次報道是在鱷梨中，編碼一個與果實成熟相關(guān)的酶，Chen等研究發(fā)現(xiàn)水稻在使用五氟磺草胺除草劑后45071A1被過表達和誘導。候選基因GRMZM2G129431編碼光系統(tǒng)Ⅰ的PSI-H亞基，Lunde等研究表明在缺乏PSI亞基PSI-H的情況下，捕光天線蛋白無法將能量轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)Ⅰ，并且狀態(tài)轉(zhuǎn)換受損。Varotto等發(fā)現(xiàn)敲除PSI-H的擬南芥葉片較野生型顏色淺，其葉綠素含量相對減少，生長速度顯著降低，在逆境脅迫下可能導致植物受到更嚴重的影響。候選基因GRMZM2G334791編碼的SAPK4是響應(yīng)代謝、生物和非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵元件。Diedhiou等通過培養(yǎng)過表達SAPK4的轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)現(xiàn)，誘導SAPK4的表達可以促進鹽脅迫下種子的萌發(fā)與成熟植株的生長發(fā)育。鹽脅迫下，過表達SAPK4的水稻Na+和Cl-積累量減少，光合作用改善。候選基因CRMZM2G177878在植物的生長發(fā)育，應(yīng)對干旱、冷、氧化、鹽堿以及重金屬等非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。候選基因GRMZM2G030768編碼SWI/SNF及基質(zhì)相關(guān)的肌動蛋白依賴性染色質(zhì)亞家族A成員3-樣3調(diào)節(jié)因子，屬于SWI/SNF蛋白家族，與染色體重塑相關(guān)，主要參與植物營養(yǎng)生長、生殖發(fā)育、植物激素信號傳導的調(diào)節(jié)以及非生物脅迫響應(yīng)過程，其具體功能尚未可知。這些QTNs可作為后續(xù)玉米種質(zhì)抗莠去津改良的分子標記，所分析的基因可能是影響玉米對莠去津抗性的重要候選基因，為開發(fā)玉米抗莠去津分子標記、深入研究基因功能等提供重要靶標。