奶山羊睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

關(guān)鍵詞：奶山羊；睪丸支持細(xì)胞；分離培養(yǎng)方法；鑒定；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）11-0141-07

奶山羊?yàn)橹匾哪绦笾唬陙?lái)隨著人們對(duì)奶類(lèi)食品需求的增加，奶山羊養(yǎng)殖業(yè)得到快速發(fā)展。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）數(shù)據(jù)顯示，2020年全球奶山羊存欄量為220 92.14萬(wàn)只，產(chǎn)奶量達(dá)206 2.96萬(wàn)噸，而且增產(chǎn)增量趨勢(shì)明顯。改善雄性奶山羊繁殖性能對(duì)于加快遺傳改良、優(yōu)化繁殖管理、提高產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

睪丸是哺乳動(dòng)物雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，睪丸曲細(xì)精管復(fù)層上皮是產(chǎn)生精子的部位，由生精細(xì)胞和支持細(xì)胞（Sertoli cells，SCs）構(gòu)成，其中SCs可為生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、支持和保護(hù)，對(duì)維持精子正常發(fā)生具有重要意義。體外分離培養(yǎng)SCs可以模仿睪丸內(nèi)部生理?xiàng)l件，同時(shí)可避免與周?chē)?xì)胞間相互作用，有助于更好地探究雄性生殖系統(tǒng)的生理過(guò)程及調(diào)控機(jī)制，目前已廣泛應(yīng)用于生殖毒理學(xué)、生殖內(nèi)分泌學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等方面的研究。

目前關(guān)于SCs分離培養(yǎng)方法的報(bào)道主要集中在人、小鼠、豬以及牛中，關(guān)于奶山羊的報(bào)道較少，且已報(bào)道的奶山羊SCs分離培養(yǎng)方法存在分離步驟繁瑣、細(xì)胞純度較低以及培養(yǎng)狀態(tài)不穩(wěn)定等問(wèn)題，在一定程度上制約了對(duì)奶山羊雄性生殖系統(tǒng)的深入研究。因此，本研究以莎能奶山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)其SCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，比較了三種常用酶消化法的分離效率，并采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)效果進(jìn)行評(píng)估，旨在尋求經(jīng)濟(jì)、高效、可持續(xù)培養(yǎng)的奶山羊SCs分離培養(yǎng)方法，為深入開(kāi)展奶山羊雄性生殖機(jī)能研究提供材料支撐。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2023年3月在陜西省千陽(yáng)縣種羊場(chǎng)選出6只2月齡、體重（10.33+1.00） kg、健康的雄性莎能奶山羊，用于睪丸采集。本研究經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：DY2023033）。

1.1.2主要試劑 膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶Ⅱ和DNase Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基（DMEM-F12）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Zeta Life公司；兔抗WT1、鼠抗Vimentin、DAPI購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司：臺(tái)盼藍(lán)染色液、三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液）、細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（cell counting

kit-8，CCK-8）、蘇木素-伊紅染色試劑盒、油紅0染色試劑盒、中性樹(shù)膠、抗熒光猝滅封片劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 倒置熒光顯微鏡為德國(guó)Zeiss公司產(chǎn)品：研究級(jí)正置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品：透射電子顯微鏡為美國(guó)FEI公司產(chǎn)品：自動(dòng)熒光顯微鏡、超薄切片機(jī)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱和CountessⅡ自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1奶山羊睪丸支持細(xì)胞的分離 取莎能奶山羊睪丸組織，立即放人含2%三抗的PBS中清洗2min，之后轉(zhuǎn)到生物安全柜中操作。剝離睪丸被膜后將其均等分成三份放人50mL離心管中，分別標(biāo)為A、B、C三組，將每組的睪丸組織剪成約1mm3組織塊，放入含2%三抗的PBS中清洗2次，各組加入不同的酶進(jìn)行消化。所有試劑均37℃預(yù)熱后使用。

A組（胰酶消化法）：將DMEM-F12培養(yǎng)基與0.25%胰酶等體積混合，配制0.125%胰酶消化液。睪丸組織加入0.125%胰酶消化液5mL，置于37℃振蕩水浴鍋中消化30 min。

B組（兩步酶消化法）：使用DMEM-F12培養(yǎng)基配制1mg/mL的膠原酶Ⅳ消化液。睪丸組織加入1mg/mL膠原酶Ⅳ消化液5 mL，置于37℃振蕩水浴鍋中消化40 min;隨后加入完全培養(yǎng)基（DMEM-F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%三抗，下同）清洗3遍，1000r/min離心5 min后加入0.25%胰酶，于37℃振蕩水浴鍋中消化15min。

C組（兩步混合酶消化法）：使用DMEM-F12培養(yǎng)基配制兩種酶混合液，酶混合液Ⅰ為1mg/mL膠原酶Ⅳ+1mg/mL透明質(zhì)酸酶Ⅱ等體積混合，酶混合液Ⅱ?yàn)?.25%胰蛋白酶+5μg/mLDNase Ⅰ等體積混合。睪丸組織加入5 mL酶混合液Ⅰ，置于37℃振蕩水浴鍋中消化30 min;完全培養(yǎng)基清洗，1000r/min離心5 min后加入5mL酶混合液Ⅱ，于37℃振蕩水浴鍋中消化15min。

各組消化完成后，分別加入完全培養(yǎng)基終止消化，使用200目細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，1000r/min離心5 min，棄上清；用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（35℃，5%CO₂。下同）。

1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù) 取2.5mL剛分離的細(xì)胞懸液與2.5 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液混合均勻，倒置顯微鏡觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活率 將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2xl05個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每間隔24 h進(jìn)行一次CCK-8檢測(cè)。具體操作為：每孔加入CCK-8試劑10μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm下的吸光度值。

1.2.4細(xì)胞純化 選擇B組分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，4h后棄掉培養(yǎng)液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，以去除精原細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等雜細(xì)胞。于第一次傳代前加入20 mmol/L Tris-HCl低滲處理3 min，去除多余生殖細(xì)胞。

1.2.5細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞鋪至70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入0.25%胰酶，于顯微鏡下觀察，當(dāng)大量支持細(xì)胞縮成圓形時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞懸液，離心去除胰酶，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1x10⁶個(gè)/mL并接種至培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6細(xì)胞形態(tài)觀察 通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)0、3、5、7d以及傳代至第2、3、6代的細(xì)胞形態(tài)特征。

1.2.7 HE染色觀察 取分離培養(yǎng)并傳代至第3代的SCs接種到鋪有細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞鋪至70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后用4%多聚甲醛固定液于室溫下固定15 min，PBS清洗3遍。HE染色，脫水，封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8油紅O染色 用1.2.7中的方法制作細(xì)胞爬片，用60%油紅O染色液進(jìn)行染色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水反藍(lán)，甘油封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.9免疫熒光染色 用1.2.7中的方法制作細(xì)胞爬片，0.1% Triton X-100室溫孵育30 min，PBS洗3遍；5% BSA室溫封閉30 min后，分別加入一抗Vimentin（1：500）和WT1（1：300），4℃過(guò)夜孵育；PBST清洗3遍，加入對(duì)應(yīng)種屬的熒光二抗，室溫避光孵育2h;PBST清洗3遍，加入DAPI避光孵育5 min;抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.10透射電子顯微鏡 取傳代培養(yǎng)至第3代的SCs，1000r/min離心5 min清洗，2.5%戊二醛固定12h;PBS漂洗3遍，鋨酸固定4 h；梯度濃度乙醇脫水，梯度濃度LR White滲透并包埋：超薄切片機(jī)切取80 nm切片，并附于銅網(wǎng)上；鈾鉛染色，室溫干燥，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較，以Plt;0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1不同酶消化法分離的奶山羊睪丸支持細(xì)胞活性

分別采用胰酶消化法（A組）、兩步酶消化法（B組）和兩步混合酶消化法（C組）分離莎能奶山羊SCs，并利用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)三種分離方法獲得的細(xì)胞密度和活率。結(jié)果顯示：胰酶消化法獲得的細(xì)胞密度為（81.2+1.61） ×10⁵個(gè)/mL，顯著低于兩步酶消化法的（91.63+1.94）×10⁵個(gè)/mL和兩步混合酶消化法的（92.74+2.26）×10⁵個(gè)/mL（Plt;0.05）（圖1A）；兩步酶消化法和兩步混合酶消化法所獲細(xì)胞活率分別為（97.84+0.65）%和（97.38±0.88）%，均顯著高于胰酶消化法的（89.85±1.45）%（Plt;0.05）（圖1B）。進(jìn)一步通過(guò)CCK-8法檢測(cè)三種分離方法所獲細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果（圖1C）顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，三種分離方法得到的SCs增殖曲線(xiàn)呈典型“S”形，符合正常細(xì)胞增殖規(guī)律：三種消化法分離獲得的細(xì)胞均于3d時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6～7 d增殖速度減慢，進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，但相較于兩步酶消化法和兩步混合酶消化法，胰酶消化法獲得的細(xì)胞增殖活力較低。綜合來(lái)看，兩步酶消化法得到的細(xì)胞活力較好且步驟較為簡(jiǎn)便，因此選擇兩步酶消化法進(jìn)行后續(xù)SCs培養(yǎng)效果的評(píng)估。

2.2不同培養(yǎng)階段奶山羊睪丸支持細(xì)胞形態(tài)特征

利用差速貼壁法對(duì)兩步酶消化法獲得的SCs進(jìn)行純化，并連續(xù)傳代培養(yǎng)，在第一次傳代前使用Tris-HCl緩沖液低滲處理進(jìn)一步去除生殖細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示：剛分離的細(xì)胞呈圓形，體積較小，折光性強(qiáng)（圖2A）；第3天時(shí)，大部分細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞呈梭形，體積增大，并有多邊形或星狀突起（圖2B）；第5天時(shí)，細(xì)胞已鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底的95%，細(xì)胞形態(tài)為扁平狀，細(xì)胞質(zhì)增多，體積增大，折光性減弱（圖2C）；第7天時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)完全鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底，細(xì)胞形態(tài)與第5天時(shí)相似（圖2D）。傳代至第2代，細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，分布均勻，排列緊密，相互連接呈片狀（圖2E）；傳代至第3代，細(xì)胞貼壁速度變快，細(xì)胞形狀更為扁平（圖2F）；傳代至第6代，細(xì)胞貼壁速度變慢，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞突起萎縮，部分細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核固縮（圖2G）。

2.3奶山羊睪丸支持細(xì)胞HE、油紅O染色及免疫熒光染色

取傳代培養(yǎng)至第3代的SCs進(jìn)行染色鑒定。HE染色結(jié)果（圖3A、B）顯示：細(xì)胞形狀不規(guī)則，具有一個(gè)或多個(gè)較粗的突起，且突起相互連接；細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞質(zhì)中央，細(xì)胞核中可觀察到雙極小體。油紅O染色結(jié)果（圖3C、D）顯示：細(xì)胞質(zhì)中分布大小不一的脂滴，多位于細(xì)胞核周?chē)虬|(zhì)兩極。免疫熒光染色結(jié)果（圖4）顯示：WT1蛋白特異性表達(dá)于SCs的細(xì)胞核中：Vimentin蛋白覆蓋細(xì)胞質(zhì)，并環(huán)繞著細(xì)胞核，構(gòu)成細(xì)胞骨架。細(xì)胞計(jì)數(shù)WT1和Vimen-tin抗體陽(yáng)性率為（96.8±0.2）%。上述結(jié)果表明兩步酶消化法所獲細(xì)胞為SCs且純度高。

2.4奶山羊睪丸支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察第3代SCs，結(jié)果（圖5）顯示：細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈不規(guī)則圓柱形。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線(xiàn)粒體呈管狀，嵴結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較多且結(jié)構(gòu)完整，滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相延續(xù)；溶酶體多有髓鞘樣結(jié)構(gòu)；高爾基體發(fā)達(dá)，可見(jiàn)分泌囊泡。細(xì)胞核大且明顯，形狀不規(guī)則，染色質(zhì)密度低，染色較淺，核仁明顯，具有睪丸SCs特有的結(jié)構(gòu)——雙極小體。上述結(jié)果符合SCs超微結(jié)構(gòu)特征。

3討論與結(jié)論

體外培養(yǎng)SCs是研究雄性生殖機(jī)理的基礎(chǔ)技術(shù)，為深入探究和闡明雄性生殖系統(tǒng)相關(guān)問(wèn)題提供重要科研材料。本研究以2月齡雄性莎能奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，比較不同酶消化法分離SCs的效率，并評(píng)估SCs培養(yǎng)效果，旨在選出一種經(jīng)濟(jì)、高效的奶山羊SCs分離培養(yǎng)方法。

已有的SCs分離方法包括機(jī)械分離法和酶消化法兩種。機(jī)械分離法會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p傷，且分離效率較低，因此很少使用。而酶消化法能夠利用酶特異性消化的特點(diǎn)溫和分離細(xì)胞，具有保持細(xì)胞較高活力和維持細(xì)胞膜完整性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛使用。楊璐等采用胰酶消化法分離新生黑山羊SCs;Zhang等利用兩步酶消化法（膠原酶Ⅳ+胰酶）分離得到純度較高的山羊SCs;Su等通過(guò)更為復(fù)雜的兩步混合酶消化法（膠原酶Ⅳ與透明質(zhì)酸酶混合液+胰酶與DNase Ⅰ混合液）成功分離了絨山羊的SCs.并用于長(zhǎng)期培養(yǎng)與研究。本研究比較了上述三種酶消化法分離莎能奶山羊SCs的效果，結(jié)果表明，兩步酶消化法與兩步混合酶消化法所獲細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活率和細(xì)胞增殖力均顯著高于胰酶消化法。而胰酶容易過(guò)度消化，破壞細(xì)胞膜表面的膜蛋白，對(duì)細(xì)胞造成較大損傷，這可能是單獨(dú)使用胰酶消化分離奶山羊SCs效果較差的原因。兩步酶消化法與兩步混合酶消化法分離奶山羊SCs的效果相似，但兩步混合酶消化法需要酶種類(lèi)較多，成本較高，相比之下兩步酶消化法的可操作性與經(jīng)濟(jì)性較好，為三種方法中的最佳方法。

剛分離的原代SCs常會(huì)有生殖細(xì)胞污染，需對(duì)其進(jìn)行純化處理。常用的SCs純化方法有差速貼壁法和Tris-HCl低滲法兩種。差速貼壁法利用SCs貼壁能力較強(qiáng)的特性去除雜細(xì)胞，Tris-HCl低滲法則是利用其低滲耐受性去除生殖細(xì)胞。高藝等利用差速貼壁法獲得了純度較高的江香豬SCs，王亞營(yíng)采用Tris-HCl低滲法去除了牦牛SCs中的生殖細(xì)胞：劉博通過(guò)差速貼壁法結(jié)合Tris-HCl低滲法獲得了高純度的小鼠SCs。本研究在原代SCs培養(yǎng)4h后使用差速貼壁法進(jìn)行純化，并在第一次傳代前使用20 mmol/LTris-HCl（pH=7.4）處理，純化后的細(xì)胞經(jīng)鑒定純度大于96%，表明該種方法可獲得高純度的奶山羊SCs。

形態(tài)學(xué)觀察是衡量SCs生長(zhǎng)特性的重要方法。本研究利用倒置顯微鏡對(duì)兩步酶消化法分離的細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)胞具有典型SCs形態(tài)，且在連續(xù)傳代培養(yǎng)至第5代時(shí)仍保持正常SCs形態(tài)。鑒定SCs常用的方法有染色法和免疫學(xué)方法。HE染色后可明顯觀察到SCs形態(tài)和細(xì)胞核內(nèi)深著色的雙極小體，油紅0染色能將富含脂滴的SCs與生殖細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，因此常采用HE和油紅O染色鑒定SCs。免疫學(xué)方法則是通過(guò)免疫組化或免疫熒光等手段檢測(cè)SCs的特異性標(biāo)志蛋白，例如Wilms腫瘤蛋白1（WT1）和波形蛋白（Vimentin）等。本研究通過(guò)HE染色、油紅0染色以及WT1和Vimentin免疫熒光染色對(duì)傳代培養(yǎng)至第3代的SCs進(jìn)行鑒定。HE染色和油紅O染色觀察到的細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，細(xì)胞核內(nèi)有雙極小體，細(xì)胞質(zhì)中存在大小不一的脂滴等SCs典型特征。與王雪等的染色結(jié)果相似，WT1綠色熒光特異性表達(dá)于SCs細(xì)胞核，Vimen-tin綠色熒光特異性表達(dá)于細(xì)胞骨架。超微結(jié)構(gòu)是判斷SCs生物學(xué)特性的重要指標(biāo)。本研究利用透射電子顯微鏡觀察第三代SCs超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SCs結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)含豐富的細(xì)胞器，與Shi等觀察到的黑山羊SCs超微結(jié)構(gòu)一致。以上結(jié)果表明，兩步酶法分離得到的細(xì)胞具有典型SCs的形態(tài)特征，可用于后續(xù)支持細(xì)胞體外培養(yǎng)研究。

綜上，兩步酶消化法（膠原酶Ⅳ+胰酶）可獲得數(shù)量多、活力好、純度高且形態(tài)特點(diǎn)典型的奶山羊SCs，為深入開(kāi)展奶山羊雄性生殖機(jī)理研究提供良好的細(xì)胞學(xué)模型。