基于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路探討LINC00173對(duì)多囊卵巢綜合征顆粒細(xì)胞自噬的影響

摘要：目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA 00173（LINC00173）對(duì)多囊卵巢綜合征（PCOS）顆粒細(xì)胞（GCs）自噬的影響及其機(jī)制。方法 選取行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者（PCOS組）和因輸卵管因素行助孕治療的非PCOS患者（對(duì)照組）各40例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)LINC00173在PCOS GCs中的表達(dá)。另?yè)袢寺殉差w粒細(xì)胞KGN為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)是否過(guò)表達(dá)LINC00173或敲低LINC00173將KGN細(xì)胞分為Vector組和pcLINC00173組，siNC組和siLINC00173組。單丹磺酰尸胺（MDC）染色檢測(cè)過(guò)表達(dá)LINC00173對(duì)KGN細(xì)胞自噬的影響，Western blot法檢測(cè)KGN細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）、p62及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、PI3K、Akt及mTOR表達(dá)的影響。另設(shè)siNC組、siLINC00173組、siLINC00173+DMSO組和siLINC00173+LY294002組，檢測(cè)LY294002對(duì)LC3B和p62蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 PCOS組LINC00173表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。LINC00173過(guò)表達(dá)后KGN細(xì)胞自噬體含量增加。與Vector組比較，pcLINC00173組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)上調(diào)，p62表達(dá)下調(diào)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR表達(dá)下調(diào)。與siNC組比較，siLINC00173組上述蛋白表達(dá)變化相反。siLINC00173+LY294002組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平高于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組，p62蛋白表達(dá)水平低于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組（P＜0.05）。結(jié)論 LINC00173可誘導(dǎo)PCOS GCs自噬，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：多囊卵巢綜合征；RNA，長(zhǎng)鏈非編碼；自噬；LINC00173；顆粒細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R711.75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240511

The effect of LINC00173 regulating autophagy of PCOS granulosa cells based on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

ZHAO Yuanyuan， WU Xiaohua△

Center for Reproductive Medicine， the Fourth Hospital of Shijiazhuang （Gynecology and Obstetrics Hospital Affiliated to Hebei Medical University）; Key Laboratory of Maternal and Fetal Medicine of Hebei Province; Provincial Key Medical Discipline of Hebei Province; the Institute of Reproductive Health and Infertility， Shijiazhuang 050011， China

△Corresponding Author E-mail： wuxiaohua1965@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of long non-coding RNA 00173 （LINC00173） on autophagy of granulosa cells （GCs） in polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods A total of 40 PCOS patients and 40 patients （non-PCOS） treated with tubal factors who underwent in vitro fertilization-embryo transfer （IVF-ET） were selected. The expression levels of LINC00173 in GCs of PCOS were detected by qPCR. Human ovarian granulosa cells KGN were selected as the experimental subject. The cells were divided into the Vector group， the pcLINC00173 group， the siNC group and the siLINC00173 group based on their over-expression or interference with LINC00173. Dansylcadaverine （MDC） staining was employed to assess the impact of LINC00173 on autophagy of KGN cells. Western blot assay was conducted to investigate the effect of LINC00173 on autophagy and the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in KGN cells， focusing on expression levels of key pathway-related proteins including LC3B-Ⅱ/Ⅰ， p62， p-PI3K， p-Akt， p-mTOR， PI3K， Akt and mTOR. The effects of LY294002 on the expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ and p62 proteins were detected in the siNC group， the siLINC00173 group， the siLINC00173+DMSO group and the siLINC00173+LY294002 group. Results LINC00173 was significantly upregulated in GCs of PCOS patients （P＜0.05）. The overexpression of LINC00173 in KGN cells resulted in the presence of autophagosomes and autophagolysosomes in cytoplasm （P＜0.05）. Compared with the vector group，" there was an increased expression of autophagy-related proteins LC3B-Ⅱ/Ⅰ and a decreased expression in p62 in the pcLINC00173 group （P＜0.05）. Additionally， there was a decreased expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR. Conversely， in the siLINC00173 group， the expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ decreased while p62 expression increased compared to the siNC group （P＜0.05）， along with alterations in PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins. Compared to the siLINC00173+DMSO group or the siLINC00173 group，" PI3K/Akt/mTOR signaling pathway inhibitor LY294002 was found to alleviate the inhibitory effect of siLINC00173 on LC3B-Ⅱ/Ⅰ protein expression in KGN cells" in the siLINC00173 group （P＜0.05） and to reduce the impact of siLINC00173 on up-regulation of p62 protein expression （P＜0.05）. Conclusion Results reveal that LINC00173 can induce autophagy activation in PCOS GCs， and the mechanism of the action may be related to the inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words： polycystic ovary syndrome; RNA， long noncoding; autophagy; LINC00173; granulosa cells

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的內(nèi)分泌及代謝異常性疾病，其臨床特征主要表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或無(wú)排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變。其中，卵泡發(fā)育異常是PCOS患者的普遍特征，嚴(yán)重影響女性的生殖健康。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）是卵泡中最大的細(xì)胞群及主要功能單位。卵泡發(fā)育成熟及排卵主要依賴于卵泡微環(huán)境中GCs功能的正常運(yùn)行，其功能障礙可引起卵泡閉鎖，最終排卵受阻導(dǎo)致不孕［1］。有研究顯示，PCOS患者GCs自噬異常激活，細(xì)胞自噬蛋白Beclin1及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B-Ⅱ/Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ/Ⅰ，LC3BⅡ/Ⅰ）在GCs中表達(dá)升高，自噬底物蛋白（sequestosome-1/protein 62，SQSTM/p62）表達(dá)降低，干擾了卵泡的正常發(fā)育［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子［3］，可通過(guò)影響卵巢GCs的功能參與調(diào)控人卵母細(xì)胞的成熟、受精和胚胎發(fā)育等生理過(guò)程［4-5］。本課題組前期研究通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)非編碼RNA 00173（LINC00173）在PCOS GCs中異常高表達(dá)，但LINC00173對(duì)PCOS GCs自噬的影響及作用機(jī)制尚不清楚。本研究對(duì)此進(jìn)行探討，旨在為PCOS的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 臨床組織樣本 選取2023年1月—12月于石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transform，IVF-ET）助孕治療的PCOS患者40例為PCOS組，年齡22～35歲，平均（28.80±3.55）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤35歲。（2）PCOS診斷符合2003年鹿特丹專家共識(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴甲狀腺疾病、糖尿病等其他內(nèi)分泌疾病。（2）女方染色體異常。（3）伴子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢良惡性腫瘤等其他婦科疾病。另?yè)裢谝蜉斅压芤蛩囟殉补δ苷Ｐ蠭VF-ET助孕治療的非PCOS患者40例為對(duì)照組，年齡23～35歲，平均（30.08±2.97）歲。2組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.743，P＞0.05）。本研究根據(jù)世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言進(jìn)行，經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：20220112），患者知情并簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞、試劑及藥物 人卵巢顆粒細(xì)胞KGN購(gòu)自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司。DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、單丹磺酰尸胺（Dansylcadaverine，MDC）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；樣本密度分離液購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)密理博公司；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；LC3B、p62、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）兔抗人多克隆抗體和PI3K鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)成都正能生物科技有限公司；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG山羊抗兔/鼠抗體購(gòu)自美國(guó)KPL公司，LY294002抑制劑購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress生物科技公司。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜（SW-CS-ⅠFD，蘇州凈化設(shè)備公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（ROC-3000TVBB，美國(guó)REVCO公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（qTOWER3G，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)伯樂(lè)公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（FUSIONFX7.EDGE，法國(guó)VILBER公司）；倒置顯微鏡（Nikon，日本尼康公司）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析LINC00173在PCOS GCs中的表" 達(dá) 利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載關(guān)于PCOS GCs的lncRNAs數(shù)據(jù)集（GSE95728），分析LINC00173在PCOS GCs中的表達(dá)。

1.2.2 人原代GCs提取 收集患者第1管卵泡液，提取卵泡液中的GCs。將收集的卵泡液置于50 mL無(wú)菌離心管中，" " " 2 000×g離心10 min，去除上清液后，將沉淀重懸于5 mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，緩慢加入等量的樣本密度分離液，1 500×g離心10 min；取中間白膜層，PBS清洗后，加入紅細(xì)胞裂解液室溫裂解2 min，隨后1 000×g離心5 min。將所得的沉淀加入TRIzol，暫存于-80 ℃冰箱，用于qPCR檢測(cè)LINC00173的表達(dá)。

1.2.3 KGN細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將凍存的KGN細(xì)胞放置在37 ℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇，1 000×g室溫離心5 min，將所得的沉淀用DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）重懸，置于10 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)傳代處理。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，按照Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：Vector組（轉(zhuǎn)染LINC00173的對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1）和pcLINC00173組（轉(zhuǎn)染LINC00173的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-LINC00173），siNC組（轉(zhuǎn)染siRNA的陰性對(duì)照siNC）和siLINC00173組（轉(zhuǎn)染LINC00173的小干擾RNA siLINC00173），48 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siNC和siLINC00173的核苷酸序列見表1。[基因名稱 核苷酸序列（5'→3'） siNC 上游：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 下游：ACGUGACACGUUCGGAGAATT siLINC00173 上游：GGAACGUUCAGCGGAAUAUTT 上游：AUAUUCCGCUGAACGUUCCTT ][Tab.1 The sequences for siRNAs

1.2.4 qPCR檢測(cè)LINC00173的過(guò)表達(dá)和干擾效果 將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，TRIzol法提取總RNA，按照Hieff? 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書操作：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板，Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR premix Ex Taq 10 μL，滅菌水7.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00173相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表2。[基因名稱 引物序列（5′→3′） 產(chǎn)物大小/bp LINC00173 上游：GCATCCAGCTACCCAGACTC 133 下游：CCTGCAGCACGCAATTAGAC β-actin 上游：CAGAGCAAGAGAGGCATCC 217 上游：CTGGGGTGTTGAAGGTCTC ][Tab.2 Primers for qRT-PCR

1.2.5 MDC染色檢測(cè)LINC00173對(duì)KGN細(xì)胞自噬的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于24孔板。在KGN細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Vector 和pcLINC00173質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后，棄掉24孔板中液體，每孔加入300 μL 1× wash buffer洗1次，棄上清液。然后每孔加入600 μL MDC工作液，室溫避光染色30 min，棄掉染色液，以300 μL 1×wash buffer清洗細(xì)胞。用含DAPI的封片劑封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬體生成情況，激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm。

1.2.6 Western blot檢測(cè)LC3B和p62蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染的Vector組、pcLINC00173組、siNC組和siLINC00173組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2～3次，每孔加入等量的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，30 min后，12 000×g離心10 min，去除沉淀。采用Nanodrop 2000檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉孵育1 h，加入一抗LC3B（1∶1 000）、p62（1∶1 000）及內(nèi)參β-actin（1∶10 000），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次后，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1 h，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白條帶，重復(fù)3次。Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.7 Western blot檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 方法及分組同1.2.6，所用一抗分別為p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000），二抗為山羊抗兔/鼠IgG（1∶5 000）。

1.2.8 Western blot檢測(cè)LY294002對(duì)LC3B和p62的蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)siNC組和siLINC00173組，siLINC00173+DMSO組和siLINC00173+LY294002組（LY294002濃度為" " 10 μmol/L）。檢測(cè)方法同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)采用Shapiro-Wilk（S-W）方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s]表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCOS GCs中LINC00173的表達(dá)情況 GSE95728臨床樣本數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，LINC00173在PCOS GCs中高表達(dá)（4.43±0.26 vs. 2.95±0.68），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=7，t=5.391，P＜0.05），見圖1。qPCR結(jié)果顯示，PCOS組LINC00173表達(dá)水平2.17（0.91，7.78）高于對(duì)照組0.84（0.47，2.66），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=40，Z=2.935，P＜0.05）。

2.2 LINC00173在KGN細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)及干擾效果 與Vector組相比，pcLINC00173組細(xì)胞中LINC00173相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組細(xì)胞中LINC00173相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.01）。見圖2。

2.3 LINC00173過(guò)表達(dá)對(duì)KGN細(xì)胞自噬水平的影響 MDC染色結(jié)果顯示，pcLINC00173組細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光強(qiáng)度（4.67±0.88）較Vector組（1.00±0.35）增強(qiáng)（n=3，t=6.691，P＜0.05），見圖3。

2.4 各組KGN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B及p62蛋白的表達(dá)變化 與Vector組相比，pcLINC00173組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高，p62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組細(xì)胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖4、表3。

2.5 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變" 化 與Vector組相比，pcLINC00173組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與siNC組相比，siLINC00173組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表4、圖5。[組別 p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt p-mTOR/mTOR Vector組 0.69±0.06 0.77±0.10 1.63±0.19 pcLINC00173組 0.30±0.01 0.11±0.01 0.85±0.08 t 11.105＊ 11.375＊ 6.553＊ siNC組 0.46±0.16 1.47±0.16 0.15±0.04 siLINC00173組 1.43±0.08 2.73±0.14 0.82±0.03 t 9.392＊ 10.265＊ 23.210＊ ][Tab.4 Comparison of relative expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling in KGN cells between the four groups

2.6 LY294002對(duì)LC3B和p62蛋白表達(dá)的影響 與siNC組相比，siLINC00173組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；siLINC00173+LY294002組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平高于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組，p62蛋白表達(dá)水平低于siLINC00173組和siLINC00173+DMSO組（P＜0.05），見圖6、表5。

3 討論

PCOS是引起育齡期女性排卵障礙性不孕的重要原因［6］。研究發(fā)現(xiàn)，GCs功能障礙可能是PCOS患者出現(xiàn)卵泡發(fā)育異常、降低育齡期女性生育能力的重要因素［7］。GCs有凋亡和自噬雙重功能，筆者前期研究已證實(shí)PCOS患者GCs凋亡水平明顯高于健康對(duì)照組［8-9］。而自噬是真核細(xì)胞在自噬相關(guān)蛋白的調(diào)控下，通過(guò)形成自噬體經(jīng)溶酶體途徑降解胞內(nèi)有害成分或受損細(xì)胞器的過(guò)程，從而維持細(xì)胞、組織和生物體的穩(wěn)態(tài)［10］。正常情況下，GCs通過(guò)自噬穩(wěn)態(tài)維持卵巢功能，進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育［10-11］。研究表明，在卵泡閉鎖過(guò)程中，自噬體積累到一定程度可誘導(dǎo)GCs凋亡，PCOS患者GCs自噬異常活躍，自噬蛋白Beclin1表達(dá)水平升高，且Beclin1與血清睪酮T、抗苗勒氏管激素（AMH）呈正相關(guān)，提示GCs自噬異常活躍可能與PCOS患者雄激素水平升高、卵泡發(fā)育異常密切相關(guān)［2］。

近年來(lái)，lncRNA在PCOS中的作用逐漸受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，PCOS患者GCs中LINC00173異常高表達(dá)。有研究表明，LINC00173可通過(guò)miR-124-3p/JAG1通路促進(jìn)卵巢GCs凋亡，進(jìn)而調(diào)控PCOS的進(jìn)展［12］。然而，LINC00173是否影響PCOS GCs自噬鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，LINC00173高表達(dá)后自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平升高，自噬底物p62表達(dá)水平降低；干擾LINC00173表達(dá)后，得到相反的結(jié)果。MDC染色結(jié)果顯示，LINC00173高表達(dá)后，KGN細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯增加。以上結(jié)果提示LINC00173可誘導(dǎo)GCs發(fā)生自噬，促進(jìn)PCOS進(jìn)展，但具體機(jī)制尚待探究。

有研究顯示，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控GCs的增殖、分化及凋亡過(guò)程參與調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育及成熟，對(duì)維持卵泡內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［13］。另有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路亦參與調(diào)控卵巢GCs和卵母細(xì)胞的自噬過(guò)程，是自噬的負(fù)向調(diào)控通路，該通路以磷酸化形式激活時(shí)，自噬受到抑制［14］。本研究結(jié)果顯示，LINC00173過(guò)表達(dá)可抑制KGN細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的表達(dá)；反之，干擾LINC00173的表達(dá)后，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活。在干擾LINC00173的KGN細(xì)胞中加入PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑LY294002后，與單獨(dú)干擾LINC00173或加溶劑組比較，解除了siLINC00173對(duì)KGN細(xì)胞自噬的抑制作用。提示LINC00173通過(guò)誘導(dǎo)GCs自噬抑制PCOS卵泡GCs發(fā)育，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，LINC00173可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)PCOS GCs自噬，參與PCOS的發(fā)生及發(fā)展，進(jìn)而影響卵巢功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的建立。然而，LINC00173調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

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（2024-04-28收稿 2024-06-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）